Summary
Burada blastosist büzülme ve re-Genleşme yoğunluğunu previtrification müdahaleler sonrası ısınma kurtarma sırasında takip etmek ve hızlandırılmış xarakteristikaları iletişim kuralı mevcut. Uygulama Protokolü'nün in vitro fertilizasyon Laboratuvarları ile hızlandırılmış mikroskoplar donatılmış mümkündür ve bir en iyi blastosist vitrifikasyon yöntemi gelişiminde önerilir.
Abstract
Bu makalede önce ve sonra vitrifikasyon bireysel aşamaları sırasında değişen bir blastosist'ın biriminin doğru izleme için hızlandırılmış Mikrofotoğrafi dayalı blastosist morfometri noninvaziv yöntem. Yönteminin blastosist maruz kalma cryoprotectants farklı konsantrasyonlarda en uygun zamanlaması için blastosist büzülme ve re-genişleme farklı öncesi ve sonrası vitrifikasyon aşamaları gözlemleyerek aramada kullanışlı olabilir. Bu metodoloji ile blastosist vitrifikasyon Protokolü getirilebilir. Bu xarakteristikaları yöntem kullanışlılığı daha iyi bir gösteri için iki farklı blastokist hazırlığı protokol vitrifikasyon için karşılaştırılır; çöken bir yapay blastocoel kullanarak ve bu araya vitrifikasyon önce. Hem blastokistlerin cilt değişiklikleri tarafından hızlandırılmış Mikrofotoğrafi takip ve fotoğraf düzenleme yazılımı araçları tarafından ölçülür. Ölçümler her 20 saniyede previtrification aşamasında ve her 5 dakikada sonrası ısınma döneminde alınır. Değişiklikleri zaman birimi başına blastosist boyutlarının satır diyagramlarında grafik olarak sunulmaktadır. Sonuçlar sağlam blastosist ilk küçülür ve sonra yavaş yavaş yenilenir vitrifikasyon ile sıvı dolu blastocoel giren blastocoel, bir uzun denge previtrification faz gösterir. Yapay olarak daraltılmış blastosist küçültülmüş sahne tüm denge faz üzerinden kalır. Vitrifiye aşamasında hacmi de değişmez. Blastosist morfometri yapay olarak daraltılmış blastokistlerin sürekli hacmini previtrification adımı sırasında gösterir, bu bu aşamada daha kısa olabilir görünüyor. Açıklanan protokol sırasında ve sonrasında dondurma hız ve yoğunluk birim değişiklikleri, kısmi blastocoel kasılmalar veya toplam blastosist sayısı temelinde blastosist davranış birçok ek karşılaştırmalı parametreleri sağlar çöker ve bir toplam blastocoel re-genişleme vakti veya tarama için tam zamanı.
Introduction
Vitro fertilizasyon programından (IVF) insan Preimplantasyon embriyo dondurma günümüzde çoğu IVF Laboratuvarı rutin bir uygulamadır. Yavaş embriyo dondurma yöntemi belirli cryoprotectants ve buz çekirdekleşme (tohum) içinde akımıdır zaman kontrollü embriyo-7 ° C, aşağı soğutma etkin bilgisayar kontrollü Dondurucular getirilmesi ile 1985 yılında klinik olarak kullanılmaya başlandı cryoprotective orta1çevreleyen. Sürekli soğutma tarafından buz kristalleri, hyperosmolality kalan sıvı kesir ve sonuç olarak, dehidrasyon neden büyüyecek ve büzülme embriyonik hücreleri. -30 ° C ya da-80 ° C de, embriyolar daha uzun depolama için sıvı azot içine daldı. Embriyo veya yumurta ile soğutma sırasında neler olduğunu dondurma iletişim kuralları2geliştirmeye yardımcı olan sadece özel olarak tasarlanmış cryomicroscopes tarafından gözlenen. Blastokistlerin, yüksek hacimli ve daha fazla sıvı bulunan embriyonik evre dondurulması daha az umut verici klinik sonuçlar o gün3' te verdi.
Giriş hangi hücreleri susuzluktan cryoprotectants4yüksek konsantrasyonda kullanarak soğutma önce gerçekleşti vitrifikasyon yönteminin blastosist dondurma içinde adımdı. Vitrifiye önce blastocoel sıvısını kaldırılması da mekanik açma iki trophectoderm hücreleri5arasında yaparak elde edilebilir. Vitrifiye ve ısınma sonra hemen blastosist sağkalım oranı % 90 ve klinik sonuç aşağıdaki olmasına rağmen Vitrifiye/ısındı blastosist transferi uterin kavite içine taze transferden sonra sonuçları için neredeyse karşılaştırılabilir embriyo, bu dondurma yöntemi henüz gelmedi standart6,7. Vitrifiye protokolleri (a) türü ve konsantrasyon cryoprotectants, (b) previtrification adım sayısını (c) tek tek adımları, (d) ya da değil daha önce vitrifikasyon çöken bir yapay blastocoel kullanımı süresince göre değişir, (e). yöntemleri, (f) blastosist genişleme sahne ve (g) denge/vitrifikasyon sıcaklık embriyo olmalıdır çöken8Vitrifiye. Cryoprotectants hücreler için toksik olabilir bu yana, iyi tanımlanmış blastosist pozlama süresi için bu çözümleri vardır. Ancak, bazı dondurma medya üreticileri çok esnek iletişim kurallarına izin ver.
Bilim adamları ilgi genellikle blastosist re-Genleşme yetenek yeni biyolojik ile daha iyi bir tahmin implantasyon6,9,10bulmak amacı ile çalışmaya odaklanmıştır. Vitrifiye ve Vitrifiye ve ısınma sonra blastokistlerin ile ne olur önce cryoprotectants ekleme farklı adımlar insan blastokistlerin kurutmak, ne zaman cryoprotectants var hücreleri, ve nasıl blastokistlerin suyla temasa kaldırılacak ve Isınma sonra yeniden genişletin, değil de açıklanan ne de anladım. Amaç için bir metodoloji geliştirilmesi ve quantified blastosist davranışını farklı dondurma adımları sırasında izleme, böylece, mantığı olduğunu.
İle hızlandırılmış mikroskoplar çeşitli üreticilerin, şimdi sonrası vitrifikasyon aşamaları ve öncesi içinde blastosist davranışını izlemek mümkündür. Ek bilgisayar araçları dahil ederek, onların büyüklük (morfometri) ölçümleri da gerçekleştirilebilir. Tarafından azalma ölçüm veya belirli bir zamanda embriyo Boyutu'nda artırın morphodynamics embriyo değerlendirilmesi sırasında su kaybı ve rehydration somutlaştırmak mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada 19 Nisan 2016 (No 0120-204/2016-2) Ulusal Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. mikroskop kayıt sistemi kurulumu
- Mikroskop ısıtma yüzeyi dön.
- Herhangi bir tedavi öncesi bir blastosist kamera donanımlı ters mikroskop altında bir fotoğrafını çeker. Hangi blastosist kaydedildi büyütme Not etmeyi unutmayın.
2. seçimi ve blastokistlerin Prepreparation için Vitrifiye
- Sadece tam olarak genişletilmiş gün-5 veya gün-6 blastokistlerin dondurma en az bir kaç iç hücre kitle (ICM) hücreleri ve tutarlı trophectoderm için seçin.
- Lazer tedavi daraltılmış bir blastocoel ile blastokistlerin için konu bir blastosist 4.3 9,4 µm için değişen bir delik çapı ile kısa lazer nabzı (0.4 - 0.7 ms) için yüzeysel yönetmen zona pelusida ve iki bitişik trophectodermal hücrelerinin bir kavşakta. Blastosist tamamen veya kısmen 5 min için daraltmak izin.
- Sağlam bir blastocoel ile tedavi edilmezse blastokistlerin için belirli bir muamale vitrifikasyon önce gerçekleştirin.
Not: Bu blastokistlerin olduğu gibi kabul edilir.
3. Cryoprotectant ve hazırlanması bir petri denge faz için
- Kullanım pithe pipet aseptik denge medya doldurmak yumurta denudation (çapı 135 µm) için (% 7.5 DMSO, % 7.5 etilen glikol, % 20 ile M-199 HEPES tampon orta DSS) için özel olarak tasarlanmış bir 9-şey Petri microdroplet alanının deliklere hızlandırılmış mikroskobu ve kayıt.
Not: Yumurta denudation oosit çevreleyen kümülüs hücreleri çıkarmadan bir süreçtir. Bir pipet kullanım için yumurta denudation hava kabarcıkları oluşturulmasını önlemek için yardımcı olacaktır. - 30 µL denge medya ile microdroplet alanı kaplar.
4. denge çözüm içinde blastosist transferi
- Lazer tedavi ya da sağlam blastosist microdroplet yemek için oda sıcaklığında (denge faz) 10 dk microdroplet alanının altına denge orta daldırın.
- Blastosist denge ortamına aktarılır en kısa zamanda 10dk sayıma başla.
5. kayıt denge faz blastosist
- Blastosist ile microdroplet yemek için kamera donanımlı mikroskop aktarın. Aynı büyütme daha önce aynı blastosist fotoğrafını almak için kullanın. Pozisyon microdroplet çanağı böylece blastosist yaklaşık kayıt ortasına yerleştirilir.
- Kayıt yazılımı mikroskopla kaydetmeye başlamak. Not geri sayım saat, kayıt başladı.
Not: bir denge çözüm 10 dk maruz sırasında kayıtları bir bozulmamış (şekil 1, Video 1) ve daraltılmış blastosist (Şekil 2, Video 2) temsilcisi sonuçlarını görmek.
6. Vitrifiye blastosist
- Aseptik vitrifikasyon çözümde bir petri geri sayım bitmeden 2 dk (M-199 HEPES tampon orta % 15 DMSO, % 15 etilen glikol, %20 DSS, 0,5 M Sükroz ile) bir 50 µL damla dağıtmak.
- Ne zaman 10 dakika geri sayım biter ve hızlı bir şekilde vitrifikasyon çözüm için 30 blastosist transferi kaydı durdurmak s, oda sıcaklığında.
- Yavaşça blastosist pipette vitrifikasyon çözümünde en az 1 x.
- Vitrifiye saman blastosist yüklemek için kullanın. Yük, mühür ve saman vitrifikasyon 80 içinde sıvı azot (LN) içine dalma 110 geçmeyen s, s vitrifikasyon çözüm için ilk maruz kaldıktan sonra.
7. video kaydedilen blastosist denge aşamasında düzenleme
- Kaydedilmiş bir video dosyası video düzenleme yazılımı alın.
- Zaman çizelgesi şu anda 20 s. Not çerçeve numarası için kaydırıcıyı.
Not: Gereksiz video kareleri büyük kısmını yok için bu numara kullanılır. Sadece her 20 kare s-var olmak kullanılmış. - Sonra kare hızı... Video sekmesini tıklatın. Çerçeve hızı dönüşümüaltında Decimate tarafından alanını denetleyin ve daha önce belirtilen çerçeve numarası girin. Tamam'ıtıklatarak onaylayın. Tıklayın dosya → → ihracat görüntü sırası.
- JPEG olarak çıktı biçimini seçin, görüntü kaydedilmiş dizisi tutan dizin ayarla ve Tamam' ı tıklatın.
Not: Bu bir dizin kaydedilen blastosist 30 görüntüleri ile sırayla vitrifikasyon denge aşamasında oluşturur.
8. ölçümleri denge aşamasında oluşturulan görüntüler üzerinden blastosist'ın kesit alanı
- Video analiz yazılımını açın. Pencere sekmesini tıklatıp zaman çizelgesiseçin.
- Zaman çizelgesi bölmesinde, film şeridi işaretini tıklayın ve Vitrifiye denge faz önce blastosist görüntüsünü eklemek için Ekle medya... seçin — ve daha önce hiç olsaydı lazer müdahalesi.
Not: Bu görüntü en genişletilmiş durumuna, blastosist gösterecektir ve onun kesit alanı bir referans olarak görev yapacak. - Daha önce oluşturulan video düzenleme yazılımı (vitrifikasyon denge faz) ile ilgili blastosist görüntü sırası ekleyin.
- Görüntü → analiz → Veri noktalarını Seç → gidin veri noktalarını seçin penceresini açmak için özel .
- Tüm veri noktaları, seçimini kaldırın, ardından yalnızca alan, seçin ve Tamam'ıtıklatarak onaylayın.
- Zaman çizelgesi zaman çizelgesi penceresinde ilk resme kaydırıcıyı.
- Pencere sekmesini tıklatın ve Araçlar.
Not: Bu Araçlar panelinin sol tarafındaki devreye giriyor. - En Hızlı Seçim aracınıseçin.
- Aracı işaretçisi blastosist kenarına dokunmak blastosist içinde konumlandırın. Blastosist'ın dış kenarı tıklayarak üzerinde araç işareti yerleştirerek blastosist anahat ve sol fare düğmesine basılı tutarak ve aracı işaretçisi blastosist'ın dış kenarı boyunca bütün blastosist'ın kesit alanı kadar sürükleyerek seçilir.
Not: Zona pelusida değildir (şekil 5) ölçümü, o olmalı ki bir parçası hariç. - Zaman çizelgesi penceresinde Ölçü Günlüğü ' nü tıklatın ve Ölçümleri düğmesine basın.
Not: Bu seçili alanı kaydeder. - Çizelgesine geri dönmek, sağ tıklayın ve Seçimi Kaldırseçin.
- Zaman çizelgesi kaydırıcıyı sonraki görüntüye ve karşılık gelen kutunun altındaki üzerindeki'ı tıklatın.
- Hızlı Seçim aracıyla yeni resim blastosist anahat. Ölçüm yineleyin.
- Tüm görüntüleri kesitsel alanları ölçülen ve kaydedilen kadar (Adım 8.9-8.13) tarafından görüntü bu yordamı yineleyin.
- Sonunda, ölçümleri oturum açmak için alan değişken altında tüm ölçüleri seçin ve onları bir .txt dosyasına gidin.
Not: Kare pikseller kesit alanı birimleridir.
9. görüntülerden kaydedilen blastosist'ın kesitsel alanları ile veri dosyasının düzenlenmesi oluşturuyorlardı denge aşamasında
- Kaydedilen blastosist'ın kesitsel alanları .txt dosyasından bir elektronik tablo editörüne baðlamanýz gerekebilir.
- Diğer değerleri bir kısmını olmak değerine başvuruda bulunan ilk kesit alanı değer olarak referans değeri 1 ve hızlı (dönüşüm) kullanın.
- Yeni bir değişken Area_r oluşturmak ve altındaki (dışında referans değeri) transcoded alan değerlerini yapıştırın.
- Area_r değişken yanındaki bir zaman değişken oluşturmak ve ilk zaman değeri ekleyin.
Not: İlk zaman değeri denge çözüm için kayıt kamera donanımlı mikroskop altında başlangıcı blastosist maruz kalmış andan itibaren geçen zamanı gösterir. - 20 ekleyerek sonraki her ardışık zaman değeri hesaplamak için önceki zaman değeri s.
Not: Bu kayıt sırasında oluşturulan gereksiz video kareleri yok kullanılan zaman aralığıdır.
10. ısınma blastosist
- Medya ısınma için hazırlayın.
- Bir gün önce blastosist ısınma aseptik kurtarma orta bir 4-şey tabak içinde üç 150-µL damla dağıtmak. Ayrıca, aseptik kurtarma aracı olarak hızlandırılmış mikroskopi için özel olarak tasarlanmış ve kayıt bir microdroplet 9-iyi yemek dağıtmak. Kurtarma orta parafin yağı ile kapak ve 37 ° c % 6 CO2 ve %5 O2preincubate.
Not: Kurtarma orta eklendi insan serum albumin (HSA) ile blastosist aşaması embriyo için yetiştirme ortamıdır. HSA kurtarma Orta 12 mg/mL olması gerekir. 9-iyi çanak delik doldurmak için hava kabarcıkları oluşturulmasını önlemek için yumurta denudation için bir pipet kullanın sonra kurtarma orta 30 µL microdroplet alanıyla yerleşimi. - Blastosist ısınma gün, aseptik çözüm (TS) tek bir iyi bir 4-şey tabak çözdürme 500 µL dağıtmak ve 37 ° C CO2olmadan bir kuluçka ısıtmak izin vermek.
- Oda sıcaklığında bir 50 µL damla seyreltme çözüm (DS) ve iki 50 µL damla, çözüm (WS) yıkama aseptik steril Petri kabına içinde dağıtmak. DS ve WS1 ve WS2 damla parafin yağı ile kapak.
Not: bir petri yerine, bir 4-iyi yemek de kullanılabilir.
- Bir gün önce blastosist ısınma aseptik kurtarma orta bir 4-şey tabak içinde üç 150-µL damla dağıtmak. Ayrıca, aseptik kurtarma aracı olarak hızlandırılmış mikroskopi için özel olarak tasarlanmış ve kayıt bir microdroplet 9-iyi yemek dağıtmak. Kurtarma orta parafin yağı ile kapak ve 37 ° c % 6 CO2 ve %5 O2preincubate.
- Blastosist sıcak.
- HSV saman LN depodan kaldırılması ve hızlı bir şekilde bir LN dolu taşınabilir rezervuar ısınma yordamı için hazırlık için saman aktarmak için Vitrifiye blastosist tanımlar.
- Forseps ile saman kaldırmak renkli işleme çubuk ortaya çıkarmak yeterli. Kendi kendine ayarlanan tel striptizci saman renkli işleme çubuk yükseklikte kesmek için kullanın.
- İşleme çubuk yakala ve hızlı henüz kontrollü hareketi ile saman ayıklamak ve hemen işleme çubuk eğri spatula 37 ° C TS Dalma.
- Yavaşça blastosist ayırmak ve TS 1 min Toplam bırakmak için işleme çubuk girdap.
- Oda sıcaklığında blastosist arka arkaya DS, WS1, WS2 transfer için ve her ortamda 4 dk için.
- Sonra ısınma yordam kurtarma ortamı ile bir 4-iyi yemek için blastosist transferi ve yavaşça pipetting tarafından tüm üç damla yıkayın.
Not: Çamaşır yaklaşık 1 dk içinde gerçekleştirilir. - Blastosist kurtarma orta ile hızlandırılmış 9-iyi çanak aktarın. Hızlandırılmış bir kamera altında 9-iyi bulaşık kuluçka (37 ° C'de % 6 CO2 ve %5 O2) yerleştirin.
Not: 9-iyi çanak hızlandırılmış bir kamera altında bir kuluçka makinesine yerleştirerek ile devam ediyor, Thre ısınma yordamı yaklaşık 17 dakika sürer.
11. hızlandırılmış kayıt blastosist Re-genişleme sonrası kurtarma ısınma sırasında
- Hızlandırılmış kayıt yazılımı çalıştırın.
- Bir kayıt kamera seçin.
- Live modu düğmesine basın.
- Fare imlecini resmin üzerine yerleştirin ve büyütmek için kaydırma düğmesini kullanın. ' I tıklatın ve sol fare tuşunu basılı tutun ve blastosist ekranın ortasında ile iyi bir yer için imleci hareket ettirin.
- Odaklamaaltında blastosist kayıt boyutunda odaklanmak için yukarı-aşağı yeşil okları kullanın. Altında ışık şiddeti, ışık yoğunluğunu ayarlayın.
- Çekim hızı ve gama ayarlamak için mikroskop parametreleri düğmesini tıklatın.
- Canlı modunu kapattuşuna basın.
- Proje Başlat düğmesine basın ve proje verilerini girin, kültür çanak tipi (3 x 3 ya da 4 x 4) seçin ve kaydedilecek olan hariç tüm pozisyonlar işaretini kaldırın.
- Her 5 dakikada bir resim çekmek için yakalama zamanlamayı ayarlamak.
- Onayla düğmesine basarak kaydı başlatın. En az 150 dk kaydedin.
- Proje Stop düğmesine basarak kaydı durdurmak.
Not: bir bozulmamış (şekil 3) ve daraltılmış blastosist (şekil 4) kayıt sonrası ısınma iyileşme süresi sırasında temsilcisi sonuçlarını görmek.
12. video kaydedilen blastosist Re-genişleme sonrası ısınma sırasında düzenleme
- Proje klasörüne gidin ve aşağı yukarı 80 KB boyutunda kaydedilen görüntüleri bulun.
- Başka bir klasör oluşturun ve bu görüntüleri içine aktarabilir. Oluşturulan zamana göre rakamlarla görüntüleri yeniden adlandırmak. Bunları video düzenleme yazılımı görüntü sırası olarak alabilirsiniz.
- Video sekmesini → filtre → gidin Ekle ve select Null dönüştürme filtresi.
- Sağ tarafındaki kırpma düğmesini tıklatın ve yalnızca alan ile kaydedilen blastosist görünür bırakarak Görüntüyü kırpmak. Tamam ve tekrar OKile onaylayın.
- Tıklayın dosya → → ihracat görüntü sırası. JPEG olarak çıktı biçimini seçin, görüntü kaydedilmiş dizisi tutan dizin ayarla ve Tamam' ı tıklatın.
Not: Bu daha fazla ölçüm sonuçları video analiz yazılımı için hazırlanan yeniden boyutlandırılmış (kırpılabilir) görüntüleri oluşturur.
13. bir ölçü ölçeği için hızlandırılmış kayıt yazılımı ile oluşturulan görüntüler Video analiz yazılım ayarı
- Hızlandırılmış kayıt yazılımı Analyzer çalıştırın.
- Proje ile kaydedilen blastosist açın.
- Kaydedilen blastosist alanıyla Analyze butonuna tıklayın.
Not: Yeni bir analiz pencere açılacaktır. Ölçü aracı göstermek için Ölçüm düğmesini tıklatın. - Tüm görüntünün genişliğini ölçmek için ölçü aracını kullanın.
- Sağ tıklayın ve kaydedin. Özellikleri'nde, resmin genişliği piksel cinsinden denetleyin.
- Resmin gerçek genişliği piksel cinsinden genişliğini ile bölün.
Not: Bu tek bir piksel görüntü bu gerçek uzunluğunu hesaplar. - Video analiz yazılımı çalıştırın.
- Pencere sekmesini tıklatıp zaman çizelgesiseçin.
- Zaman çizelgesi bölmesinde, film şeridi işaretini tıklayın ve Eklemek medya... sonrası sıcak yeniden genişleyen blastosist görüntü sırası eklemek için seçin.
- Tıklatın görüntü → analiz → Ölçüm ölçeği ayarla → özel ölçü ölçeği penceresini açın. Piksel uzunluğu için 1 girin; Mantıksal uzunluğu için bir piksel (adım 13,6); önceden hesaplanmış gerçek uzunluğunu girin Mantıksal birimleri için hazır ayarı Kaydet'i µm. girin.
14. Re-genişleme sonrası sıcak sırasında oluşturulan görüntüler üzerinden blastosist'ın kesit alanı ölçümleri
- Ölçü ölçeği ayarlamak ve içe aktarılan görüntü sırası olduğunda, blastosist'ın kesitsel alanları bu ölçümler ölçülen kesit alanlarında µm2 adet var o varlık adım 8, tek fark ile açıklandığı gibi aynı şekilde ölçmek .
15. görüntülerden kaydedilen blastosist'ın kesitsel alanları ile veri dosyasının düzenlenmesi sırasında Re-genişleme sonrası sıcak oluşturuyorlardı
- Kaydedilen blastosist'ın kesitsel alanları .txt dosyasından bir elektronik tablo editörüne baðlamanýz gerekebilir.
- Bir zaman değişkenin yanında alan değişkeni oluşturun ve ilk zaman değeri ekleyin.
Not: Bu durumda, hızlandırılmış kayıt başlangıcı olduğu 10 dakika için ilk zaman değeri ayarlanır. Sonraki her ardışık zaman değeri 5 dakika önceki zaman değeri için ekleyerek hesaplanır. Beş dakikadır iki ardışık zaman hata kayıtları arasında kullanılan saat aralığı.
16. bir satır diyagram oluşturulması
- Vitrifiye veya re-genişleme sonrası ısınma denge aşaması sırasında zamanında bir zaman komplo blastosist'ın kesit alanı değişiklikleri oluşturmak için elektronik tablo veri dosyasını istatistiksel analiz yazılımı almak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir gösteride blastosist morphodynamics tek bir previtrification ve bir sonrası ısınma aşama gösterdi. Blastosist'ın birimindeki bir fark denge aşamasının sonunda ve başında kültür aslında, embriyo büzülme yoğunluğunu gösterdi ortamda buz kristalizasyon karşı embriyo korunması yoğunluğunu kurtarma.
Şekil 1 ve Video 1fark olabilir gibi sağlam blastosist denge çözümde tamamen çökmedi. Blastocoel yalnızca kısmen sözleşmeli, ancak 10 dakika içinde yavaş yavaş % 70 re-genişleme boyutunu ulaştı. Bu, aksine yapay olarak daraltılmış blastosist tamamen blastocoel hemen sonra lazer tedavisi boşalttı. ama denge çözümde herhangi bir daha fazla (Şekil 2, Video 2) hacmi değişmedi. Blastocoel re-genişleme kurtarma ortamda sunumu (şekil 3 ve şekil 4) hattı ile microphotographs ile diyagramları farklı desenler blastocoel büyüme gösterir. Bir ekran blastosist kesit alanı tek bir ölçüm şekil 5' te gösterilmiştir.
Daraltılmış blastosist'ın cilt hemen hemen değişmeden kaldı vitrifikasyon ortamı cryoprotectants daha yüksek bir konsantrasyon ile sağlam blastokistlerin yoğun bir şekilde bir kez daha, funda. Grafik sunudan, burada anlatılan protokolünü kullanarak bu bozulmamış blastosist kademeli azaltma blastocoel (şekil 6), bir kez denge çözüm ve Vitrifiye orta bir kez geçer açıktır süre bir lazer (Şekil 7) ile müdahale başında küçülmüş bir aşamaya ulaştı blastosist çöktü. Bu soru 10 dakikadır denge faz için daraltılmış blastokistlerin gerçekten gerekli veya bu süre kısaltılmış teşkil etmektedir.
Sunu blastocoel re-genişleme doğrusal veya birkaç daha büyük veya daha küçük kasılma (şekil 8) ile kesintiye uğramış olabilir.
Şekil 1: denge çözüm maruz sırasında sağlam bir blastosist değişiklikleri hızlandırılmış Mikrofotoğrafi. Tek görüntüleri her 20 saniyede kaydedildi. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: bir yapay olarak daraltılmış blastosist denge çözüm maruz sırasında değişiklikleri hızlandırılmış Mikrofotoğrafi. Tek görüntüleri her 20 saniyede kaydedildi. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir bozulmamış blastosist recoverypost ısınma sırasında değişiklikleri hızlandırılmış Mikrofotoğrafi. Tek görüntüleri her 5 dakikada kaydedildi. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: daraltılmış blastosist recoverypost ısınma sırasında değişiklikleri hızlandırılmış Mikrofotoğrafi. Tek görüntüleri her 5 dakikada kaydedildi. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: bir blastosist kesit alanı tek bir ölçüm ekran. Blastosist dikkatle uygun seçim aracı video analiz yazılımı ile çevrili. Zona pelusida her zaman ölçüm söz konusu değildir. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: sağlam bir blastosist kesiti değişimler gösterimini. Bu paneller sağlam bir blastosist kesiti değişimler Vitrifiye ve (B) denge çözüm(a)maruz sırasında kurtarma sonrası ısınma sırasında gösterir. Vitrifiye önce ilk blastosist'ın kesit alanı göre kesit alanı birimleridir. Paneller A ve B bağlanma Kesikli çizgi hayali, Vitrifiye,-196 ° C'ye soğutma ve 37 ° C'ye ısınma sırasında değişiklikleri temsil eden Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: daraltılmış blastosist kesiti değişimler gösterimini. Bu paneller değişiklikleri (A) bir daraltılmış blastosist denge çözüm (B) vitrifikasyon maruz sırasında ve (C) kesiti sonrası kurtarma ısınma sırasında gösterir. Kesit alanı ilk blastosist'ın kesit alanı göre daraltma ve Vitrifiye önce birimleridir. Kesikli çizgi A masasında hayali ve blastosist çöküşü sırasında başlangıç ve bitiş noktası temsil eder. Ayrıca B - C, paneller arasında hayali Kesikli çizgi temsil eden değişiklikleri Vitrifiye,-196 ° C'ye soğutma ve 37 ° C'ye ısınma sırasında Sadece düz çizgiler panelleri B ve C denge ve kurtarma işlemi sırasında kesit alanının gerçek ölçümler sonucu oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: farklı desenler blastosist kurtarma grafik sunumunu ısınma sonra. Ölçek çubuğu 100 µm. mı Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: denge çözüm maruz sırasında sağlam bir blastosist değişiklikleri hızlandırılmış video. Video son neredeyse 10 dakika içinde gerçek-zaman değişiklikleri temsil eder. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Video 2: daraltılmış blastosist denge çözüm maruz sırasında değişiklikleri hızlandırılmış video. Video son neredeyse 10 dakika içinde gerçek-zaman değişiklikleri temsil eder. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İletişim kuralı gözlem altında blastosist morphodynamics sırasında ve sonra dondurma da benzer aletler ve diğer üreticilerin yazılım araçları kullanılarak yapılabilir. Hızlandırılmış sistemleri Embriyoloji için ayarlanabilir sürekli embriyo gelişimi izleme izin verir. Bu çalışmanın amacı blastosist davranış miktar Vitrifiye ve onların ısınma sonra blastokistlerin hazırlanması sırasında tanıtmak oldu. Bu kara delik bir zaman ölçeği üzerindeki değişiklikleri nesnel ölçümü tarafından yapıldı. Bu ölçümler elde edilen sonuçları matematiksel analiz ve diğer sonuçları ile karşılaştırıldığında. Açıklanan iletişim kuralı tarafından takip edilebilir parametreler arasında blastosist boyutunu değişimler, kendi iç hücre kütlesi, blastocoel veya zona pelusida belirli bir süre içinde. Boyutu en büyük blastosist kesit, blastosist çevresi veya çapı ve hacmi olarak bile hesaplama sonra yüzey alanı olarak görüntülenebilir.
Hızlandırılmış sistemleri kullanarak önceki çalışmalarda sadece taze embriyolar11tarihinde blastocoel genişleme hızı ölçümleri yapılmıştır. Vitrifiye/sıcak blastokistlerin içinde yalnızca blastokistlerin boyutları hemen sonra ısınma ve embriyo transferi önce ölçüldü veya zaman dilimi analiz edildi, zona pelusida9' a,10 yeniden genişletilmiş blastokistlerin ısındı . Daha ayrıntılı blastosist re-Genleşme dynamics sadece bizim önceki çalışma8' analiz edildi. Bu çalışmada, xarakteristikaları Protokolü zaten ısınma sonra hız ve blastosist re-Açılımları desenini izlemek için kullanılmıştır. Bu blastosist büyüme biyolojik implantasyon için yüksek bir tahmini değeri olmayacak şekilde göstermiştir rağmen onlar blastosist kurtarma potansiyel karşılaştırma için Vitrifiye ve farklı dondurma medya ve iletişim kuralları ile ısınma sonra kullanılabilir . Yani, blastosist büyük kasılmalar blastocoel re-genişleme sırasında dondurma ve sıvı dolu blastocoel tarafından yapılan basınç dayanacak şekilde onun yetersizlik sırasında neden olabilir trophectodermal katman zayıflığını öneririz.
Açıklanan xarakteristikaları Protokolü sadece dondurma sonra cilt, kısmi blastocoel kasılmalar veya toplam sayısını değişimler yoğunluğu ve hız ölçerek birçok ek karşılaştırmalı Değerlendirmeler blastosist davranışının sağlayabilir Toplam blastocoel re-genişleme vakti veya kuluçka süresi blastosist daraltır. Ayrıca, bu da sonuçları sunulan gibi blastosist maruz cryoprotectants, farklı konsantrasyonlarda için en uygun zamanlama belirlemek için previtrification aşamaları sırasında kullanılabilir. Vanderzwalmen ve ark. fareler yumurta üzerinde o vitrifikasyon da hücre içi osmotik basınç bir denge ile dış cryoprotectant çözüm12ulaşmak değilse başarılı olabilir gösterdi. Sadece sorunlu blastokistlerin kayıt sırasında korunması için sınırlı bir süre nedeniyle vitrifikasyon çözüm dönemde aşamasıdır; embriyo cryoprotectants daha yüksek bir konsantrasyon maruz ve saman az 90 saniye içinde paketlenmiş gerekiyor. Bu ölçümler için bu hibe blastokistlerin araştırma için kullanmak için tavsiye edilir. Bununla birlikte, klinik olarak kullanılabilir blastokistlerin hemen sonra tekrar ölçülen ve kaydedilen seyreltme içinde nasıl davranıyorlar gözlemlemek amacı ile ısınma ve çözümler yıkama olabilir. Hemen bir blastosist transferi sonra yıkama çözüm kurtarma ortamı için blastokistlerin alt float eğilimindedir. Bu embriyo kayıt sırasında aynı odak düzlemi içinde tutarak bir zorluk temsil edebilir. Bu sorunu çözmek için orta düzleştirilmiş damla ile bir yemek hazırlamak için önerilir. Benzer bir sorun Vanderzwalmen vd tarafından gözlenen 12.
Daha fazla araştırma, sonuç olarak bu kimyasalların toksik etkisini en aza indirerek yapay olarak daraltılmış blastokistlerin maruz kalma cryoprotectants uzunluğu azaltılabilir olup olmadığını keşfetmek yararlı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser araştırma programı P3-0327 ve araştırma projesi J3-7177, Sloven Araştırma Vakfı tarafından kurulan bir parçasıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
