Summary
यहां हम एक समय चूक morphometric प्रोटोकॉल वर्तमान के लिए ब्लास्टोसिस्ट संकोची और पुनः विस्तार की तीव्रता का पालन करें previtrification हस्तक्षेप और पोस्ट वार्मिंग वसूली के दौरान । प्रोटोकॉल के आवेदन में संभव है इन विट्रो निषेचन प्रयोगशालाओं समय चूक सूक्ष्मदर्शी के साथ सुसज्जित है और एक इष्टतम ब्लास्टोसिस्ट विरिफिकेशन विधि के विकास में सिफारिश की है ।
Abstract
यह लेख एक ब्लास्टोसिस्ट की सटीक निगरानी के लिए समय-चूक microphotography के आधार पर ब्लास्टोसिस्ट आकारमिति के noninvasive विधि का वर्णन व्यक्तिगत चरणों से पहले और विरिफिकेशन के बाद बदलती मात्रा । इस विधि के सबसे इष्टतम समय के लिए खोज में उपयोगी हो सकता है ब्लास्टोसिस्ट जोखिम के विभिंन सांद्रता को cryoprotectants अवलोकन द्वारा ब्लास्टोसिस्ट सिकुड़न और फिर से विस्तार में अलग पूर्व और बाद के विरिफिकेशन चरणों । इस पद्धति के साथ, ब्लास्टोसिस्ट विरिफिकेशन प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है । इस morphometric विधि की उपयोगिता का एक बेहतर प्रदर्शन के लिए, दो विभिन्न ब्लास्टोसिस्ट तैयारी प्रोटोकॉल के लिए तुलना कर रहे हैं; एक कृत्रिम blastocoel टूट का उपयोग कर के साथ एक और विरिफिकेशन से पहले इस हस्तक्षेप के बिना एक । दोनों blastocysts ' मात्रा में परिवर्तन समय चूक microphotography द्वारा पीछा कर रहे है और तस्वीर संपादन सॉफ्टवेयर उपकरण द्वारा मापा । मापन के लिए हर 20 सेकंड में ले रहे है previtrification चरणों और हर 5 मिनट के बाद वार्मिंग की अवधि में । समय इकाई के अनुसार ब्लास्टोसिस्ट आयामों के परिवर्तन रेखांकन रेखा आरेख में प्रस्तुत किए जाते हैं । परिणाम एक लंबे समय के साम्य previtrification चरण जिसमें अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट पहले सिकुड़ती है और फिर धीरे से ब्लास्टोसिस्ट फिर से भरना, एक तरल पदार्थ से भरे ब्लास्टोसिस्ट के साथ विरिफिकेशन में प्रवेश दिखा । कृत्रिम रूप से ढह ब्लास्टोसिस्ट पूरे समानता चरण के माध्यम से अपने सिकुड़ा हुआ चरण में रहता है । विरिफिकेशन चरण के दौरान, यह भी इसकी मात्रा में परिवर्तन नहीं करता है । के बाद से ब्लास्टोसिस्ट आकारमिति कृत्रिम रूप से ध्वस्त ब्लास्टोसिस्ट की एक निरंतर मात्रा previtrification कदम के दौरान पता चलता है, ऐसा लगता है कि इस चरण कम हो सकता है । वर्णित प्रोटोकॉल के दौरान और गति और मात्रा में परिवर्तन की तीव्रता के आधार पर cryopreservation के बाद ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के कई अतिरिक्त तुलनात्मक मापदंडों प्रदान करता है, आंशिक ब्लास्टोसिस्ट संकुचन या कुल ब्लास्टोसिस्ट की संख्या गिर, और एक कुल blastocoel पुनः विस्तार या समय के लिए समय के लिए अंडे ।
Introduction
इन विट्रो निषेचन कार्यक्रम (आईवीएफ) में से मानव preimplantation भ्रूण के cryopreservation आजकल ज्यादातर आईवीएफ प्रयोगशालाओं में एक नियमित अभ्यास है । धीमी भ्रूण ठंड विधि १९८५ में नैदानिक इस्तेमाल किया जा करने के लिए शुरू किया, विशिष्ट cryoprotectants और कंप्यूटर नियंत्रित फ्रीजर की शुरूआत के साथ, जो-7 डिग्री सेल्सियस के नीचे भ्रूण के नियंत्रित ठंडा सक्षम है, जब बर्फ के न्यूक्लिएशन (seeding) में प्रेरित किया गया था आसपास के cryoprotective मध्यम1. लगातार ठंडा करके, बर्फ क्रिस्टल विकसित होता है, शेष तरल अंश की hyperosmolality के कारण और, फलस्वरूप, निर्जलीकरण और भ्रूणीय कोशिकाओं के सिकुड़न । -30 डिग्री सेल्सियस या-८० डिग्री सेल्सियस, भ्रूण लंबे समय तक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में गिर जाएगा । कूलिंग के दौरान भ्रूण या अंडाणुओं के साथ क्या हो रहा था केवल विशेष रूप से अनुकूलित cryomicroscopes, जो cryopreservation प्रोटोकॉल2में सुधार करने में मदद के द्वारा मनाया जा सकता है । blastocysts की ठंड, एक उच्च मात्रा और अधिक तरल पदार्थ निहित भ्रूणीय चरण, उन दिनों में कम आशाजनक नैदानिक परिणाम दिया3.
ब्लास्टोसिस्ट के cryopreservation में सफलता विरिफिकेशन विधि की शुरूआत थी, जिसमें कोशिकाओं के निर्जलीकरण cryoprotectants4की उच्च सांद्रता का उपयोग करके ठंडा करने से पहले जगह ले ली । विरिफिकेशन से पहले ब्लास्टोकोएल से द्रव को हटाने को भी दो ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं के बीच एक यांत्रिक खोलने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है5. हालांकि तत्काल ब्लास्टोसिस्ट उत्तरजीविता दर के बाद और वार्मिंग ९०% से ऊपर है, और नैदानिक परिणाम के हस्तांतरण के बाद विरिफाइड/warmed ब्लास्टोसिस्ट गर्भाशय गुहा में लगभग परिणाम के लिए तुलनीय है ताजा के हस्तांतरण के बाद भ्रूण, इस cryopreservation विधि अभी तक मानकीकृत नहीं किया गया है6,7. विरिफिकेशन प्रोटोकॉल (क) प्रकार और cryoprotectants की एकाग्रता के अनुसार बदलती हैं, (ख) previtrification कदम की संख्या, (ग) व्यक्तिगत कदम की अवधि, (घ) एक कृत्रिम blastocoel का उपयोग विक्रिकरण से पहले गिर रहा है या नहीं, (ई) तरीकों को कम करना, (च) ब्लास्टोसिस्ट विस्तार चरण, और (छ) समानता/विरिफिकेशन तापमान जिस पर भ्रूण को8वितरीकृत किया जाना चाहिए । चूंकि cryoprotectants कोशिकाओं के लिए विषाक्त हो सकता है, इन समाधानों के लिए ब्लास्टोसिस्ट एक्सपोजर समय अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना है. हालांकि, कुछ cryopreservation मीडिया निर्माता बहुत लचीला प्रोटोकॉल की अनुमति दें ।
वैज्ञानिकों के हित आमतौर पर रोपण की एक बेहतर भविष्यवाणी6,9,10के साथ नए बायोमार्कर खोजने के उद्देश्य के साथ ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार की क्षमता का अध्ययन करने पर ध्यान केंद्रित किया है । कैसे मानव blastocysts विरिफिकेशन से पहले cryoprotectants जोड़ने और क्या विरिफिकेशन और वार्मिंग, जब cryoprotectants कोशिकाओं से हटा दिया जाना है के बाद blastocysts के साथ होता है के विभिंन चरणों में निर्जलीकरण, और कैसे blastocysts rehydrate और फिर से विस्तार वार्मिंग के बाद, अच्छी तरह से वर्णित है और न ही समझ नहीं है । अलग cryopreservation कदम के दौरान ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के उद्देश्य और मात्रा निर्धारित निगरानी के लिए एक पद्धति का विकास है, इस प्रकार, तर्क ।
समय के साथ विभिन्न निर्माताओं की चूक सूक्ष्मदर्शी, यह अब पूर्व में ब्लास्टोसिस्ट के व्यवहार की निगरानी करने के लिए संभव है-और पोस्ट-विरिफिकेशन चरणों. अतिरिक्त कंप्यूटर टूल्स को शामिल करके, उनके आकार (morphometry) का मापन भी किया जा सकता है । एक निश्चित समय में भ्रूण के आकार में कमी या वृद्धि को मापने के द्वारा, निर्जलीकरण और पुनर्जलयोजन के दौरान भ्रूण की मॉर्फोडायनामिक्स के मूल्यांकन को आपत्तिजनक बनाना संभव है ।
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Protocol
यहाँ वर्णित सभी विधियों को राष्ट्रीय आयुर्विज्ञान नीतिशास्त्र समिति द्वारा 19 अप्रैल २०१६ (सं. 0120 – 204/2016 – 2) में अनुमोदित किया गया है ।
1. माइक्रोस्कोप रिकॉर्डिंग प्रणाली के सेट अप
- सूक्ष्मदर्शी की हीटिंग प्लेट को बंद कर दें ।
- किसी भी उपचार से पहले, एक कैमरा सुसज्जित औंधा सूक्ष्मदर्शी के तहत एक ब्लास्टोसिस्ट का एक स्नैपशॉट ले । आवर्धन जिस पर ब्लास्टोसिस्ट दर्ज किया गया था नोट करने के लिए याद रखें ।
2. चयन और विरिफिकेशन के लिए blastocysts की prepreparation
- केवल पूरी तरह से विस्तारित दिन-5 या दिन-6 के साथ cryopreservation के लिए blastocysts का चयन करें कुछ भीतरी कोशिका द्रव्यमान (icm) कोशिकाओं और संकोची trophectoderm ।
- एक ढह blastocysts के साथ लेजर इलाज blastocysts के लिए, एक छोटे लेजर पल्स करने के लिए एक blastocysts विषय (०.४-०.७ एमएस) ४.३ से लेकर एक छेद व्यास के साथ ९.४ μm, tangentially zona पेल्यूसिडा पर निर्देशित और दो आसन्न trophectodermal कोशिकाओं के एक जंक्शन पर. ब्लास्टोसिस्ट पूरी तरह से या आंशिक रूप से 5 मिनट के लिए पतन की अनुमति दें ।
- एक अक्षुण्ण ब्लास्टोकोएल के साथ अस्वास्थ्यकर ब्लास्टोसिस्टों के लिए, विरिफिकेशन से पहले कोई विशेष उपचार न करें ।
नोट: इन ब्लास्टोसिस्टों को बरकरार माना जाता है ।
3. क्रियोप्रोटेक्टेंट की तैयारी और साम्य चरण के लिए एक पेट्री डिश
- एक 9-अच्छी तरह से पेट्री डिश के microdroplet क्षेत्र के छेद में (एम-१९९ hepes-buffered मध्यम ७.५% dmso, ७.५% ईथीलीन glycol, 20% dss) के साथ aseptically भरने के लिए (व्यास १३५ μm) के लिए एक प्रकार की वनस्पति के लिए पिठे पिपेट का उपयोग करें विशेष रूप से डिजाइन समय चूक माइक्रोस्कोपी और रिकॉर्डिंग ।
नोट: oocyte अनाकुलता oocyte आसपास के मेघपुंज कोशिकाओं को हटाने की एक प्रक्रिया है । अंडक अनादरण के लिए एक पिपेट का उपयोग हवा के बुलबुले के निर्माण से बचने में मदद मिलेगी । - microdroplet क्षेत्र साम्यन मीडिया के 30 μl के साथ ओवरले ।
4. साम्य समाधान में ब्लास्टोसिस्ट का स्थानांतरण
- एक लेजर इलाज या अक्षुण्ण मध्यम में बरकरार ब्लास्टोसिस्ट microdroplet पकवान के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए microdroplet के क्षेत्र के नीचे करने के लिए (साम्यन चरण) ।
- के रूप में जल्द ही एक 10 मिनट की उलटी गिनती शुरू ब्लास्टोसिस्ट समकारी माध्यम को हस्तांतरित किया जाता है ।
5. इक्विलीब्यूशन चरण में ब्लास्टोसिस्ट की रिकॉर्डिंग
- एक कैमरा से सुसज्जित माइक्रोस्कोप के लिए ब्लास्टोसिस्ट के साथ microdroplet पकवान हस्तांतरण । एक ही blastocyst का एक स्नैपशॉट लेने के लिए पहले के रूप में एक ही इज़ाफ़ा का प्रयोग करें । microdroplet पकवान स्थिति इतनी है कि ब्लास्टोसिस्ट लगभग रिकॉर्डिंग के केंद्र में तैनात है ।
- खुर्दबीन रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । जिस पर रिकॉर्डिंग प्रारंभ किया गया है उलटी गिनती समय नोट करें ।
नोट: एक अक्षुण्ण (चित्रा 1, वीडियो 1) और एक संक्षिप्त ब्लास्टोसिस्ट (चित्रा 2, वीडियो 2) के दौरान 10 मिनट एक समानता समाधान के लिए जोखिम की रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि परिणाम देखें ।
6. ब्लास्टोसिस्ट का विरिफिकेशन
- aseptically एक ५०-μl बूंद विरिफिकेशन समाधान (एम-१९९ hepes-buffered माध्यम 15% dmso, 15% एथिलीन glycol, 20% dss, ०.५ एम sucrose) में एक पेट्री डिश 2 मिनट से पहले उलटी गिनती समाप्त होता है ।
- 10 मिनट की उलटी गिनती समाप्त होता है और जल्दी से कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए विरिफिकेशन समाधान के लिए ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण जब रिकॉर्डिंग बंद करो ।
- धीरे से ब्लास्टोसिस्ट को विरिफिकेशन समाधान के भीतर कम से 1x पाइपेट ।
- ब्लास्टोसिस्ट को लोड करने के लिए एक विरिफिकेशन स्ट्रॉ का उपयोग करें । लोड, मुहर, और ८० एस के भीतर तरल नाइट्रोजन (LN) में विरिफिकेशन पुआल डुबकी, ११० एस से अधिक नहीं के लिए प्रारंभिक प्रदर्शन के बाद विरिफिकेशन समाधान ।
7. इक्विलीब्यूशन चरण के दौरान दर्ज की गई ब्लास्टोसिस्ट की वीडियो संपादन
- वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में एक रिकॉर्ड वीडियो फ़ाइल आयात करें ।
- टाइमलाइन स्लाइडर को 20 s पर ले जाएं । इस समय फ़्रेम संख्या नोट करें ।
नोट: यह संख्या अनावश्यक वीडियो फ्रेम को तबाह करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । केवल फ्रेम हर 20 एस इस्तेमाल किया जाएगा । - वीडियो टैब पर क्लिक करें, फिर फ़्रेम दर...। फ़्रेम दर रूपांतरणके अंतर्गत, फ़ील्ड के आधार पर चेक करें और पहले नोट किए गए फ़्रेम नंबर डालें. ठीकक्लिक करके पुष्टि करें. क्लिक करें फ़ाइल → निर्यात → छवि अनुक्रम.
- JPEG आउटपुट स्वरूप के रूप में चुनें, छवियों के सहेजे गए अनुक्रम को रखने के लिए निर्देशिका सेट, और ठीकक्लिककरें ।
नोट: यह के साथ एक निर्देशिका बनाने के लिए होगा दर्ज की गई ब्लास्टोसिस्ट की 30 छवियों के अनुक्रम में विक्रिकरण के समकारी चरण के दौरान ।
8. equilibration चरण के दौरान बनाई गई छवियों से ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र का मापन
- वीडियो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । विंडो टैब पर क्लिक करें और टाइमलाइनचुनें.
- टाइमलाइन फलक में, फिल्म पट्टी पर हस्ताक्षर पर क्लिक करें और मीडिया जोड़ें चुनें... विरिफिकेशन के समानता चरण से पहले ब्लास्टोसिस्ट की एक छवि जोड़ने के लिए-और लेजर हस्तक्षेप से पहले, अगर कोई था ।
नोट: यह छवि अपने सबसे विस्तारित राज्य में ब्लास्टोसिस्ट दिखाएगा और इसके पार-अनुभागीय क्षेत्र एक संदर्भ के रूप में काम करेगा । - इसी ब्लास्टोसिस्ट के छवि अनुक्रम जोड़ें वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर के साथ पहले से उत्पंन (विरिफिकेशन के साम्यन चरण के) ।
- छवि → विश्लेषण → डेटा अंक का चयन करें → कस्टम का चयन डेटा अंक खिड़की खोलने के लिए जाओ ।
- सभी डेटा बिंदुओं का चयन रद्द करें, फिर केवल क्षेत्र चुनें और ठीकक्लिक करके पुष्टि करें.
- टाइमलाइन विंडो में टाइमलाइन स्लाइडर को पहली छवि पर ले जाएँ.
- विंडो टैब क्लिक करें और उपकरणचुनें ।
नोट: यह बाईं ओर उपकरण पैनल को सक्रिय करेगा । - त्वरित चयन टूलचुनें.
- ब्लास्टोसिस्ट के किनारे को छूने के लिए ब्लास्टोसिस्ट के अंदर उपकरण मार्कर की स्थिति । ब्लास्टोसिस्ट के बाहरी किनारे पर टूल मार्कर रखकर ब्लास्टोसिस्ट को रेखांकित करें, बाईं माउस बटन को क्लिक करके पकड़े, और पूरे ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र तक ब्लास्टोसिस्ट के बाहरी किनारे के साथ टूल मार्कर को खींचकर चुना गया है ।
नोट: zona पेल्यूसिडा माप का एक हिस्सा नहीं है, इसलिए इसे बाहर रखा जाना चाहिए (चित्रा 5) । - टाइमलाइन विंडो में, मापन लॉग पर क्लिक करें और रिकॉर्ड मापन बटन दबाएँ.
नोट: यह चयनित क्षेत्र को रिकॉर्ड करेगा । - समयरेखा पर वापस लौटें, छवि पर राइट-क्लिक करें, और चयन को चुनें ।
- अगली छवि के लिए समय स्लाइडर ले जाएँ और इसके नीचे इसी टाइल पर क्लिक करें.
- त्वरित चयन उपकरण के साथ नई छवि में ब्लास्टोसिस्ट रूपरेखा । माप दोहराएं ।
- इस कार्यविधि को दोहराएँ (चरण ८.९-८.१३) छवि द्वारा छवि जब तक सभी छवियों ' पार-अनुभागीय क्षेत्रों मापा और दर्ज की गई हैं.
- अंत में, माप लॉग करने के लिए जाना, क्षेत्र चर के तहत सभी माप का चयन करें, और उन्हें एक. txt फ़ाइल में निर्यात.
नोट: क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की इकाइयां वर्गाकार पिक्सेल हैं ।
9. equilibration चरण के दौरान बनाई गई छवियों से दर्ज की गई blastocyst के पार सेक्शनल क्षेत्रों के साथ डेटा फ़ाइल का संपादन
- txt फ़ाइल से स्प्रेडशीट संपादक में दर्ज किए गए ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्रों के डेटा को स्थानांतरित करें ।
- संदर्भ मान 1 और एक्सप्रेस (ट्रांस्फ़ॉर्म) के रूप में प्रथम क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र मान का उपयोग करें जो संदर्भ मान का एक अंश होने के लिए सभी अंय मान ।
- एक नया चर area_r बनाएँ और ट्रांसकोड किए गए क्षेत्र मान (संदर्भ मान को छोड़ कर) इसके अंतर्गत चिपकाएँ ।
- area_r चर के आगे, एक समय चर बनाएं और पहली बार मान जोड़ें ।
नोट: पहली बार मूल्य समय जो ब्लास्टोसिस्ट एक कैमरा के तहत रिकॉर्डिंग की शुरुआत करने के लिए समकारी समाधान के लिए उजागर किया गया था से पारित बार का प्रतिनिधित्व करता है-सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी । - पिछले समय मान में 20 s जोड़कर प्रत्येक क्रमिक समय मान परिकलित करें ।
नोट: यह रिकॉर्डिंग के दौरान बनाया अनावश्यक वीडियो फ्रेम दशमलव अंकित पर इस्तेमाल समय अंतराल है.
10. ब्लास्टोसिस्ट का वार्मिंग
- वार्मिंग के लिए मीडिया तैयार करें ।
- ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग से एक दिन पहले, एक 4-अच्छी तरह से पकवान में रिकवरी माध्यम के ३ १५०-μl बूंदों को aseptically वितरित करते हैं । इसके अलावा, एक microdroplet 9-अच्छी तरह से विशेष रूप से समय-चूक माइक्रोस्कोपी और रिकॉर्डिंग के लिए डिजाइन पकवान में वसूली मध्यम बांटना । पैराफिन तेल के साथ वसूली मध्यम कवर और यह 6% सह2 और 5% O2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर preincubate ।
नोट: रिकवरी माध्यम blastocyst के लिए एक खेती माध्यम है-जोड़ा मानव सीरम एल्ब्युमिन (hsa) के साथ चरण भ्रूण । रिकवरी मीडियम में hsa 12 mg/एमएल होना चाहिए । 9-अच्छी तरह से पकवान में छेद को भरने के लिए, हवा के बुलबुले के निर्माण से बचने के लिए अंडक निंदा के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, फिर वसूली माध्यम के 30 μl के साथ microdroplet क्षेत्र ओवरले । - ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग के दिन, एक 4-अच्छी तरह से पकवान के एक अच्छी तरह से ५०० μl (टीएस) को aseptically वितरण करता है और इसे सह2के बिना एक इनकोबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति देता है ।
- कमरे के तापमान पर, एक बाँझ पेट्री डिश में १ ५०-μl बूंद कमजोर पड़ने समाधान (डी एस) और २ ५०-μl धोने समाधान (WS) की बूंदें डी एस और WS1 और WS2 बूंदें पैराफिन तेल के साथ कवर ।
ध्यान दें: एक पेट्री डिश के बजाय, एक 4-अच्छी तरह से पकवान भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- ब्लास्टोसिस्ट वार्मिंग से एक दिन पहले, एक 4-अच्छी तरह से पकवान में रिकवरी माध्यम के ३ १५०-μl बूंदों को aseptically वितरित करते हैं । इसके अलावा, एक microdroplet 9-अच्छी तरह से विशेष रूप से समय-चूक माइक्रोस्कोपी और रिकॉर्डिंग के लिए डिजाइन पकवान में वसूली मध्यम बांटना । पैराफिन तेल के साथ वसूली मध्यम कवर और यह 6% सह2 और 5% O2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर preincubate ।
- blastocyst गर्म ।
- के साथ hsv स्ट्रॉ की पहचान करें काचित ब्लास्टोसिस्ट के लिए ln भंडारण से हटा दिया और जल्दी से एक ln-वार्मिंग प्रक्रिया के लिए तैयार करने में पोर्टेबल जलाशय भर स्ट्रॉ हस्तांतरण ।
- बस रंग हैंडलिंग रॉड बेनकाब करने के लिए पर्याप्त, forceps के साथ पुआल लिफ्ट । रंग हैंडलिंग रॉड की ऊंचाई पर भूसे को काटने के लिए एक आत्म समायोजन तार खाल उधेड़नेवाला का प्रयोग करें ।
- हैंडलिंग रॉड ले लो और यह एक स्विफ्ट के साथ पुआल से निकालने, अभी तक नियंत्रित आंदोलन, और तुरंत ३७ डिग्री सेल्सियस में हैंडलिंग रॉड की घुमावदार रंग डुबकी ।
- धीरे से हैंडलिंग रॉड ब्लास्टोसिस्ट अलग करने के लिए और यह टीएस में 1 मिनट की कुल के लिए छोड़ भंवर ।
- कमरे के तापमान पर, एक माध्यम में 4 मिनट के लिए लगातार डी एस, WS1, और WS2 के लिए ब्लास्टोसिस्ट स्थानांतरण ।
- वार्मिंग प्रक्रिया के बाद, एक 4 के लिए ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण-वसूली माध्यम से अच्छी तरह से पकवान और यह सब तीन बूंदें में धीरे से इसे pipetting से धो लो ।
नोट: धोने लगभग 1 मिनट में किया जाता है । - स्थानांतरण ब्लास्टोसिस्ट समय चूक 9-वसूली माध्यम से अच्छी तरह से पकवान । एक इनकोबेटर में एक समय चूक कैमरा के तहत 9-अच्छी तरह से पकवान प्लेस (6% सह2 और 5% ओ2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर) ।
नोट: thre वार्मिंग प्रक्रिया है, जो एक मशीन में एक समय-चूक कैमरा के तहत 9 अच्छी तरह से पकवान रखने के साथ जारी है, लगभग 17 मिनट तक रहता है ।
11. समय-पुनर्प्राप्ति के दौरान फिर से विस्तार ब्लास्टोसिस्ट की रिकॉर्डिंग-वार्मिंग के बाद
- समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर चलाते हैं ।
- एक रिकॉर्डिंग कैमरा चुनें ।
- लाइव मोड बटन दबाएँ.
- छवि पर माउस कर्सर रखें और स्क्रॉल बटन का उपयोग करने के लिए यह विस्तार । क्लिक करें और बाईं माउस बटन पकड़ और कर्सर ले जाने के लिए स्क्रीन के बीच में ब्लास्टोसिस्ट के साथ अच्छी तरह से जगह है ।
- फोकसके तहत, ब्लास्टोसिस्ट के रिकॉर्डिंग विमान को ध्यान केंद्रित करने के लिए ऊपर-नीचे हरे तीर का उपयोग करें । प्रकाश तीव्रताके तहत, प्रकाश की तीव्रता सेट करें ।
- एक्सपोज़र समय और गामा सेट करने के लिए माइक्रोस्कोप पैरामीटर बटन पर क्लिक करें ।
- लाइव मोड बंद करेंदबाएँ.
- परियोजना शुरू बटन दबाएँ और परियोजना डेटा दर्ज करें, संस्कृति पकवान प्रकार (3 एक्स 3 या 4 एक्स 4) का चयन और दर्ज किया जा करने के लिए एक को छोड़कर सभी पदों को अचयनित ।
- एक तस्वीर हर 5 मिनट लेने के लिए कब्जा समय निर्धारित करें ।
- स्वीकारें बटन दबाकर रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें । रिकॉर्ड कम से १५० मिनट ।
- प्रोजेक्ट रोकें बटन दबाकर रिकॉर्डिंग रोकें ।
नोट: एक अक्षुण्ण (चित्रा 3) और एक ढह ब्लास्टोसिस्ट (चित्रा 4) के बाद वार्मिंग वसूली अवधि के दौरान की रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि परिणाम देखें ।
12. पुनः के दौरान दर्ज की गई blastocyst के वीडियो संपादन-विस्तार के बाद वार्मिंग
- प्रोजेक्ट फ़ोल्डर पर जाएँ और आकार में मोटे तौर पर ८० KB हैं रिकॉर्ड किए गए चित्रों की स्थिति जानें ।
- कोई अंय फ़ोल्डर बनाएं और इन छवियों को इसमें स्थानांतरित करें । बनाए गए समय के अनुसार संख्याओं में छवियों का नाम बदलें । उंहें एक छवि अनुक्रम के रूप में वीडियो संपादन सॉफ्टवेयर में आयात करें ।
- वीडियो टैब पर जाएं → फ़िल्टर → जोड़ें और नल रूपांतरण फ़िल्टर का चयन करें ।
- दाईं ओर क्रॉप बटन पर क्लिक करें और छवि को काटें, केवल दर्ज किए गए ब्लास्टोसिस्ट के साथ दिखाई देने वाले क्षेत्र को छोड़कर । ठीक से और फिर ठीक से पुष्टि करें.
- क्लिक करें फ़ाइल → निर्यात → छवि अनुक्रम. JPEG आउटपुट स्वरूप के रूप में चुनें, छवियों के सहेजे गए अनुक्रम को रखने के लिए निर्देशिका सेट, और ठीकक्लिककरें ।
नोट: यह आकार बदला (फसली) छवियों वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आगे माप के लिए तैयार बनाया जाएगा ।
13. समय-चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के साथ बनाई गई छवियों के लिए वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक माप पैमाने की स्थापना
- समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के विश्लेषक चलाते हैं ।
- रिकॉर्ड किए गए ब्लास्टोसिस्ट के साथ परियोजना खोलें ।
- दर्ज की गई blastocyst के साथ क्षेत्र पर विश्लेषण बटन पर क्लिक करें ।
नोट: एक नया विश्लेषण खिड़की खुल जाएगा । माप उपकरण दिखाने के लिए माप बटन पर क्लिक करें । - संपूर्ण छवि की चौड़ाई मापने के लिए माप उपकरण का उपयोग करें ।
- छवि पर राइट-क्लिक करें और इसे सहेजें । गुणों में, पिक्सेल में छवि की चौड़ाई जांचें ।
- छवि की वास्तविक चौड़ाई को पिक्सेल में इसकी चौड़ाई से विभाजित कर लें ।
नोट: यह इस छवि में किसी एकल पिक्सेल की वास्तविक लंबाई का परिकलन करता है. - वीडियो विश्लेषण सॉफ़्टवेयर चलाएँ ।
- विंडो टैब पर क्लिक करें और टाइमलाइनचुनें.
- टाइमलाइन फलक में, फ़िल्म स्ट्रिप साइन पर क्लिक करें और मीडिया जोड़ें चुनें.. । पोस्ट-गर्म फिर से विस्तार ब्लास्टोसिस्ट की छवि अनुक्रम जोड़ने के लिए ।
- छवि → विश्लेषण → माप स्केल विंडो खोलने के लिए सेट माप स्केल → कस्टम क्लिक करें । पिक्सेल लंबाई के लिए, 1 दर्ज करें; तार्किक लंबाई के लिए, पिक्सेल की पहले परिकलित वास्तविक लंबाई दर्ज करें (चरण १३.६); तार्किक इकाइयों के लिए, μm दर्ज करें. प्रीसेट सहेजें ।
14. फिर से विस्तार के बाद गर्म के दौरान बनाई गई छवियों से ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र का मापन
- एक बार माप पैमाने पर सेट और छवि अनुक्रम आयातित, उपाय है blastocyst क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्रों के रूप में उसी तरह कदम 8 में वर्णित है, केवल अंतर के साथ किया जा रहा है कि इन मापन में मापा पार सेक्शनल क्षेत्रों μm 2 में इकाइयों है .
15. फिर से विस्तार के बाद गर्म के दौरान बनाई गई छवियों से दर्ज की गई blastocyst के पार सेक्शनल क्षेत्रों के साथ डेटा फ़ाइल का संपादन
- txt फ़ाइल से स्प्रेडशीट संपादक में दर्ज किए गए ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्रों के डेटा को स्थानांतरित करें ।
- क्षेत्र चर के आगे एक समय चर बनाएं और पहली बार मान जोड़ें ।
नोट: इस स्थिति में, पहली बार मान 0 मिनट के लिए सेट किया गया है, जो समय-व्यतीत रिकॉर्डिंग की शुरुआत है । प्रत्येक क्रमिक समय मान को पिछले समय मान में 5 मिनट जोड़कर परिकलित किया जाता है । पांच मिनट लगातार दो बार चूक रिकॉर्डिंग के बीच इस्तेमाल समय अंतराल है ।
16. एक लाइन आरेख का निर्माण
- स्प्रेडशीट डेटा फ़ाइल में सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर में एक समय भूखंड बनाने के लिए आयात करें ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में परिवर्तन के दौरान विरिफिकेशन या फिर से विस्तार के बाद वार्मिंग के समानता चरण के दौरान ।
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Representative Results
एक प्रदर्शन में, हम केवल एक previtrification और एक के बाद वार्मिंग चरण में ब्लास्टोसिस्ट morphodynamics दिखाया । समानता के चरण के अंत में और संस्कृति माध्यम में उबरने की शुरुआत में ब्लास्टोसिस्ट की मात्रा में अंतर भ्रूण सिकुड़न की तीव्रता को दिखाया गया, जो वास्तव में, बर्फ क्रिस्टलीकरण के खिलाफ भ्रूण संरक्षण की तीव्रता को दिखाता है ।
के रूप में यह चित्रा 1 और 1 वीडियोसे देखा जा सकता है, अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट पूरी तरह से समकारी समाधान में पतन नहीं किया । blastocoel केवल आंशिक रूप से अनुबंधित किया है, लेकिन 10 मिनट के भीतर, यह ७०% की पुनः विस्तार आकार तक पहुंच गया । इसके विपरीत, कृत्रिम रूप से ढह ब्लास्टोसिस्ट पूरी तरह से लेजर उपचार के तुरंत बाद ब्लास्टोसिस्ट खाली कर दिया, लेकिन समकारी समाधान में, इसकी मात्रा किसी भी अधिक (चित्रा 2, वीडियो 2) बदल नहीं किया । blastocoel पुनः वसूली मध्यम में विस्तार की प्रस्तुति (चित्रा 3 और चित्रा 4) microफोटोग्राफ्स के साथ और लाइन आरेख के साथ blastocoel विकास के विभिंन पैटर्न से पता चलता है । ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के एकल माप का एक प्रदर्शन चित्रा 5में दिखाया गया है ।
cryoprotectants की एक उच्च एकाग्रता के साथ विरिफिकेशन माध्यम में, बरकरार blastocysts गहन एक बार फिर से सिकुड़, जबकि ढह ब्लास्टोसिस्ट की मात्रा लगभग अपरिवर्तित बनी रही. एक ग्राफिकल प्रस्तुति से, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके, यह स्पष्ट है कि अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट ब्लास्टोसिस्ट की एक पदश: कमी (चित्रा 6), एक बार समकारी समाधान में और एक बार विरिफिकेशन मध्यम में, से गुजरता है, जबकि ढह ब्लास्टोसिस्ट एक लेज़र (चित्रा 7) के साथ हस्तक्षेप की शुरुआत में एक सिकुड़ा हुआ मंच पर पहुंच गया । यह प्रश्न बन गया है कि क्या 10 मिनट के साम्यन चरण वास्तव में ढह blastocysts के लिए आवश्यक है, या कि क्या इस अवधि छोटा किया जा सकता है ।
blastocoel पुनः विस्तार की प्रस्तुति रैखिक या कई बड़े या छोटे संकुचन के साथ बाधित किया जा सकता है (चित्र 8) ।
चित्रा 1: समकारी समाधान के लिए जोखिम के दौरान एक अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक microphotography । एकल छवियों हर 20 सेकंड दर्ज किए गए । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2: समकारी समाधान के लिए जोखिम के दौरान एक कृत्रिम रूप से ढह ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक microphotography । एकल छवियों हर 20 सेकंड दर्ज किए गए । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 3: वसूली के बाद वार्मिंग के दौरान एक अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक microphotography । एकल छवियों हर 5 मिनट दर्ज किए गए । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 4: वसूली के बाद वार्मिंग के दौरान एक ढह ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक microphotography । एकल छवियों हर 5 मिनट दर्ज किए गए । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 5: एक blastocyst के पार अनुभागीय क्षेत्र के एक एकल माप का प्रदर्शन । ब्लास्टोसिस्ट ध्यान से वीडियो विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उपयुक्त चयन उपकरण के साथ घेर है । zona पेल्यूसिडा हमेशा माप से बाहर रखा गया है । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 6: एक अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व । इन पैनलों के पार में परिवर्तन के प्रतिनिधित्व शो एक अक्षुण्ण समाधान के लिए जोखिम के दौरान एक बरकरार ब्लास्टोसिस्ट के अनुभागीय क्षेत्र (एक) और (ख) वसूली के बाद वार्मिंग के दौरान । क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की इकाइयां प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के सापेक्ष हैं, जो कि विरिफिकेशन से पहले है । डैश लाइन को जोड़ने वाले पैनलों ए और बी काल्पनिक है, विरिफिकेशन के दौरान बदलावों का प्रतिनिधित्व करते हुए, १९६ डिग्री सेल्सियस तक ठंडा और ३७ डिग्री सेल्सियस तक वार्मिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 7: एक ढह ब्लास्टोसिस्ट के पार अनुभागीय क्षेत्र में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व । इन पैनलों के पार में परिवर्तन के प्रतिनिधित्व दिखाने के (एक) एक संक्षिप्त समाधान के दौरान एक ढह ब्लास्टोसिस्ट (ख) विरिफिकेशन और (सी) में वसूली के बाद वार्मिंग के दौरान (ग) । क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र की इकाइयां प्रारंभिक ब्लास्टोसिस्ट के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र के सापेक्ष हैं और टूट-फूट से पहले । पैनल ए पर डैश्ड लाइन काल्पनिक है और ब्लास्टोसिस्ट पतन के दौरान प्रारंभिक और समाप्ति बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है । इसके अलावा पैनलों बी और सीके बीच काल्पनिक डैश्ड लाइन, विरिफिकेशन के दौरान परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है, ठंडा करने के लिए-१९६ डिग्री सेल्सियस, और ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए वार्मिंग । केवल पैनल बी और सी में ठोस लाइनों के पार अनुभागीय क्षेत्र के वास्तविक मापन का परिणाम है साम्यन और वसूली की प्रक्रिया के दौरान । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 8: वार्मिंग के बाद ब्लास्टोसिस्ट वसूली के विभिंन पैटर्न के ग्राफिकल प्रस्तुति । स्केल बार १०० μm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
1 वीडियो: समकारी समाधान के लिए जोखिम के दौरान एक अक्षुण्ण ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक वीडियो । वीडियो परिवर्तन है, जो वास्तविक समय में लगभग 10 मिनट पिछले का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
2 वीडियो: समकारी समाधान के लिए जोखिम के दौरान एक ढह ब्लास्टोसिस्ट के परिवर्तन के समय चूक वीडियो । वीडियो परिवर्तन है, जो वास्तविक समय में लगभग 10 मिनट पिछले का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
के दौरान और cryopreservation के बाद ब्लास्टोसिस्ट morphodynamics के अवलोकन के लिए प्रोटोकॉल भी अन्य निर्माताओं से इसी तरह के उपकरणों और सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है. भ्रूणविज्ञान के लिए समायोजित समय-चूक सिस्टम भ्रूण के विकास की सतत निगरानी की अनुमति देते हैं । इस काम का उद्देश्य ब्लास्टोसिस्ट की तैयारी के दौरान विरिफिकेशन के लिए और उनके वार्मिंग के बाद ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के परिमाणन परिचय था । यह एक टाइमस्केल पर आकारिकी में परिवर्तन के उद्देश्य माप द्वारा किया गया था । इन मापों के प्राप्त परिणाम गणितीय विश्लेषण किया जा सकता है और अंय परिणामों के साथ तुलना में । पैरामीटर है कि वर्णित प्रोटोकॉल द्वारा पीछा किया जा सकता है के बीच में परिवर्तन कर रहे है blastocyst के आकार, अपने भीतर के सेल मास, blastocyst, या zona pellucida समय की एक निश्चित अवधि के भीतर । आकार सबसे बड़ा ब्लास्टोसिस्ट पार अनुभाग में सतह क्षेत्र के रूप में प्रदर्शित किया जा सकता है, ब्लास्टोसिस्ट परिधि या व्यास, और, गणना के बाद, यहां तक कि इसकी मात्रा के रूप में ।
समय चूक प्रणालियों का उपयोग कर पिछले अध्ययनों में, blastocoel विस्तार वेग माप केवल ताजा भ्रूण11पर किए गए थे । में विरिफाइड/गर्म blastocysts, केवल blastocysts ' आकार तुरंत वार्मिंग के बाद और भ्रूण हस्तांतरण से पहले मापा गया, या समय अवधि का विश्लेषण किया गया था जिस पर गर्म blastocysts फिर से विस्तारित zona pellucida9,10 . अधिक विस्तृत ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार गतिशीलता केवल हमारे पिछले अध्ययन में8का विश्लेषण किया गया । इस अध्ययन में, morphometric प्रोटोकॉल पहले से ही गति और ब्लास्टोसिस्ट पुनः के पैटर्न को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है वार्मिंग के बाद विस्तार. हालांकि इन ब्लास्टोसिस्ट विकास बायोमार्कर को प्रत्यारोपण के लिए एक उच्च भविष्य कहनेवाला मूल्य नहीं दिखाया है, वे ब्लास्टोसिस्ट वसूली क्षमता की तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और अलग cryopreservation मीडिया और प्रोटोकॉल के साथ वार्मिंग के बाद . अर्थात्, ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार के दौरान ब्लास्टोसिस्ट के अधिक से अधिक संकुचन trophectodermal परत कि cryopreservation के दौरान कारण हो सकता है की कमजोरी का सुझाव है, और उसके लिए तरल पदार्थ से भरे ब्लास्टोसिस्ट द्वारा किए गए दबाव का सामना असमर्थता ।
वर्णित morphometric प्रोटोकॉल की गति और मात्रा में परिवर्तन की तीव्रता को मापने के द्वारा न केवल cryopreservation के बाद, ब्लास्टोसिस्ट व्यवहार के कई अतिरिक्त तुलनात्मक विश्लेषण प्रदान कर सकते हैं, आंशिक ब्लास्टोसिस्ट संकुचन या कुल की संख्या ब्लास्टोसिस्ट गिर, समय के लिए कुल ब्लास्टोसिस्ट पुनः विस्तार, या समय के लिए अंडे की पट्टी । इसके अलावा, यह भी cryoprotectants के विभिन्न सांद्रता के लिए ब्लास्टोसिस्ट जोखिम का सबसे इष्टतम समय निर्धारित करने के लिए previtrification चरणों के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में परिणामों में प्रस्तुत किया गया था. वेंडरज़वाल्मेन एट अल. चूहों पर दिखाया अंडाणुओं कि विक्रिकरण भी सफल हो सकता है अगर इंट्रासेलर परासरणी दबाव बाहरी cryoprotectant समाधान12के साथ एक संतुलन तक नहीं पहुंचता है । संरक्षण के दौरान ब्लास्टोसिस्ट की रिकॉर्डिंग के लिए केवल समस्याग्रस्त चरण सीमित समय के कारण विरिफिकेशन समाधान में अवधि है; भ्रूण को cryoprotectants की एक उच्च एकाग्रता के संपर्क में है और ९० सेकंड से भी कम समय में पुआल में पैक किया जाता है । इन माप के लिए, यह केवल blastocysts कि अनुसंधान के लिए दान कर रहे है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की जाएगी । फिर भी, चिकित्सकीय उपलब्ध blastocysts दर्ज की और फिर से मापा जा सकता है वार्मिंग के बाद तुरंत, उद्देश्य के साथ निरीक्षण कैसे वे कमजोर पड़ने और धोने के समाधान में व्यवहार करते हैं । वसूली माध्यम से धोने के समाधान से एक ब्लास्टोसिस्ट हस्तांतरण के तुरंत बाद, ब्लास्टोसिस्ट नीचे की ओर तैरने लगते हैं । यह रिकॉर्डिंग के दौरान भ्रूण को एक ही फोकल प्लेन में रखने में कठिनाई का प्रतिनिधित्व कर सकता है । इस समस् या को हल करने के लिए मध् यम की चपटी बूंदों के साथ एक डिश तैयार करने की सलाह दी जाती है । एक ऐसी ही समस्या वांडरजवाल्मेन एट अल द्वारा देखी गई है । 12.
आगे अनुसंधान में, यह पता लगाने के लिए उपयोगी होगा कि कृत्रिम रूप से ध्वस्त blastocysts के cryoprotectants करने के लिए जोखिम की लंबाई कम किया जा सकता है, फलस्वरूप इन रसायनों के विषाक्त प्रभाव को कम करने.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम अनुसंधान कार्यक्रम P3-0327 और अनुसंधान परियोजना J3-7177, स्लोवेनियाई अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा स्थापित का एक हिस्सा है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
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- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
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- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
