Summary
Här presenterar vi en time-lapse morfometriska protokoll att följa intensiteten av blastocysten krympning och re-expansion under previtrification insatser och efter uppvärmningen återhämtning. Tillämpningen av protokollet är möjligt i in vitro- fertilisering laboratorier som är utrustade med time-lapse Mikroskop och rekommenderas i utvecklingen av en optimal blastocysten förglasning metod.
Abstract
Denna artikel beskriver den icke-invasiva metoden för blastocyst morfometri baserat på time-lapse microphotography för exakt övervakning av blastocyst's volym ändra under enskilda faserna före och efter förglasning. Metoden kan vara användbar i sökandet efter den mest optimala tidpunkten blastocysten exponering för olika koncentrationer av cryoprotectants genom att observera blastocysten krympning och re-expansion i olika före och efter förglasning faser. Med denna metod, kan det blastocystan förglasning protokollet optimeras. För en bättre demonstration av nyttan av denna morfometriska metod jämförs två olika blastocysten förberedelse protokoll för förglasning. en med hjälp av en konstgjord blastocoel kollapsar och en utan detta ingripande innan förglasning. Både blastocyster volymförändringar följs av time-lapse microphotography och mätt med fotoredigering verktyg. De mätningarna var 20 sekund i previtrification faser och var femte minut under perioden efter uppvärmningen. Ändringarna av de blastocystan dimensionerna per tidsenhet presenteras grafiskt linje diagram. Resultaten visar en lång Jämviktstiden previtrification fas där intakt blastocysten först krymper och sedan långsamt påfyllnad av blastocoel, in förglasning med en vätskefylld blastocoel. Artificiellt kollapsade blastocysten förblir i sin krympta steg genom hela Jämviktstiden fas. Under förglasning fas ändra det också inte dess volym. Eftersom den blastocystan morfometri visar konstant volym av de artificiellt kollapsade blastocyster under previtrification steg, verkar det som detta skede kunde vara kortare. Protokollet beskrivs ger många ytterligare jämförande parametrar av blastocysten beteende under och efter frysförvaring på grundval av hastighet och intensitet av volymändringar, antalet partiella blastocoel sammandragningar eller totala blastocysten kollapsar, och tid att en total blastocoel re-expansion eller tiden till kläckning.
Introduction
Frysförvaring av embryon preimplantatorisk från in vitro- fertilisering programmet (IVF) är numera en rutinmässig praxis i de flesta IVF laboratorier. Långsam embryot frysa metoden började användas kliniskt 1985, med införandet av särskilda cryoprotectants och datorstyrda frysar, vilket möjliggjorde kontrollerad kylning av embryon ner till-7 ° C, när is kärnbildning (sådd) var induceras i den omgivande cryoprotective medium1. Genom kontinuerlig kylning, iskristallerna skulle växa, orsakar hyperosmolality av den återstående flytande fraktionen och, följaktligen, uttorkning och krympning av embryonala celler. Vid-30 ° C eller -80 ° C, embryon skulle vara störtade ner i det flytande kvävgasen för längre lagring. Vad hände med embryon eller oocyter under kylningen kan observeras endast av specialanpassade cryomicroscopes, som bidrog till att förbättra frysförvaring protokoll2. Frysning av blastocyster, en högre volymer och mer vätska-innehöll fosterstadium, gav mindre lovande kliniska resultat i dessa dagar3.
Genombrottet i Frysförvaring av blastocystan var införandet av metoden förglasning, där uttorkningen av cellerna ägde rum före kylning med hjälp av höga koncentrationer av cryoprotectants4. Avlägsnande av vätskan från blastocoel innan förglasning kan också uppnås genom att göra en mekanisk öppning mellan två trophectoderm celler5. Även om omedelbar blastocysten överlevnaden efter förglasning och uppvärmningen är över 90%, och kliniska resultatet följande är överföring av förglasad/värmde blastocysten in i livmoderhålan nästan jämförbar med resultat efter överföringen av färska embryon, frysförvaring metoden har ännu inte standardiserad6,7. Förglasning protokoll variera enligt (a) typ och koncentration av cryoprotectants, (b) antal previtrification steg, (c) varaktigheten av enskilda steg, (d) användning av en konstgjord blastocoel kollapsa innan förglasning eller inte, (e). kollapsa metoder, (f) den blastocyst expansionen scenen och (g) Jämviktstiden/förglasning temperaturen på vilket embryon bör förglasat8. Eftersom cryoprotectants kan vara giftiga för celler, måste den blastocyst exponeringstiden till dessa lösningar definieras väl. Dock tillåta vissa frysförvaring media tillverkare mycket flexibelt protokoll.
Av intresse för forskare är oftast fokuserat på att studera den blastocystan re-expansion förmågan med syftet att finna nya biomarkörer med en bättre förutsägelse av implantation6,9,10. Hur mänskliga blastocyster torka på olika steg för att lägga till cryoprotectants innan förglasning och vad händer med blastocyster efter förglasning och uppvärmningen, när cryoprotectants har tagits bort från cellerna och hur blastocyster rehydrera och åter expandera efter uppvärmningen, är inte väl beskrivna heller förstås. Utveckling av en metod för målet och kvantifierade övervakning av blastocysten beteende under olika frysförvaring steg är således logiken.
Med time-lapse Mikroskop av olika tillverkare är det nu möjligt att övervaka beteendet hos blastocystan i före och efter förglasning faser. Genom att inkludera ytterligare datorverktyg, kan mätningar av deras storlek (morfometri) också utföras. Genom att mäta minskningen eller öka i embryo storlek vid en given tidpunkt, det är möjligt att objektifiera utvärdering av morphodynamics av embryon under Dehydrering och rehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den nationella medicinska forskningsetiska kommittén den 19 April 2016 (nr 0120 – 204/2016 – 2).
1. installation av mikroskopet inspelningssystemet
- Stänga av värmeplattan av mikroskopet.
- Innan någon behandling, ta en ögonblicksbild av en blastocyst i kameran-utrustad inverterade Mikroskop. Kom ihåg att observera förstoringen som spelades blastocystan.
2. urval och Prepreparation av blastocyster för förglasning
- Välj bara fullständigt expanderad dag-5 eller dag-6 blastocyster för frysförvaring med åtminstone några inre cell mass (ICM) celler och sammanhängande trophectoderm.
- För laser-behandlade blastocyster med en kollapsad blastocoel, angående blastocyst till en kort laserpuls (0,4 - 0,7 ms) med en håldiameter som sträcker sig från 4,3 till 9,4 µm, tangentiellt riktat mot zona pellucida och vid en korsning av två intilliggande trophectodermal celler. Låt blastocystan helt eller delvis kollapsa under 5 minuter.
- För obehandlade blastocyster med en intakt blastocoel, utför ingen särskild behandling innan förglasning.
Obs: Dessa blastocyster anses vara intakt.
3. förberedelse av frysskyddmedel och en petriskål för fasen Jämviktstiden
- Användning pithe pipett för äggcell denudation (diameter 135 µm) aseptiskt fylla Jämviktstiden media (M-199 HEPES-buffrat medium med 7,5% DMSO, 7,5% etylenglykol, 20% DSS) in i hål i området microdroplet i en 9-väl petriskål speciellt utformad för Time-lapse Mikroskopi och inspelning.
Obs: Äggcellen denudation är en process för att ta bort cumulus celler kring äggcellen. Användning av en pipett för äggcell denudation hjälper till att undvika skapandet av luftbubblor. - Överlagra microdroplet området med 30 µL av Jämviktstiden media.
4. överföring av Blastocystan i Jämviktstiden lösning
- Dränka behandlade med laser eller intakt blastocyst till Jämviktstiden medium längst ned i området microdroplet i microdroplet skålen under 10 minuter vid rumstemperatur (Jämviktstiden fas).
- Starta en 10-minuters nedräkning så snart blastocystan överförs till Jämviktstiden medium.
5. registrering av Blastocystan på Jämviktstiden fasen
- Överföra microdroplet skålen med blastocystan till kameran-utrustad Mikroskop. Använda samma förstoring som tidigare för att ta en ögonblicksbild av samma blastocystan. Ställning i microdroplet skålen så att blastocystan är placerad ungefär i mitten av inspelningen.
- Starta inspelningen med mikroskopet inspelning programvara. Observera tiden där inspelningen startas.
Obs: Se representativa resultat av inspelningar av en intakt (figur 1, Video 1) och kollapsade blastocyst (figur 2, Video 2) under 10 minuters exponering för en Jämviktstiden lösning.
6. förglasning av blastocysten
- Aseptiskt fördela en 50-µL droppe förglasning lösning (M-199 HEPES-buffrat medium med 15% DMSO, 15% etylenglykol, 20% DSS, 0,5 M sackaros) i en petriskål 2 min innan nedräkningen avslutas.
- Stoppa inspelningen när 10-min nedräkningen avslutas och snabbt överföra blastocystan till förglasning lösning för 30 s vid rumstemperatur.
- Pipettera försiktigt blastocystan minst 1 x inom förglasning lösningen.
- Använd en förglasning halm för lastning blastocystan. Fyll, täta och störta förglasning halm i flytande kväve (LN) inom 80 s, inte överstiger 110 s efter första exponeringen för förglasning lösningen.
7. video redigering av inspelat blastocysten under fasen Jämviktstiden
- Importera en inspelad videofil till videoredigeringsprogram.
- Flytta skjutreglaget tidslinje till 20 s. Obs ramnummer på denna tid.
Obs: Detta nummer ska användas att decimera onödiga bildrutor. Endast ramar var 20 s kommer att användas. - Klicka på fliken Video , sedan bildhastighet.... Under Frame rate conversion, kontrollera Decimate av fältet och ange tidigare noterade ramnummer. Bekräfta genom att klicka på OK. Klicka på filen → Exportera → bildsekvens.
- Välj JPEG som utdataformat, ange katalogen att hålla sparade bildsekvensen och klicka på OK.
Obs: Detta kommer att skapa en katalog med upp till 30 bilder av inspelade blastocystan i sekvens under Jämviktstiden fasen av förglasning.
8. mätningar av den Blastocystan tvärsnittsarea från bilder som har skapats under fasen Jämviktstiden
- Öppna programvaran för videoanalys. Klicka på fliken fönster och välj tidslinje.
- I fönstret tidslinje, klicka på tecknet film strip och välja Lägg till Media... att lägga till en bild av blastocystan innan Jämviktstiden fas av förglasning — och före laser ingripande, om det fanns någon.
Obs: Denna bild visar blastocystan på dess mest expanderade tillståndet och dess tvärsnittsarea kommer att fungera som en referens. - Lägg till bildsekvens av motsvarande blastocysten genereras tidigare med videoredigeringsprogram (av Jämviktstiden fas förglasning).
- Gå till bild → analys → Markera datapunkter → anpassad om du vill öppna fönstret Markera datapunkter .
- Avmarkera alla datapunkter, välj bara område, och bekräfta genom att klicka på OK.
- Flytta skjutreglaget tidslinje i fönstret tidslinje på första bilden.
- Klicka på fliken fönster och välj verktyg.
Obs: Detta kommer att aktivera panelen Verktyg på vänster sida. - Välja snabbval verktyg.
- Placera verktyget markören inuti blastocystan röra kanten av blastocystan. Beskriva blastocystan genom att placera verktyget markören på den blastocystan yttre kanten, att klicka och hålla vänster musknapp och dra verktyget markören längs den blastocystan ytterkant tills hela blastocystens tvärsnittsarea är markerad.
Obs: Zona pellucida är inte en del av mätningen, så måste det uteslutas (figur 5). - I fönstret tidslinje, klicka på Måttloggen och tryck på knappen Registrera mått .
Obs: Detta kommer att registrera det valda området. - Återgå till tidslinjen, högerklicka på bilden och välja avmarkera.
- Flytta skjutreglaget tidslinje till nästa bild och klicka på motsvarande kakel därunder.
- Beskriva blastocystan i den nya bilden med snabb markeringsverktyget. Upprepa mätningen.
- Upprepa denna procedur (steg 8,9-8.13) bild av bilden tills alla bilder tvärsnittsarea mäts och registreras.
- I slutändan gå till mätningar loggen, Välj alla mätningar under variabeln område , och exportera dem i en .txt-fil.
Obs: Enheterna av tvärsnittsarean är fyrkantiga pixlar.
9. redigering av datafilen med inspelade Blastocystens tvärsnittsarea från bilder skapade under fasen Jämviktstiden
- Överföra uppgifter om inspelade blastocystens tvärsnittsarea från txt-filen till ett kalkylblad editor.
- Använd första tvärsnittsarea värdet som referensvärde 1 och express (omformar) alla andra värden att vara en bråkdel av referensvärdet.
- Skapa en ny variabel Area_r och klistra in de konverterade område värdena (utom referensvärdet) under den.
- Bredvid den Area_r variabeln, skapa en tid variabel och lägga till värdet för första gången.
Obs: Första gången värdet representerar den tid som passerat från det ögonblick blastocystan var utsatt till Jämviktstiden lösning att uppkomsten av inspelning i kameran-utrustad Mikroskop. - Beräkna varje nästa gången i rad värde genom att lägga till 20 s till föregående tidsvärde.
Obs: Detta är det tidsintervall som används på decimerar onödiga bildrutor som skapats under inspelningen.
10. uppvärmningen av blastocysten
- Förbered för uppvärmningen.
- En dag innan uppvärmningen blastocysten, fördela aseptiskt tre 150-µL droppar för återhämtning medium i en 4-väl maträtt. Dessutom aseptiskt fördela återhämtning medium i en microdroplet 9-väl maträtt specialdesignad för time-lapse Mikroskopi och inspelning. Täcka återhämtning medium med paraffinolja och preincubate det vid 37 ° C med 6% CO2 och 5% O2.
Obs: Återhämtning medium är en odling medium för blastocyststadiet embryon med extra humant serumalbumin (HSA). HSA återhämtning medium bör 12 mg/mL. För att fylla hålen i 9-väl skålen, Använd en pipett för äggcell denudation för att undvika skapandet av luftbubblor och sedan overlay området microdroplet med 30 µL av återhämtning medium. - På dagen för uppvärmningen blastocysten, aseptiskt Dispensera 500 µL upptining lösning (TS) i en enda brunn av en 4-väl skålen och låt den värmas till 37 ° C i en inkubator utan CO2.
- Vid rumstemperatur, aseptiskt undvara en 50-µL droppe lösningen för spädning (DS) och två 50-µL droppar tvättlösningen (WS) i en steril petriskål. Täck den DS och WS1 och WS2 droppar med paraffinolja.
Obs: I stället för en petriskål, en 4-väl maträtt kan också användas.
- En dag innan uppvärmningen blastocysten, fördela aseptiskt tre 150-µL droppar för återhämtning medium i en 4-väl maträtt. Dessutom aseptiskt fördela återhämtning medium i en microdroplet 9-väl maträtt specialdesignad för time-lapse Mikroskopi och inspelning. Täcka återhämtning medium med paraffinolja och preincubate det vid 37 ° C med 6% CO2 och 5% O2.
- Värma blastocystan.
- Identifiera den HSV droppen med förglasat blastocysten tas bort från LN lagring och snabbt överföra halmen till en LN-fyllda bärbar behållare i förberedelse för värmande förfarandet.
- Lyfta stråna med pincett, precis tillräckligt för att exponera färgade hantering staven. Använd en självjusterande tråd strippa för att klippa stråna på höjden av färgade hantering staven.
- Greppa stången hantering och extrahera den från droppen med en snabb, men ändå kontrollerad rörelse och omedelbart störta den böjda spateln på hantering staven i 37 ° C TS.
- Snurra försiktigt hantering staven för att lossa blastocystan och lämna det i sammanlagt 1 min i TS.
- Vid rumstemperatur, överföra blastocystan i följd till DS, WS1 och WS2 för 4 min i varje medium.
- Efter uppvärmningen ingreppet, överföra blastocystan till en 4-väl maträtt med återhämtning medium och tvätta den i alla tre droppar av försiktigt pipettering det.
Obs: Tvätten utförs i ca 1 min. - Överföra blastocystan till time-lapse 9-väl skålen med återhämtning medium. Placera skålen 9-väl under en time-lapse kamera i en inkubator (vid 37 ° C med 6% CO2 och 5% O2).
Obs: Thre värmande förfarande, som fortsätter med att placera 9-väl skålen under en time-lapse kamera i en inkubator, varar cirka 17 min.
11. time-lapse inspelning av den Blastocyst Re-expansionen under återhämtning efter uppvärmningen
- Kör time-lapse inspelningsprogrammet.
- Välja en inspelning kamera.
- Tryck på knappen Live-läge .
- Placera muspekaren på bilden och Använd bläddra knappen för att förstora den. Klicka och håll vänster musknapp och flytta markören för att placera brunnen med blastocystan i mitten av skärmen.
- Under fokusering, pilarna upp och ner gröna för att fokusera blastocystan inspelning plan. Under ljusintensitet, ställa in ljusstyrkan.
- Klicka på mikroskopet parametrar för att ställa in exponeringstiden och Gamma.
- Tryck på Stäng live-läge.
- Tryck på knappen starta projekt och ange projektdata, Välj vilken kultur maträtt (3 x 3 eller 4 x 4) och avmarkera alla positioner utom den som skall registreras.
- Tidtagningen capture ska ta en bild var 5 minut.
- Starta inspelningen genom att trycka på knappen Godkänn . Spela in minst 150 min.
- Stoppa inspelningen genom att trycka på knappen stoppa projektet .
Obs: Se representativa resultat för inspelning av en intakt (figur 3) och kollapsade blastocyst (figur 4) under återhämtningsperioden efter uppvärmningen.
12. video redigering av inspelat blastocysten under Re-expansion efter uppvärmningen
- Gå till projektmappen och leta upp inspelade bilder som är ungefär 80 KB i storlek.
- Skapa en annan mapp och överför dessa bilder till den. Byt namn på bilder i siffror enligt den tid som skapade. Importera dem till videoredigering programvara som en bildsekvens.
- Gå till fliken Video → Filter → Lägg till och välj Null transform filter.
- Klicka på knappen Beskär på höger sida och beskära bilden, lämnar synliga endast fältet med inspelade blastocystan. Bekräfta med OK och igen med OK.
- Klicka på filen → Exportera → bildsekvens. Välj JPEG som utdataformat, ange katalogen att hålla sparade bildsekvensen och klicka på OK.
Obs: Detta kommer att skapa storleksändrade (beskuren) bilder förberett för ytterligare mätningar i videoanalys programvara.
13. fastställande av en måttskala i videoanalys programvara för de bilder som skapats med programvaran Time-lapse Recording
- Köra Analyzer för time-lapse inspelningsprogrammet.
- Öppna projektet med inspelade blastocystan.
- Klicka på knappen analysera på fältet med de inspelade blastocystan.
Obs: Ett nytt Analyze-fönster öppnas. Klicka på knappen mätning visar mätningsverktyget. - Använd mätningsverktyget för att mäta bredden på hela bilden.
- Högerklicka på bilden och spara den. I egenskaper, kontrollera bildens bredd i pixlar.
- Dela bildens faktiska bredd med dess bredd i pixlar.
Obs: Detta beräknas den faktiska längden på en pixel i denna bild. - Kör video analys programvara.
- Klicka på fliken fönster och välj tidslinje.
- I fönstret tidslinje, klicka på tecknet film strip och välja Lägg till Media... lägga till bildsekvens av efter varma åter expanderande blastocystan.
- Klicka bild → analys → Ange måttskala → anpassad att öppna fönstret måttskala. För Pixel längd, ange 1. för logisk längd, ange den tidigare beräknade faktiska längden på en pixel (steg 13,6); för logiska enheter, ange µm. spara förinställningen.
14. mätningar av den Blastocystan tvärsnittsarea från bilder som har skapats under den Re-expansion efter varmt
- När måttskalan är inställd och den bildsekvens som importeras, mäta den blastocystan tvärsnittsarea på samma sätt som beskrivs i steg 8, med den enda skillnaden är att de uppmätta tvärsnittsarea i dessa mätningar har enheter i µm2 .
15. Redigera av datafilen med inspelade Blastocystens tvärsnittsarea från bilder skapade under den Re-expansion efter varmt
- Överföra uppgifter om inspelade blastocystens tvärsnittsarea från txt-filen till ett kalkylblad editor.
- Skapa en tid variabel intill variabeln område och lägga till värdet för första gången.
Obs: I detta fall den första tiden värdet till 0 minuter, vilket är uppkomsten av time-lapse inspelningen. Varje nästa gången i rad-värde beräknas genom att lägga till 5 minuter tidigare tidsvärde. Fem minuter ligger tidsintervallet mellan två på varandra följande time-lapse inspelningar.
16. skapandet av en linje Diagram
- Importera data kalkylbladsfilen i statistisk analysprogramvara för att skapa en tid tomt den blastocystan tvärsnittsarea förändringar i tid under fasen Jämviktstiden förglasning eller re-expansion efter uppvärmningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en demonstration visade vi blastocysten morphodynamics i endast en previtrification och en efter uppvärmningen fas. En skillnad i den blastocystan volymen i slutet av fasen Jämviktstiden och i början av att återhämta sig i odlingsmedium visade intensiteten av embryo krympning, som är, i själva verket intensiteten av embryo bevarande mot ice kristallisering.
Som det kan märkas från figur 1 och Video 1, intakt blastocysten inte kollapsa helt i Jämviktstiden lösning. Blastocoel minskade endast delvis, men inom 10 minuter, det nådde långsamt re-expansion storleken på 70%. Tvärtemot detta, artificiellt kollapsade blastocysten tömt helt blastocoel omedelbart efter laserbehandling, men i Jämviktstiden lösning, dess volym ändra inte något mer (figur 2, Video 2). Presentationen av blastocoel re-expansion i återhämtning medium (figur 3 och figur 4) med mikrofotografiska och linje diagram visar olika mönster av blastocoel tillväxt. En visning av en enda mätning av tvärsnittsarean på blastocystan visas i figur 5.
I förglasning medium med en högre koncentration av cryoprotectants, intakt blastocyster intensivt krympt en gång medan kollapsade blastocystens var nästan oförändrad. Från en grafisk presentation, med hjälp av protokollet som presenteras här, det är uppenbart att intakt blastocysten genomgår en stegvis minskning av blastocoel (figur 6), en gång i Jämviktstiden lösning och en gång i förglasning medium, medan den kollapsade blastocysten framskridit krympta i början av ingripande med en laser (figur 7). Detta ställer frågan om 10 minuter av Jämviktstiden fas är verkligen nödvändigt för kollapsade blastocyster, eller om denna tidsperiod kan dock förkortas.
Presentationen av blastocoel re-expansion kan vara linjär eller avbruten med flera större eller mindre sammandragningar (figur 8).
Figur 1: Time-lapse microphotography av ändringarna av en intakt blastocysten under exponering för Jämviktstiden lösning. Enstaka bilder spelades in var 20 sekund. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Time-lapse microphotography av ändringarna av ett artificiellt kollapsade blastocysten under exponering för Jämviktstiden lösning. Enstaka bilder spelades in var 20 sekund. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Time-lapse microphotography av ändringarna av en intakt blastocysten under recoverypost-uppvärmningen. Enstaka bilder registrerades varje 5 minuter. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: Time-lapse microphotography av ändringarna av kollapsade blastocyst under recoverypost-uppvärmningen. Enstaka bilder registrerades varje 5 minuter. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: visning av en enda mätning av tvärsnittsarean på blastocyst. Blastocystan omringas noga med lämplig markeringsverktyget i videoanalys programvara. Zona pellucida är alltid undantagna från mätningen. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: Representation av ändringar i tvärsnittsytan av en intakt blastocyst. Dessa paneler visar en representation av ändringar i tvärsnittsytan av en intakt blastocysten under exponering för Jämviktstiden lösning (A) vid förglasning och (B) under återhämtning efter uppvärmningen. Enheterna av tvärsnittsarean är i förhållande till den inledande blastocysten tvärsnittsarea innan förglasning. Den streckade linjen som ansluter paneler A och B är påhittad, representerar förändringar under förglasning, nedkylning till-196 ° C och uppvärmning till 37 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Representation av ändringar i tvärsnittsytan av kollapsade blastocyst. Dessa paneler visar representation av ändringar i tvärsnittsytan av (A) kollapsade blastocyst under exponering för Jämviktstiden lösning (B) på förglasning och (C) under återhämtning efter uppvärmningen. Enheterna av tvärsnittsarean är i förhållande till den ursprungliga blastocysten tvärsnittsarea innan kollapsa och förglasning. Den streckade linjen på panel A är imaginära och representerar start- och slutdatum poängen under den blastocyst kollapsen. Den imaginära streckad linjen mellan paneler B och C, representerar också ändringarna under förglasning, nedkylning till-196 ° C och uppvärmning till 37 ° C. Endast de heldragna linjerna i paneler B och C är resultatet av faktiska mätningar av tvärsnittsarean under Jämviktstiden och återhämtningsprocessen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: grafisk presentation av olika mönster av blastocysten återhämtning efter uppvärmningen. Skalstapeln är 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Video 1: Time-lapse video av ändringarna av en intakt blastocysten under exponering för Jämviktstiden lösning. Videon representerar de förändringar, som nästan 10 minuter i realtid. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Time-lapse video av ändringarna av kollapsade blastocyst under exponering för Jämviktstiden lösning. Videon representerar de förändringar, som nästan 10 minuter i realtid. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet för observation av blastocysten morphodynamics under och efter frysförvaring kan också utföras med hjälp av liknande instrument och verktyg från andra tillverkare. Time-lapse system justerat för embryologi tillåter kontinuerlig övervakning av embryots utveckling. Syftet med detta arbete var att införa kvantifiering av blastocysten beteende under utarbetandet av blastocyster för förglasning och efter sin uppvärmning. Detta skedde genom objektiva mätningen av förändringar i morfologi på en tidsskala. Erhållna resultaten av dessa mätningar kan vara matematiskt analyseras och jämförs med andra resultat. Bland de parametrar som kan följas av protokollet beskrivs förändringar i storleken på blastocystan, dess inre cell massan, blastocoel eller zona pellucida inom en viss tidsperiod. Storleken kan visas som yta i det största blastocysten tvärsnittet, den blastocystan omkrets eller diameter, och, efter beräkning, även som dess volym.
I tidigare studier med time-lapse system, gjordes blastocoel expansion velocity mätningarna endast på färska embryon11. I förglasad/värmde blastocyster, endast den blastocyster storlekar mättes direkt efter uppvärmningen och innan embryotransfer eller tidsperioden analyserades som värmde blastocyster åter utökat till zona pellucida9,10 . Mer detaljerad blastocysten re-expansion dynamics analyserades endast i vår tidigare studie8. I denna studie, har morfometriska protokollet redan använts att spåra hastighet och mönster av blastocysten re-expansioner efter uppvärmningen. Även om dessa blastocysten tillväxt biomarkörer har visat att inte högt prediktivt värde för implantation, kan de användas för jämförelse av blastocysten återvinningspotential efter förglasning och uppvärmningen med olika frysförvaring media och protokoll . Nämligen föreslår de större sammandragningarna av blastocystan under blastocoel re-expansionen svagheten i det trophectodermal lagret som kan orsakas under frysförvaring och dess oförmåga att motstå trycket av den vätskefyllda blastocoel.
Protokollet beskrivs morfometriska kan ge många ytterligare jämförande analyser av blastocysten beteende, inte bara efter frysförvaring, genom att mäta den hastighet och intensitet av förändringar i volym, antalet partiella blastocoel sammandragningar eller totalt blastocysten kollapsar, tid att totala blastocoel re-expansion, eller tid att kläckningen. Dessutom kan det också användas under previtrification faser för att fastställa den mest optimala tidpunkten blastocysten exponering för olika koncentrationer av cryoprotectants, som presenterades i resultatet. Vanderzwalmen et al. visade på möss oocyter som förglasning kan också vara framgångsrik om intracellulära osmotiskt tryck inte når en jämvikt med extern frysskyddmedel lösning12. Fasen bara problematiskt för inspelningen av blastocyster under bevarande är perioden i förglasning lösning på grund av begränsad tid; embryot har att vara utsatt för en högre koncentration av cryoprotectants och packas in i halmen i mindre än 90 sekunder. För dessa mätningar, skulle det vara rekommenderat att använda endast blastocyster som skänks för forskning. Kliniskt tillgängliga blastocyster kan ändå vara inspelade och mätt igen omedelbart efter uppvärmningen, i syfte att iaktta hur de beter sig i utspädning och tvättning lösningar. Omedelbart efter en blastocyst överföring från tvättlösningen till återhämtning medium tenderar blastocyster att flyta från botten. Detta kan utgöra en svårighet i att hålla embryot i samma fokalplan under inspelning. För att lösa detta problem, rekommenderas det att förbereda en maträtt med tillplattad droppar medium. Ett liknande problem har observerats av Vanderzwalmen et al. 12.
Ytterligare forskning vore det bra att undersöka om längden på exponering av artificiellt kollapsade blastocyster för cryoprotectants kunde minskas, att därmed minimera den toxiska effekten av dessa kemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete är en del av programmet-P3-0327 och forskning forskningsprojektet J3-7177, grundades av den slovenska Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
