Summary
Her beskriver vi en protokol for at udtrykke proteiner i protoplasts ved hjælp af PEG-medieret transformation metode. Metoden giver nem udtryk af proteiner af interesse og effektiv undersøgelse af protein lokalisering og importprocessen for forskellige eksperimentelle betingelser in vivo.
Abstract
Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en afgørende organelle, der er ansvarlig for forskellige cellulære processer i planter, såsom fotosyntese og produktion af mange sekundære metabolitter og lipider. Kloroplaster kræver et stort antal proteiner for disse forskellige fysiologiske processer. Over er 95% af grønkorn proteiner kernen-kodet og importerede i grønkornene fra cytosol efter oversættelse på cytosole ribosomer. Således, den rette import- eller målretning af disse kerne-kodet grønkorn proteiner til kloroplaster er afgørende for et velfungerende grønkorn samt plante celle. Nucleus-kodet grønkorn proteiner indeholder signal sekvenser for specifikke målretning til grønkorn. Molekylære maskineri lokaliseret til grønkorn eller cytosol genkende disse signaler og udføre importprocessen. For at undersøge mekanismerne af protein import eller målretning til kloroplaster i vivo, udviklede vi en hurtig, effektiv protoplast-baseret metode til at analysere protein import til kloroplaster i Arabidopsis. I denne metode bruger vi protoplasts isoleret fra blad væv i Arabidopsis. Her give vi en detaljeret protokol for at bruge protoplasts til at efterforske den mekanisme, hvormed proteiner er importeret til grønkorn.
Introduction
Chlorplasttransitpeptidsekvensen er en af de vigtigste organeller i planter. En af de vigtigste funktioner i kloroplaster er at foretage fotosyntese1. Kloroplaster også udføre mange andre biokemiske reaktioner for produktionen af fedtsyrer, aminosyrer, nukleotider og talrige sekundære metabolitter1,2. For alle disse reaktioner kræver grønkorn et stort antal forskellige typer af proteiner. Grønkorn genom indeholder imidlertid kun ca. 100 gener3,4. Derfor skal grønkorn importere størstedelen af deres proteiner fra cytosol. Faktisk var de fleste grønkorn proteiner vist skal importeres fra cytosol efter oversættelse4,5,6. Planteceller kræver særlige mekanismer til at importere proteiner fra cytosol til grønkorn. Men selv om disse protein import mekanismer er blevet undersøgt for de sidste mange årtier, vi stadig fuldt ud forstår dem ikke på molekylært niveau. Her give vi en detaljeret metode til at forberede protoplasts og eksogent giver udtryk for gener i protoplasts. Denne metode kunne være værdifuld for belyse de molekylære mekanismer bag protein import til kloroplaster i detaljer.
Protein import kan studeres ved hjælp af mange forskellige tilgange. En af disse metoder indebærer anvendelse af en in vitro- protein import system7,8. Ved hjælp af denne fremgangsmåde i vitro-oversatte protein prækursorer inkuberes med renset kloroplaster i in vitro, og protein import er analyseret af SDS-PAGE efterfulgt af western blot analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at hvert trin af protein import i grønkornene kan studeres i detaljer. Således, denne metode har været meget anvendt til at definere komponenter af protein import molekylære maskineri og dissekere sekvens information til transit peptider. For nylig, en anden tilgang, der involverer brugen af protoplasts fra blad væv blev udviklet og det er blevet udbredt at studere protein import til grønkorn9,10. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at protoplasts giver en cellulære miljø, der er tættere på intakt celler end in vitro -system. Således tillader protoplast systemet os at løse mange flere aspekter af denne proces, som de tilknyttede cytosole begivenheder og hvordan specificitet målretning signaler bestemmes. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for brug af protoplasts til at undersøge protein import i grønkornene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vækst i Arabidopsis planter
- Forberede 1 L Gamborg B5 (B5) medium ved at tilføje 3,2 g B5 medium herunder vitaminer, 20 g saccharose, 0,5 g 2-(N-morpholino) Ethan ethylbenzthiazolinsulfonsyre syre (MES) til ca. 800 mL deioniseret vand, og ph indstilles til 5.7 med kaliumhydroxid (KOH). Tilføj mere deioniseret vand bringe den samlede mængde til 1 L. tilføje 8 g phytoagar og autoklave i 15 min ved 121 ° C.
- Tillad medium til at køle ned til 55 ° C og hæld 20 – 25 mL af B5 medium i en petriskål (9 cm i diameter, 1,5 cm i højden) på en ren bænk. Tørre plader i 2-3 dage, pakke dem med ren wrap, og holde dem i køleskab indtil brug.
- Sterilisere Arabidopsis thaliana frø med 1 mL af 70% (v/v) ethanol i et centrifugeglas (e-rør) ved kontinuerligt at ryste for 2-3 min. Fjern supernatanten, tilsættes 1 mL 1% (v/v) natriumhypochlorit og ryste uafbrudt i 2-3 min. forberede 100 – 150 frø pr. petriskål.
- Fjerne analysere og vask frøene med 1 mL destilleret vand. Gentag dette trin 4 x. Placer de steriliseret frø ved 4 ° C i 3 dage for at synkronisere frø spiring.
- 100-150 frø på B5 plader ved hjælp af en mikropipette og forsegle pladen med kirurgisk tape.
- Dyrke planter i en vækst værelse med en 16 h/8 h lys/mørke cyklus på 100 µmol·m-2·s-1 lysintensitet, 70% relativ luftfugtighed og 20 ° C temperatur i 2 uger.
2. fremstilling af plasmidet
Bemærk: Høj renhed plasmider bør bruges til transformering; en kommerciel plasmid rensning kit anbefales.
- Rense plasmidet (RBC-nt:GFP) ved hjælp af en DNA isolering kit. For at koncentrere DNA, udføre ethanol nedbør i 1,5 mL rør og opløse DNA pellet i 100 µL af destilleret vand. Bestemme koncentrationen af plasmid bruger et spektrofotometer på 260 nm. Fortynd plasmid til en endelig koncentration på ~ 2 µg / µL. holde plasmidet ved-20 ° C indtil brug.
3. isolering af Protoplasts
- Forberede følgende løsninger.
- Forberede enzym løsning indeholder 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM calciumchlorid (CaCl2), 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), og 5 mM MES. PH indstilles til 5.6 med KOH.
- Filtrer enzym løsning ved hjælp af en celluloseacetat filterenhed med en 0,45 μm porestørrelse. Alikvot 25 mL af enzymet i 50 mL koniske rør og holde ved-20 ° C. Tø enzym løsning ved stuetemperatur (RT) og bland godt lige før brug.
- Fremstilles en 21% (w/v) opløsning af saccharose ved at opløse 21 g saccharose i 100 mL deioniseret vand og autoklave løsningen.
- Forberede W5 løsning skal indeholde 154 mM natriumchlorid (NaCl), 125 mM CaCl2, 5 mM kaliumchlorid (KCl), 5 mM glukose og 1,5 mM MES. PH indstilles til 5.6 med KOH og autoklave løsningen.
- Forberede MaMg løsning indeholder 400 mM D-mannitol, 15 mM magnesiumchlorid (MgCl2), og 5 mM MES. PH indstilles til 5.6 med KOH og autoklave løsningen.
- Forberede 1 M D-mannitol og 1 M calciumnitrat stamopløsninger at gøre PIND løsning. Autoklave disse løsninger.
- Forberede enzym løsning indeholder 0,25% (w/v) macerozyme, 1,0% (w/v) cellulase, 400 mM D-mannitol, 8 mM calciumchlorid (CaCl2), 0,1% (w/v) bovint serumalbumin (BSA), og 5 mM MES. PH indstilles til 5.6 med KOH.
- Høste intakt blad væv fra 2 uger gamle planter fra ~ 1 – 2 B5 plader ved hjælp af kirurgiske kniv og sted de høstede blade i en 50 mL konisk rør indeholdende 25 mL af enzymet løsning. Placer den koniske rør indeholdende enzym løsning og blad væv vandret på en orbitalryster med blid agitation i mørke. Det tager 8 – 12 h for fuld fordøjelsen af blad væv.
- På 8-12 timer efter inkubation, hæld opløsningen enzym (indeholdende protoplasts frigivet fra blad væv) i en frisk petriskål gennem en maske med 140 µm porestørrelse. Omhyggeligt lag protoplast-holdige enzym opklaring oven på 15 mL af 21% (w/v) rørsukkeropløsning og centrifugeres ved 98 x g i 10 min. med de laveste acceleration og deceleration indstillinger i en svinge spanden rotor.
- Overføre ved hjælp af Pasteur pipette, omhyggeligt protoplasts fra det øvre-mest lag (enzym løsning) og ved grænsefladen mellem enzym løsning og rørsukkeropløsning til en 50 mL konisk tube indeholder 30 mL af W5 løsning. Der centrifugeres dette rør på 51 x g for 6 min. På nuværende tidspunkt bliver protoplasts pellet i bunden af den koniske rør.
- Supernatanten omhyggeligt ved hjælp af en pipette uden at forstyrre protoplasts pellet. Tilsættes 25 mL W5, og forsigtigt resuspend protoplasts. Inkubér protoplast løsning i 4 ° C køleskab i mindst 1 time til stabilisering.
4. protoplast Transformation ved hjælp af polyethylen Glycol
- Forberede en 40% PLØK løsning ved at tilføje 4 g PLØK 8000, 4 mL 1 M mannitol opløsning, 1 mL 1 M Ca (3)2og 1,8 mL destilleret vand i en 50 mL konisk slange og bland godt. Opløses PIND ved opvarmning i en mikrobølgeovn ovn i 20-30 s. sted 40% PIND løsning på RT for nedkøling.
Bemærk: De 40% PIND opløsning bør tilberedes frisk hver gang. Hvis protoplasts ikke er pelleted helt under 4 ° C inkubation i køleskabet, centrifugeres materiale på 46 x g i 2 min. - Fjern supernatanten omhyggeligt men helt og tilføje MaMg løsning til protoplast pellet at give koncentrationen af 5 x 106/mL.
Bemærk: Antallet af protoplast kan bestemmes ved en hemocytometer set under et mikroskop. - Sted 10 µg af plasmid DNA hver tomme 13 mL runde-nederste rør og tilsæt 300 µL af protoplast løsning ved hjælp af en pipette.
Bemærk: Slutningen af pipette tip skal skæres. Når protoplasts er udtaget prøver af, bør den protoplast-holdige løsning genopslemmes lige før pipettering således at det samme antal protoplasts er tilføjet til hver tube. - Bland plasmid DNA med protoplasts af forsigtigt roterende rør og straks tilføje 300 µL af 40% PIND løsning ved hjælp af en pipette. Bland forsigtigt men helt ved at dreje rør og Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur; vippe røret næsten vandret og rotere det flere gange.
- Tilsættes 1 mL W5 og bland forsigtigt men helt ved at dreje røret i hånden på en lignende måde. Inkuber prøve i 10 min ved stuetemperatur.
- Gentag dette trin to gange mere med 1,5 mL og 2 mL af W5 løsning, hhv. Inkuber i 30 min efter sidste tilsætning af W5 løsning.
- Der centrifugeres ved 46 x g i 4 min. Fjern supernatanten og tilsættes 2 mL W5. Bland forsigtigt men helt. Der inkuberes ved 22 ° C i et mørkt kammer.
5. analyse af Protein indfoersel til grønkorn
Bemærk: Efter PIND-medieret transformation af protoplasts, inkubation tid varierer fra 8 til 24 h.
-
Fluorescens mikroskopi
- Sted 10 µL af protoplast løsningen på et dias glas ved hjælp af en pipette med en trimmet spids og omhyggeligt dække med en coverslip til at undgå at beskadige protoplasts.
- Sted diaset på scenen af et fluorescens mikroskop udstyret med excitation/emission filter sæt til observere grøn fluorescerende proteiner (normal god landbrugspraksis) og klorofyl auto-fluorescens.
- Capture billeder med en afkølet charge - sammen enhed (CCD) kamera og proces billeder ved hjælp af et billedredigeringsprogram software til at producere pseudo farvebilleder.
-
Total Protein udvinding og Immunoblotting
- Forberede denaturering buffer der indeholder 2,5% (w/v) sodium dodecylsulfate (SDS) og 2% (v/v) 2-mercaptoethanol.
Bemærk: Protein import til grønkorn kan kvantificeres ved at måle graden af transit peptid behandling via immunblot analyse ved hjælp af anti-normal god landbrugspraksis antistof. - Overfør protoplasts til et centrifugeglas, og der centrifugeres på 46 x g i 4 min.
- Fjern supernatanten og tilsættes 80 µL af denaturering buffer. Energisk vortex for 5 s og tilføje 5 x SDS prøvebuffer (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DTT, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) Bromophenol blå, og 50% (v/v) glycerol). Bland godt og kog i 10 min.
- Underlagt dette protein eksempel standard SDS-PAGE og immunoblotting med anti-normal god landbrugspraksis antistof.
- Forberede denaturering buffer der indeholder 2,5% (w/v) sodium dodecylsulfate (SDS) og 2% (v/v) 2-mercaptoethanol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Import af proteiner i grønkornene kan undersøges ved hjælp af to metoder: Fluorescens mikroskopi og immunblot analyse efter SDS-side-medieret adskillelse. Her, vi brugte RBC-nt:GFP, en fusion konstruere kodning de 79 N-terminale aminosyrerester af røde blodlegemer indeholder transit-peptid smeltet til normal god landbrugspraksis. Når proteiner der importeres til grønkorn, grønne fluorescens signaler fra target proteinet RBC-nt:GFP skal fusionere med de røde fluorescerende signaler fra klorofyl auto-fluorescens, som undersøges af Fluorescens mikroskopi (figur 1). Den tæt overlapning mellem de to signaler angiver protein import i grønkornene. Ofte normal god landbrugspraksis signaler er spredt over hele grønkornene eller er koncentreret i midten af grønkorn, med svagt diffuse signaler i hele grønkorn, afhængigt af den enkelte protein. Import af proteiner kan bekræftes ved immunblot analyse ved hjælp af normal god landbrugspraksis antistof. Samlede proteiner er fremstillet af protoplasts og adskilt af SDS-PAGE efterfulgt af Western blot analyse (figur 2). I de fleste tilfælde to protein bands bør overholdes i immunblot hvis et protein var behørigt indført grønkorn: det øverste bandet svarer til fuld længde forstadiet og lavere bandet til forarbejdet form efter import i grønkornene. Mængden af forarbejdet form af protein bør øge på en tidsafhængig måde. Disse resultater vil indebære at protein RBC-nt:GFP importeres til kloroplaster i Arabidopsis protoplasts. Desuden kan forholdet mellem den forarbejdet form til det samlede beløb af udtrykte proteiner (forarbejdet form plus forløber) bruges som en målestok for import effektivitet. Hvis det er nødvendigt, grønkornene kan blive renset fra forsigtigt mængden protoplasts, og proteiner fra grønkorn brøkdel kan analyseres ved western blotting for at yderligere bekræfte import af proteiner i grønkornene.
Figur 1. In vivo lokalisering af normal god landbrugspraksis smeltet til RBC transit peptid til grønkorn.
Billeder blev taget 18 h efter transformation under et fluorescens mikroskop. Grøn (en), rød (b), flettede (c) og lyse (d) etiketter angiver normal god landbrugspraksis billede, klorofyl billede, flettede billede af de to signaler og lysfelt billede, henholdsvis. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Western blot analyse af RBC-nt:GFP til at undersøge protein import i grønkornene.
Total protein ekstrakter blev fremstillet af protoplasts og adskilt af 10% (w/v) SDS-PAGE, efterfulgt af western blot analyse ved hjælp af anti-normal god landbrugspraksis antistof. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi givet en detaljeret protokol for brug af protoplasts i Arabidopsis at studere protein import i grønkornene. Denne metode er stærk til at undersøge protein importprocessen. Denne enkle, alsidige teknik er nyttig for behandlingen af målretning af de påtænkte cargo proteiner til grønkorn. Du bruger denne metode, er protoplasts fremstillet af blad væv i Arabidopsis11,12 , som kan fås fra planter på mange forskellige vækststadierne spænder fra meget tidligt at fuldt modne blade. Dog skal udvises forsigtighed, ved voksende planter, som anvendes til protoplast forberedelse. Man bør bruge meget sunde planter, som protoplasts forberedt fra sunde planter kan modstå de mange trin i PIND-medieret transformation. En anden vigtig sikkerhedsforanstaltning er at bruge frisk løsninger. Små ændringer i koncentrationerne af løsningerne, der kan meget skade protoplasts, da de er skrøbelig og meget følsom over for osmotisk tryk.
Vi har brugt protoplasts til at undersøge protein import til grønkorn9,13,14. Baseret på disse undersøgelser, var vi i stand til at dissekere sekvens motiver i forskellige transit peptider. Hertil kommer, vi brugte protoplasts til at identificere de målretning signaler (positivt ladede regionen flankerende C-terminus af domænet transmembrane) af proteiner målrettet til kuvert membran grønkorn15. Ligeledes, vi brugte protoplasts til at undersøge protein import til mitokondrier10. Igen, vi var i stand til at identificere mange kritiske sekvens motiver i presequences af mitokondrielle proteiner. De ydre Membranproteiner af mitokondrier indeholder derudover også et positivt ladede region flankerer den transmembrane domæne som deres målretning signal15. Disse målretning signaler deler en høj grad af lighed i aminosyresammensætning. Faktisk, grønkorn proteiner var mistargeted til mitokondrier under in vitro- import eksperimenter16. Grønkorn og mitokondrielle proteiner er dog specielt importeret til deres mål organeller in vivo. Således kan protoplasts bruges til at belyse de mekanismer, der ligger til grund for hvordan målretning specificitet afgøres mellem grønkornene og mitokondrierne.
Protoplasts repræsenterer et ideelt system til at analysere import af proteiner i grønkornene i vivo. En advarsel er dog, at protoplasts kan være under stærkt stress tilstande såsom såret stress. Dermed, vi kan ikke udelukke, at sådanne stress kan påvirke importprocessen. Således i visse tilfælde skal resultaterne fortolkes med forsigtighed når protoplasts anvendes til protein import eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført med støtter af Cooperative Research Program for landbrug videnskab og teknologiudvikling (projekt nr. PJ010953012018), landdistrikternes udvikling Administration og National Research Foundation (Korea) tilskud finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (nr. 2016R1E1A1A02922014), Sydkorea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
