Summary
هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.
Abstract
بلاستيدات الخضراء هو عضية أساسية المسؤولة عن مختلف العمليات الخلوية في النباتات، مثل عملية التمثيل الضوئي وإنتاج العديد من نواتج الأيض الثانوية والدهون. المعايشة تتطلب عددا كبيرا من البروتينات لهذه العمليات الفسيولوجية المختلفة. أكثر من 95% بروتينات بلاستيدات الخضراء من ترميز نواة واستيرادها في الجبيلة من سيتوسول بعد الترجمة في ريبوسوم سيتوسوليك. وهكذا، استيراد السليم أو استهداف هذه البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء للمعايشة أمر أساسي للأداء السليم للمعايشة، فضلا عن الخلية النباتية. البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء تحتوي على تسلسلات إشارة لاستهداف محددة للمعايشة. الآلات الجزيئية مترجمة إلى بلاستيدات الخضراء أو سيتوسول تعترف بهذه الإشارات، والقيام بعملية الاستيراد. للتحقيق في آليات الاستيراد البروتين أو استهداف للمعايشة في فيفو، قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى جبلة مجردة سريعة وفعالة لتحليل البروتين استيراد المعايشة لنبات. في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم بروتوبلاستس المعزولة من أنسجة أوراق نبات. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس للتحقيق في الآلية التي يتم استيرادها البروتينات إلى المعايشة.
Introduction
بلاستيدات الخضراء واحدة من العضيات الأكثر أهمية في النباتات. واحدة من المهام الرئيسية للمعايشة القيام بعملية التمثيل الضوئي1. الجبيلة أيضا الاضطلاع بكثير من التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى لإنتاج الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية، النيوكليوتيدات ونواتج الأيض الثانوية العديدة1،2. لكل ردود الفعل هذه، تتطلب المعايشة عدد كبير من أنواع مختلفة من البروتينات. ومع ذلك، يتضمن الجينوم بلاستيدات الخضراء الجينات فقط حوالي 1003،4. ولذلك، يجب استيراد المعايشة غالبية البروتينات على من سيتوسول. في الواقع، قد أظهرت معظم بلاستيدات الخضراء البروتينات يتم استيراده من سيتوسول بعد الترجمة4،،من56. الخلايا النباتية تتطلب آليات محددة لاستيراد البروتينات من سيتوسول للمعايشة. ومع ذلك، على الرغم من أن هذه الآليات استيراد البروتين حققت على مدى عدة عقود، نحن لا تزال لا يفهمون تماما لهم على المستوى الجزيئي. هنا، نحن نقدم طريقة مفصلة لإعداد بروتوبلاستس ومناشئ التعبير عن الجينات في بروتوبلاستس. هذا الأسلوب يمكن أن يكون قيماً لتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء استيراد البروتين المعايشة بالتفصيل.
يمكن دراسة البروتين الاستيراد باستخدام نهج مختلفة كثيرة. أحد هذه الأساليب ينطوي على استخدام في المختبر البروتين استيراد نظام7،8. باستخدام هذا النهج، في المختبر-السلائف البروتين المترجمة هي المحتضنة مع المعايشة المنقاة في المختبر، ويتم تحليل البروتين الاستيراد من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تحليل لطخة غربية. وميزة هذا النهج أن كل خطوة من البروتين الاستيراد إلى المعايشة يمكن دراستها بالتفصيل. وهكذا، هذه الطريقة قد استخدمت على نطاق واسع لتحديد مكونات البروتين استيراد الأجهزة الجزيئية وتشريح معلومات تسلسل للعبور الببتيدات. في الآونة الأخيرة، تم وضع نهج آخر ينطوي على استخدام بروتوبلاستس من أنسجة نبات وأنها أصبحت تستخدم على نطاق واسع لدراسة البروتين استيراد الجبيلة9،10. وميزة هذا النهج هو أن بروتوبلاستس توفر بيئة خلوية التي أقرب إلى خلايا سليمة من النظام في المختبر . وبالتالي، النظام جبلة مجردة يسمح لنا بمعالجة العديد من جوانب هذه العملية، مثل أحداث سيتوسوليك المرتبطة بها وكيفية تحديد خصوصية استهداف إشارات إضافية. نقدم هنا، بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس لدراسة البروتين استيراد المعايشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-نمو النباتات نبات
- تحضير 1 لتر جامبورج B5 المتوسطة (B5) عن طريق إضافة ز 3.2 من B5 المتوسطة بما في ذلك الفيتامينات، 20 غراما من السكروز 0.5 غرام من حامض السلفونيك الإيثان 2-(N-morpholino) (MES) لحوالي 800 مل مياه، وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). جلب المياه إضافة منزوع أكثر الحجم الإجمالي إلى 1 ز 8 إضافة ل. فيتواجار والاوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية.
- تسمح على المديين المتوسط وباردة وصولاً إلى 55 درجة مئوية وتصب 20 – 25 مل الوسط B5 في طبق بتري (9 سم في القطر، 1.5 سم في الطول) في هيئة نظيفة. لوحات جافة لمدة 2-3 أيام، حزمة لهم مع التفاف نظيفة، والاحتفاظ بها في ثلاجة حتى الاستخدام.
- التمويل نبات تعقيم البذور مع 1 مل إيثانول 70% (v/v) في أنبوب الطرد مركزي (e-أنبوب) التي تهز بشكل مستمر للحد الأدنى من 2-3 إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل محلول هيبوكلوريت الصوديوم 1% (v/v)، واهتز بشكل مستمر للحد الأدنى 2-3 إعداد 100 – البذور 150 لكل طبق بيتري.
- إزالة في supernatants وتغسل البذور مع 1 مل ماء المقطر. كرر هذه الخطوة 4 x. وضع بذور معقمة في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام لمزامنة إنبات البذور.
- زرع بذور 100-150 على لوحات B5 استخدام ميكروبيبيتي وختم اللوحة مع الشريط الجراحي.
- زراعة النباتات في غرفة نمو مع دورة ضوء/الظلام ح 16/8 ح في 100 µmol·m ·s-2-1 شدة الضوء والرطوبة النسبية 70% ودرجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة أسبوعين.
2-إعداد بلازميد
ملاحظة: يجب استخدام والبلازميدات عالية النقاء للتحويل؛ ينصح باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد التجارية.
- نق بلازميد (كرات الدم الحمراء-nt:GFP) باستخدام مجموعة عزل الحمض النووي. تركيز الحمض النووي، تؤدي الأمطار الإيثانول في أنبوب 1.5 مل وحل بيليه الحمض النووي في 100 ميليلتر من الماء المقطر. تحديد تركيز بلازميد استخدام جهاز المطياف الضوئي في 260 نيوتن متر. بلازميد إلى تركيز نهائي لتمييع ~ 2 ميكروغرام/ميليلتر. الحفاظ بلازميد في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-عزل بروتوبلاستس
- إعداد الحلول التالية.
- إعداد حل الإنزيم تحتوي على ماسيروزيمي 0.25% (w/v)، سيلولاسي 1، 0% (w/v)، 400 ملم د-المانيتول، كلوريد الكالسيوم 8 مم (كاكل2)، 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA)، و 5 ملم مس. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.6 مع كوه.
- تصفية الإنزيم الحل باستخدام وحدة تصفية خلات السليولوز مع حجم مسام 0.45 ميكرومتر. الكوة 25 مل الحل الإنزيم إلى أنابيب مخروطية 50 مل وتبقى عند-20 درجة مئوية. ذوبان الجليد الحل الإنزيم في درجة حرارة الغرفة (RT) وتخلط جيدا قبل الاستخدام.
- تحضير حل سكروز 21% (w/v) بتذويب ز 21 السكروز في 100 مل من المياه والاوتوكلاف الحل.
- إعداد الحل W5 تحتوي على 154 مم كلوريد الصوديوم (NaCl)، 125 كاكل2، 5 مم من كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، الجلوكوز 5 مم، و 1.5 ملم مس. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.6 مع كوه والاوتوكلاف الحل.
- إعداد حل مامج تحتوي على 400 ملم د-المانيتول، كلوريد الماغنسيوم 15 ملم (MgCl2)، و 5 ملم مس. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.6 مع كوه والاوتوكلاف الحل.
- تحضير 1 م د-المانيتول م 1 نترات الكالسيوم المخزون الحلول وجعل الحل الوتد. اﻷوتوكﻻف هذه الحلول.
- إعداد حل الإنزيم تحتوي على ماسيروزيمي 0.25% (w/v)، سيلولاسي 1، 0% (w/v)، 400 ملم د-المانيتول، كلوريد الكالسيوم 8 مم (كاكل2)، 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري (BSA)، و 5 ملم مس. قم بضبط درجة الحموضة إلى 5.6 مع كوه.
- حصاد أنسجة أوراق سليمة من 2 أسابيع من العمر النباتات من ~ لوحات B5 1 – 2 باستخدام سكين جراحية ومكان يترك المقطوع في 50 مل مخروطية الأنبوبة المحتوية على 25 مل من إنزيم الحل. ضع الأنبوبة المخروطية التي تحتوي على أنسجة الحل وأوراق إنزيم أفقياً على شاكر روتاري مع الانفعالات لطيف في الظلام. فإنه يأخذ ح 8 – 12 لهضم أنسجة نبات كامل.
- في 8 – 12 ساعة بعد الحضانة، صب الحل إنزيم (التي تحتوي على بروتوبلاستس صدر من أنسجة نبات) في طبق بتري طازجة من خلال شبكة مع حجم المسام ميكرومتر 140. طبقة الحل إنزيم جبلة مجردة المحتوية على رأس 15 مل محلول السكروز 21% (w/v) والطرد المركزي أنه في 98 ز x لمدة 10 دقائق مع أدنى الإعدادات التسارع والتباطؤ في دوار يتأرجح دلو بعناية.
- استخدام ماصة باستور، بعناية نقل بروتوبلاستس من الطبقة العليا-معظم (الإنزيم الحل) وفي الواجهة بين حل الإنزيم ومحلول السكروز إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 30 مل من محلول W5. الطرد المركزي هذا الأنبوب في 51 x ز لمدة 6 دقائق. في هذه المرحلة، سيكون بروتوبلاستس في بيليه في الجزء السفلي من الأنبوبة المخروطية.
- تجاهل المادة طافية بعناية باستخدام ماصة دون إزعاج بيليه بروتوبلاستس. إضافة 25 مل من محلول W5 ومن ريسوسبيند بروتوبلاستس برفق. احتضان الحل جبلة مجردة في ثلاجة 4 درجات مئوية على الأقل 1 ح لتحقيق الاستقرار.
4-جبلة مجردة التحول باستخدام البولي إيثيلين غليكول
- إعداد 40% ربط الحل بإضافة 4 غرام من 8000 ربط 4 مل من محلول المانيتول م 1، 1 مل من Ca (لا3) 1 م2و 1.8 مل من الماء المقطر في أنبوب 50 مل مخروطية ومزيج جيد. حل شماعة بالتدفئة في فرن ميكروويف لمكان س. 20 – 30 40% الحل شماعة على RT للتهدئة.
ملاحظة: 40% الحل شماعة ينبغي إعداد طازجة كل الوقت. إذا لم يتم القريبون بروتوبلاستس تماما أثناء الاحتضان 4 درجات مئوية في الثلاجة، الطرد المركزي المادة في 46 س ز 2 دقيقة. - إزالة المادة طافية بعناية ولكن تماما وإضافة الحل مامج بيليه جبلة مجردة تسفر عن تركيز 5 × 106/mL.
ملاحظة: يمكن تحديد عدد جبلة مجردة من هيموسيتوميتير عرضها تحت مجهر. - المكان 10 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي كل مل 13 فارغة الجولة-أسفل الأنبوبة وإضافة 300 ميليلتر من الحل جبلة مجردة باستخدام ماصة.
ملاحظة: يجب قطع نهاية طرف ماصة. كلما يتم أخذ عينات بروتوبلاستس، ينبغي حراكه حل الذي يحتوي على جبلة مجردة الحق قبل بيبيتينج حتى أن نفس العدد من بروتوبلاستس يضاف إلى كل أنبوب. - مزيج بلازميد الحمض النووي مع بروتوبلاستس بالتناوب بلطف الأنابيب وفورا إضافة 300 ميليلتر من 40% شماعة الحل باستخدام ماصة. المزيج بلطف ولكن تماما بتدوير أنابيب واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة؛ إمالة الأنبوب تقريبا أفقياً وتناوب عليه عدة مرات.
- أضف 1 مل من محلول W5 وتخلط بلطف ولكن تماما بتدوير الأنبوبة باليد بطريقة مماثلة. احتضان العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- كرر هذه الخطوة مرتين استخدام أكثر 1.5 مل و 2 مل من محلول W5، على التوالي. احتضان لمدة 30 دقيقة بعد إضافة W5 الحل النهائي.
- الطرد المركزي في 46 س ز لدقيقة 4 تجاهل المادة طافية وإضافة 2 مل من محلول W5. المزيج بلطف ولكن تماما. احتضان عند 22 درجة مئوية في غرفة مظلمة.
5-تحليل لاستيراد المعايشة البروتين
ملاحظة: بعد وساطة شماعة تحول بروتوبلاستس، حضانة وقت يتراوح من 8 إلى 24 ساعة.
-
مجهر الأسفار
- تغطية مكان 10 ميليلتر من الحل جبلة مجردة على زجاج شريحة استخدام ماصة مع تلميح المشذبة وعناية مع ساترة لتجنب إتلاف في بروتوبلاستس.
- يحدد مكان الشريحة في مرحلة مجهر الأسفار مزودة بتصفية الإثارة/الانبعاثات لمراقبة البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) والكلوروفيل السيارات-الأسفار.
- التقاط الصور مع صور الكاميرا وعملية تبريد جهاز اقتران (CCD) استخدام برامج تحرير الصور لإنتاج الصور الملونة الزائفة.
-
استخراج البروتين الكلي وإيمونوبلوتينج
- إعداد تمسخ المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.5% (w/v) الصوديوم دوديسيلسولفاتي (الحزب الديمقراطي الصربي)، و 2% (v/v) 2-ميركابتوثانول.
ملاحظة: يمكن تحديده كمياً استيراد البروتين المعايشة بقياس درجة الببتيد العابر المعالجة عن طريق تحليل إيمونوبلوت باستخدام الأجسام المضادة-التجارة والنقل. - نقل بروتوبلاستس إلى أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 46 س ز لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية، وإضافة 80 ميليلتر من تمسخ المخزن المؤقت. قوة دوامة ل 5 ق وإضافة 5 × العازلة عينة الحزب الديمقراطي الصربي (250 ملم تريس-Cl (الرقم الهيدروجيني 6.8) 0.5 م DTT، 10% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي, 0.05% (w/v) بروموفينول الأزرق ووالغليسيرول 50% (v/v)). يخلط جيدا وتغلي لمدة 10 دقائق.
- تخضع هذه العينة البروتين القياسية صفحة الحزب الديمقراطي الصربي وإيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة-التجارة والنقل.
- إعداد تمسخ المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.5% (w/v) الصوديوم دوديسيلسولفاتي (الحزب الديمقراطي الصربي)، و 2% (v/v) 2-ميركابتوثانول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن فحص استيراد البروتينات إلى المعايشة باستخدام نهجين اثنين: التحليل المجهري و immunoblot الأسفار بعد فصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة-بوساطة. وهنا استخدمنا كرات الدم الحمراء-nt:GFP، بناء انصهار ترميز مخلفات الأحماض الأمينية الطرفي ن 79 من كرات الدم الحمراء المحتوية على الببتيد العبور للتجارة والنقل. عندما يتم استيراد البروتينات إلى المعايشة، ومضان أخضر إشارات من البروتين المستهدف كرات الدم الحمراء-ينبغي دمج nt:GFP مع إشارات الفلورسنت الأحمر من الكلوروفيل السيارات-الأسفار، كما درست بالأسفار مجهرية (الشكل 1). التداخل الوثيق من إشارات اثنين يشير إلى استيراد البروتين المعايشة. غالباً ما تنتشر في جميع أنحاء المعايشة إشارات بروتينات فلورية خضراء أو تتركز في مركز الجبيلة، مع إشارات ضعيفة منتشر في جميع أنحاء المعايشة، اعتماداً على البروتين الفردية. يمكن تأكيد استيراد البروتينات بتحليل إيمونوبلوت باستخدام الأجسام المضادة بروتينات فلورية خضراء. مجموع البروتينات تعد من بروتوبلاستس وفصل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تليها تحليل لطخة غربية (الشكل 2). في معظم الحالات، ينبغي مراعاة شريطين البروتين في إيمونوبلوت إذا بروتين تم استيرادها بشكل صحيح في الجبيلة: الفرقة العلوية يناظر السلائف كاملة الطول والشريط السفلي للنموذج المجهزة بعد استيراد المعايشة. وينبغي زيادة مقدار النموذج المجهزة من البروتين بطريقة تعتمد على الوقت. مثل هذه النتائج سوف يعني أن البروتين كرات الدم الحمراء-nt:GFP يتم استيرادها إلى المعايشة في نبات بروتوبلاستس. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام النسبة النموذج المجهزة للمبلغ الإجمالي للبروتينات المعرب عنها (في شكل المجهزة بالإضافة إلى السلائف) كمقياس لكفاءة الاستيراد. إذا لزم الأمر، يمكن تنقيته المعايشة من تفكيك برفق بروتوبلاستس، ويمكن أن تحلل البروتينات من الكسر بلاستيدات الخضراء من النشاف الغربية مزيد تأكيد استيراد البروتينات في الجبيلة.
الشكل 1. تنصهر في فيفو التعريب للتجارة والنقل لكرات الدم الحمراء الببتيد العابر للمعايشة.
تم أخذ صور ح 18 بعد التحول تحت مجهر الأسفار. الأخضر () والأحمر (ب) والمدمجة (ج) وتسميات مشرق (د) تشير إلى صورة بروتينات فلورية خضراء والصورة الكلوروفيل، والصورة المدمجة من إشارات اثنين وصورة مشرقة الميدانية، على التوالي. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. تحليل لطخة غربية لكرات الدم الحمراء-nt:GFP للتحقيق في استيراد البروتين المعايشة.
مقتطفات مجموع البروتين وأعدت من بروتوبلاستس ومفصولة عن 10% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، يليها تحليل لطخة غربية باستخدام الأجسام المضادة-التجارة والنقل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قدمنا بروتوكول مفصلاً لاستخدام بروتوبلاستس نبات لدراسة البروتين استيراد المعايشة. هذا الأسلوب قوية للتحقيق في عملية الاستيراد البروتين. هذا الأسلوب البسيط، تنوعاً مفيد لدراسة استهداف البروتينات البضائع المقصود للمعايشة. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إعداد بروتوبلاستس من أنسجة أوراق نبات11،12 يمكن الحصول عليه من مصانع في العديد من مراحل النمو المختلفة بدءاً من وقت مبكر جداً أن يترك ناضجة تماما. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند زراعة النباتات المستخدمة لإعداد جبلة مجردة. يجب استخدام أحد منشآت صحية للغاية، كما بروتوبلاستس إعداد من النباتات صحية يمكن أن تحمل العديد من الخطوات المضمنة في التحول بوساطة شماعة. وقائي هام آخر استخدام حلول جديدة. تغييرات طفيفة في التركيزات الحلول التي يمكن أن تضر ضررا كبيرا في بروتوبلاستس، نظراً لأنها هشة وحساسة جداً للضغط الاسموزي.
وكنا نستخدم بروتوبلاستس لدراسة البروتين استيراد الجبيلة9،،من1314. وبناء على هذه الدراسات، كنا قادرين على تشريح زخارف التسلسل في مختلف بلدان المرور العابر الببتيدات. وباﻹضافة إلى ذلك، كنا بروتوبلاستس لتحديد إشارات الاستهداف (منطقة مشحونة إيجابيا المرافقة ج-المحطة في المجال ترانسميمبراني) من البروتينات المستهدفة للغشاء الخارجي المغلف ل بلاستيدات الخضراء15. وبالمثل، كنا بروتوبلاستس للتحقيق في استيراد البروتين الميتوكوندريا10. ومرة أخرى، كنا قادرين على تحديد العديد من زخارف تسلسل الحاسمة في بريسيقوينسيس البروتينات المتقدرية. وبالإضافة إلى ذلك، تحتوي أيضا على منطقة مشحونة إيجابيا المرافقة المجال transmembrane كإشارة الاستهداف في15البروتينات الغشاء الخارجي من الميتوكوندريا. حصة هذه الإشارات الاستهداف على درجة عالية من التشابه في تكوين الأحماض الأمينية. وفي الواقع، كانت البروتينات بلاستيدات الخضراء إلى الميتوكوندريا أثناء استيراد تجارب16 في المختبر . ومع ذلك، بلاستيدات الخضراء والبروتينات المتقدرية يتم استيرادها على وجه التحديد إلى بهم العضيات الهدف فيفو. وهكذا، يمكن استخدام بروتوبلاستس توضيح الآليات الكامنة وراء كيفية استهداف خصوصية يتحدد بين الجبيلة والميتوكوندريا.
وتمثل بروتوبلاستس نظام مثالي لتحليل عملية استيراد البروتينات في الجبيلة في فيفو. ومع ذلك، أحد المحاذير أن بروتوبلاستس تحت ظروف الإجهاد قوية مثل إصابة الإجهاد. وبالتالي، لا يمكننا استبعاد إمكانية أن مثل هذا الضغط قد تؤثر على عملية الاستيراد. وهكذا، وفي بعض الحالات، ينبغي تفسير النتائج بحذر عند بروتوبلاستس يتم استخدامها لإجراء التجارب على استيراد البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نفذ هذا العمل بالدعم من "برنامج البحوث التعاونية" لعلوم الزراعة وتطوير التكنولوجيا (المشروع رقم PJ010953012018)، "إدارة التنمية الريفية"، ومنحة "مؤسسة البحوث الوطنية" (كوريا) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (رقم 2016R1E1A1A02922014)، جمهورية كوريا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS | Duchefa Biochemie | G0210.0050 | |
| SUCROSE | Duchefa Biochemie | S0809.5000 | |
| MES MONOHYDRATE | Duchefa Biochemie | M1503.0250 | |
| Agar, powder | JUNSEI | 24440S1201 | |
| Micropore Surgical tape | 3M | 1530-0 | |
| Surgical blade stainless No.10 | FEATHER | Unavailable | |
| Conical Tube, 50ml | SPL LIFE SCIENCES | 50050 | |
| Macerozyme R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| Cellulase ONOZUKA R-10 | YAKULT PHARMACEUTICAL IND. | Unavailable | |
| ALBUMIN, BOVINE (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| D-Mannitol | SIGMA | M1902-1KG | |
| CALCIUM CHLORIDE, DIHYDRATE | MP BIOMEDICALS | 0219463505-5KG | |
| Twister | VISION SCIENTIFIC | VS-96TW | |
| Screen cup for CD-1 | SIGMA | S1145 | |
| Screens for CD-1 | SIGMA | S3895 | |
| Petri Dish | SPL LIFE SCIENCES | 10090 | |
| Pasteur pipette | HILGENBERG | 3150102 | |
| LABORATORY CENTRIFUGE / BENCH-TOP | VISION SCIENTIFIC | VS-5500N | |
| Sodium chloride | JUNSEI | 19015S0350 | |
| Potassium chloride | SIGMA | P3911-1KG | |
| D-GLUCOSE, ANHYDROUS | BIO BASIC | GB0219 | |
| Potassium Hydroxide | DUKSAN | 40 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | SIGMA | C2786-500G | |
| Poly(ethylene glycol) | SIGMA | P2139-2KG | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA | M2393-500G | |
| Tube 13ml, 100x16mm, PP | SARSTEDT | 55.515 | |
| Microscope slides | MARIENFELD | 1000412 | |
| Microscope Cover Glasses | MARIENFELD | 101030 | |
| Counting Chamber | MARIENFELD | 650030 | |
| Axioplan 2 Imaging Microscope | Carl Zeiss | Unavailable | |
| Micro tube 1.5ml | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), Proteomics Grade | VWR | M107-500G | |
| TRIS, Ultra Pure Grade | VWR | 0497-5KG | |
| DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnology Grade | VWR | 0281-25G | |
| Bromophenol blue sodium salt ACS | VWR | 0312-50G | |
| Glycerol | JUNSEI | 27210S0350 | |
| Living Colors A.v. Monoclonal Antibody (JL-8) | TAKARA | 632381 |
References
- Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
- Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
- Rolland, N., et al. The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes. Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).
- Jarvis, P. Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants. New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).
- Li, H. M., Chiu, C. C.
- Keegstra, K., Cline, K. Protein import and routing systems of chloroplasts. Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).
- Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).
- Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments. Cell. 46 (3), 365-375 (1986).
- Lee, D. W., et al. Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs. Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).
- Lee, S., et al. Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs. Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).
- Jin, J. B., et al. A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).
- Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts. Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).
- Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts. Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).
- Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts. Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).
- Lee, J., et al. Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells. Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).
- Cleary, S. P., et al. Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).
