Summary
Здесь мы представляем покадровой морфометрические протокол следовать интенсивность бластоциста усадки и ре расширение во время previtrification вмешательства и после потепления восстановления. Применение протокола возможен в в пробирке оплодотворение лаборатории, оснащенные покадровой Микроскопы и рекомендуется в разработке оптимальной бластоциста витрификации метода.
Abstract
Эта статья описывает метод неинвазивной бластоциста морфометрия, основанные на промежуток времени микрофотографирование для точного мониторинга бластоциста тома меняется на отдельных этапах до и после витрификации. Метод может быть полезным в поисках наиболее оптимальных сроках бластоциста воздействия различных концентрациями криопротекторов, наблюдая бластоциста усадки и ре расширение в различных до и после витрификации фазы. С этой методологией протокол витрификации бластоцисты могут быть оптимизированы. Для лучшей демонстрации полезности этого метода морфометрических сравниваются два разных бластоциста подготовка протоколов для витрификации; один с использованием искусственных blastocoel рушится и один без этого вмешательства до витрификации. Оба изменения объема бластоцисты следуют промежуток времени микрофотографирование и измеряется инструменты для редактирования фотографий программного обеспечения. Измерения проводятся каждые 20 секунд в previtrification фаз и каждые 5 минут в период после потепления. В линии диаграммы графически представлены изменения размеров бластоциста за единицу времени. Результаты показывают фазы previtrification длинный уравновешивания, в котором нетронутыми бластоциста сначала сжимается и затем медленно заправки blastocoel, введя стеклования с blastocoel, заполненные жидкостью. Искусственно рухнул бластоциста остается в стадии усохшие через весь уравновешивания фазу. Во время этапа витрификации он также не изменяет его объем. Так как бластоциста морфометрия показывает постоянный объем искусственно рухнул бластоцист на этапе previtrification, кажется, что этот этап может быть короче. Описывается протокол предоставляет множество дополнительных сравнительных параметров бластоциста поведения во время и после криоконсервирования на основе скорости и интенсивности изменений объема, количество частичной blastocoel схватки или всего бластоцисты рушится и время для всего blastocoel re расширению или время для штриховки.
Introduction
Криоконсервация эмбрионов человека Предимплантационная от в vitro программы оплодотворения (IVF) является в настоящее время обычной практикой в большинстве лабораторий Эко. Медленно эмбриона замораживания метод начал клинически использоваться в 1985 году, с введением конкретных криопротекторов и компьютерным управлением морозильных камер, которые позволили контролируемого охлаждения эмбрионов до-7 ° C, когда вызывали нуклеации льда (посев) окружающие криозащитных средних1. Путем непрерывного охлаждения, будут расти кристаллы льда, вызывая hyperosmolality оставшиеся жидкой фракции и, следовательно, обезвоживания и усадки эмбриональных клеток. При-30 ° C или ° C-80 эмбрионы будет ввергнута в жидкого азота для более длительного хранения. Что происходит с яйцеклеток или эмбрионов во время охлаждения можно наблюдать только в специально адаптированных cryomicroscopes, который помог улучшить криоконсервирования протоколы2. Замораживание бластоцисты, больший объем и более жидкости содержатся эмбриональной стадии, дал менее перспективным клинические результаты в эти дни3.
Прорыв в криоконсервирования бластоциста было введение витрификации метода, в котором обезвоживания клеток имела место до охлаждения с помощью высоких концентраций криопротектора4. Удаления жидкости из blastocoel до стеклования можно также добиться путем механического открытия между двумя трофоэктодерму клетки5. Хотя непосредственной бластоциста выживаемость после витрификации и потепление выше 90% и после клинических исходов передачи стеклообразное/утепленные бластоцисты в полость матки почти сопоставимо с результаты после передачи свежих эмбрионов, этот метод криоконсервирования еще не стандартизированных6,7. Витрификация протоколы зависимости (типа и концентрации криопротектора, (b количество previtrification шагов, (c) продолжительность отдельных шагов, (d) использование искусственного blastocoel, рушится перед витрификации или нет, (e). рушится на котором эмбрионы должны быть методы, стадии бластоцисты расширения (f) и (g) температура уравновешивания/витрификации стеклообразное8. Так как криопротекторов могут быть токсичны для клеток, время экспозиции бластоциста этих решений имеет быть четко определены. Однако некоторые производители криоконсервирования СМИ позволяют очень гибкие протоколы.
Интерес ученых обычно сосредоточена на изучении бластоциста ре расширение способности с целью найти нового биомаркерами с лучше прогноз имплантации6,9,10. Как человека бластоцисты обезвоживают на различные этапы добавления криопротекторов перед витрификация и что происходит с бластоцисты после витрификации и потепления, когда криопротекторов должны быть удалены из клетки, и как бластоцисты увлажняет и повторно разверните после потепления, не очень хорошо описал не понял. Таким образом, обоснование является разработка методологии для цели и количественных мониторинг бластоциста поведения во время различных криоконсервирования шаги.
С покадровой Микроскопы различных производителей это теперь возможно контролировать поведение бластоцисты в до и после витрификации фазы. Включив дополнительные компьютерные инструменты, могут также выполняться измерения их размера (морфометрия). Измерении уменьшение или увеличение размера эмбриона на данный момент, это позволяет объективизировать оценки morphodynamics эмбрионов во время обезвоживания и регидратации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены Национальный комитет медицинской этики на 19 апреля 2016 (№ 0120-204/2016 – 2).
1. Установка системы записи микроскопа
- Выключите нагревательная пластинка микроскопа.
- Перед началом любого лечения сделать снимок бластоциста под камеры оборудованных инвертированным микроскопом. Не забудьте отметить увеличение, на которой был записан бластоциста.
2. отбор и предподготовки бластоцисты для витрификации
- Выберите только полностью расширенной день-5 или 6 день бластоцисты криоконсервирования с по крайней мере несколько внутренних ячейки массы (ICM) клетки и сплоченной трофоэктодерму.
- Для лазер лечение бластоцист с рухнул blastocoel тема бластоциста для короткого лазерного импульса (0,4 - 0,7 мс) с отверстием диаметром от 4,3 до 9,4 мкм, вскользь направлена на zona pellucida и на стыке двух прилегающих trophectodermal клеток. Разрешить бластоцисты полностью или частично свернуть на 5 мин.
- Для без лечения бластоцист с нетронутыми blastocoel выполняют не конкретного лечения перед витрификации.
Примечание: Эти бластоцисты, считаются неповрежденными.
3. Подготовка криопротектора и Петри блюдо для этапа уравновешивания
- Использование pithe дозатор для ооцитов денудации (диаметр 135 мкм) фасовать уравновешивания СМИ (M-199 HEPES-амортизированное средний с 7,5% ДМСО, 7,5% этиленгликоля, 20% DSS) в отверстия микрокапель области 9-Ну Петри, специально разработанные для покадровой микроскопии и записи.
Примечание: Ооцитов денудации представляет собой процесс удаления кучевые клеток, окружающих ооцитов. Использование пипетки для ооцитов денудации поможет избежать создания воздушных пузырьков. - Наложение области микрокапель с 30 мкл уравновешивания средств массовой информации.
4. Передача бластоцисты в растворе уравновешивания
- Погружаться лазерное лечение или нетронутыми бластоцисты в средство уравновешивания в нижней части области микрокапель микрокапель блюдо для 10 мин при комнатной температуре (уравновешивания фаза).
- Начните отсчет 10-мин, как только бластоциста передается средство уравновешивания.
5. запись бластоциста на этапе уравновешивания
- Передать микрокапель блюдо с бластоциста оборудованные камеры микроскопа. Используйте же увеличение как ранее снимок же бластоциста. Положение микрокапель блюдо, так что бластоциста расположен примерно в центре записи.
- Начните запись с микроскопом, записи программного обеспечения. Примечание время обратного отсчета, с которой начинается запись.
Примечание: Представитель результаты записей нетронутыми (рис. 1, 1 видео) и рухнул бластоцисты (рис. 2, 2 видео) во время 10-мин экспозиции для уравновешивания решения.
6. витрификация бластоциста
- Асептически обойтись 50 мкл капля раствора стеклования (M-199 HEPES-амортизированное средний с 15% ДМСО, этиленгликоля и 15%, 20% DSS, 0,5 М сахарозы) в чашку Петри 2 мин до окончания обратного отсчета.
- Остановить запись когда отсчет 10-мин заканчивается и быстро передавать бластоциста витрификации решение для 30 s при комнатной температуре.
- Аккуратно Пипетка бластоциста по крайней мере 1 x в рамках решения витрификации.
- Используйте витрификации соломы для загрузки бластоциста. Загрузки, уплотнение и ввергнуть витрификации соломы в жидкий азот (LN) в пределах 80 s, не более 110 s после первоначального воздействия витрификации решение.
7. видео Редактирование записанных бластоцисты на этапе уравновешивания
- Импортируйте файл записанного видео в видео редактирования программного обеспечения.
- Переместите ползунок шкалы времени 20 s. Примечание номер кадра на данный момент.
Примечание: Этот номер будет использоваться для уничтожать ненужные кадры. Только кадры каждые 20 s будет использоваться. - Нажмите вкладку « видео », затем Частота кадров.... В разделе преобразования частоты кадровпроверьте поле Decimate по и введите номер кадра отмечалось ранее. Подтвердите, нажав кнопку ОК. Выберите файл → → Экспорт последовательности изображений.
- Выберите JPEG в качестве выходного формата, задать каталог для хранения сохраненной последовательности изображений и нажмите кнопку ОК.
Примечание: Это создаст каталог с до 30 изображений записанные бластоцисты в последовательности на этапе уравновешивания витрификации.
8. измерения бластоциста сечение от изображения, созданные на этапе уравновешивания
- Открываете видео анализ программного обеспечения. Перейдите на вкладку окна и выберите временная шкала.
- В панели Timeline, нажмите на знак газа фильм и выбрать Добавить СМИ... , чтобы добавить изображение бластоциста до этапа уравновешивания витрификации — и до лазерного вмешательства, если есть любые.
Примечание: Это изображение будет показывать бластоцисты на ее наиболее развернутом состоянии и его площадь поперечного сечения будет служить в качестве ссылки. - Добавьте последовательность изображений соответствующего бластоцисты, созданные ранее с видео редактирования программного обеспечения (фазы уравновешивания стеклования).
- Перейти на изображение → анализ → Выделить точки данных → Custom для открытия окна Выбор точек данных .
- Отмените выбор всех точек данных, а затем выберите только области и подтвердите, нажав кнопку ОК.
- Переместите ползунок шкалы времени в окне Timeline первое изображение.
- Перейдите на вкладку окна и выберите Tools.
Примечание: Это будет активировать панель инструментов на левой стороне. - Выберите инструмент быстрого выделения.
- Поместите инструмент маркер внутри бластоциста прикоснуться к краю бластоциста. Наброски бластоциста, поместив маркер инструмент на внешний край бластоцисты, нажав и удерживая левую кнопку мыши и перетаскивания маркера инструмент вдоль внешнего края бластоциста до бластоцисты всей площади поперечного сечения выбирается.
Примечание: Zona pellucida не является частью измерения, поэтому он должен быть исключен (рис. 5). - В окне временной шкалы выберите Журнал замеров и нажмите кнопку « Записать измерения ».
Примечание: Это будет записывать выбранной области. - Вернуться к временной шкале, щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите «Отменить выделение».
- Переместите ползунок шкалы времени к следующему изображению и нажмите на соответствующие плитки под ним.
- Наброски бластоцисты в новое изображение с быстрый инструмент «Выделение». Повторите измерение.
- Повторите эту процедуру (шаги 8,9-8,13) изображения на изображение до тех пор, пока все изображения поперечного области измеряется и регистрируется.
- В конце концов перейдите в журнале измерений, выберите все измерения в области переменной и экспортировать их в файл .txt.
Примечание: Единицы площади поперечного сечения, квадратные пикселы.
9. Редактирование файла данных с записанные бластоциста поперечного области от изображения, созданные на этапе уравновешивания
- Передачи данных записанных бластоциста поперечного сечения областей из txt-файла в табличном редакторе.
- Используйте первое поперечное сечение значение как значение ссылки 1 и Экспресс (преобразование) все другие значения быть часть этого ссылаться на значение.
- Создайте новую переменную Area_r и вставить значения области транскодирования (за исключением значение ссылки) под ним.
- Рядом с переменной Area_r создайте переменную времени и добавить первое значение времени.
Примечание: Первое значение времени представляет собой время, которое прошло с момента, когда была разоблачена бластоциста уравновешивания решение для начала записи под микроскопом оборудованы камерой. - Рассчитать каждый следующий раз подряд значение путем добавления 20 s к предыдущему значению времени.
Примечание: Это интервал времени, используемый в истребляя ненужных кадров видео, созданные во время записи.
10. потепление бластоциста
- Подготовьте СМИ для утепления.
- За день до потепления бластоциста, асептически обойтись три капли 150 мкл восстановления среды в 4-ну блюдо. Кроме того асептически отказаться от восстановления среды в блюдо 9-Ну микрокапель специально для покадровой микроскопии и записи. Средство восстановления накрыть парафинового масла и preincubate при 37 ° C с 6% CO2 и 5% O2.
Примечание: Восстановление среды является средством культивирования для стадии бластоцисты эмбрионы с добавил человеческого сывороточного альбумина (HSA). HSA в среде восстановления должно быть 12 мг/мл. Чтобы заполнить дыры в 9-Ну блюдо, использовать дозатор для ооцитов денудации, чтобы избежать воздушных пузырей, а затем наложения области микрокапель с 30 мкл восстановления среды. - В день потепления бластоциста асептически обойтись 500 мкл оттаивания решение (TS) в один хорошо 4-ну блюдо и позволить ей нагреться до 37 ° C в инкубаторе без CO2.
- При комнатной температуре асептически обходиться одной капли 50 мкл разрежения (DS) решение и две капли 50 мкл моющего раствора (WS) в стерильных Петри. Обложка DS и и WS1 WS2 капли с парафинового масла.
Примечание: Вместо чашку Петри, 4-хорошо блюдо может также использоваться.
- За день до потепления бластоциста, асептически обойтись три капли 150 мкл восстановления среды в 4-ну блюдо. Кроме того асептически отказаться от восстановления среды в блюдо 9-Ну микрокапель специально для покадровой микроскопии и записи. Средство восстановления накрыть парафинового масла и preincubate при 37 ° C с 6% CO2 и 5% O2.
- Теплый бластоциста.
- Идентифицировать HSV соломы с стеклообразное бластоциста быть удалены из хранилища LN и быстро передавать LN-заполнены портативный водохранилище в рамках подготовки к процедуре потепления соломы.
- Поднимите соломы с щипцами, просто достаточно, чтобы разоблачить род цветной обработки. Используйте саморегулирующиеся зачистки проводов сократить соломы на высоте цветной обработки стержня.
- Захватить обработки стержня и извлечь его из соломы с быстрым, но контролируемые движения, и сразу окунуться изогнутые шпатель обработки стержня в 37 ° C TS.
- Аккуратно водоворот обработки стержня отсоединить бластоцисты и оставить его в общей сложности 1 мин в TS.
- При комнатной температуре Передача бластоцисты последовательно DS и WS1 WS2 4 мин в каждой среде.
- После потепления процедуры передать бластоциста 4-ну блюдо с восстановления средне и мыть все три капли мягко закупорить.
Примечание: Стирка осуществляется в приблизительно 1 мин. - Передать бластоциста покадровой 9-Ну блюдо с восстановления среды. Место 9-Ну блюдо под камеру замедленной съемки в инкубатор (при 37 ° C с 6% CO2 и 5% O2).
Примечание: Автошоу потепления процедура, которая продолжается с размещением 9-Ну блюдо под камеру замедленной съемки в инкубаторе, длится приблизительно 17 мин.
11. промежуток времени записи во время восстановления после потепления бластоциста Re-расширения
- Запуск покадровой записи программного обеспечения.
- Выберите запись камеры.
- Нажмите кнопку Live режиме .
- Наведите курсор мыши на изображение и используйте кнопки прокрутки для его увеличения. Нажмите и удерживайте левую кнопку мыши и переместить курсор поставить наилучшим образом с бластоцисты в середине экрана.
- Под фокусировкииспользуйте зеленые стрелки вверх вниз сосредоточиться плоскости записи бластоциста. В интенсивности светаЗадайте интенсивность света.
- Нажмите кнопку Параметры Микроскоп для задания времени экспозиции и гамма.
- Нажмите Закрыть режиме реального времени.
- Нажмите кнопку запуска проекта и введите данные проекта, выберите тип культуры блюдо (3 x 3 или 4 x 4) и снимите все должности, за исключением одного быть записаны.
- Установка захвата сроков принять снимок каждые 5 мин.
- Начните запись, нажав на кнопку утвердить . Записи по крайней мере 150 мин.
- Остановите запись, нажав кнопку остановить проект .
Примечание: Видите представителя результаты записи нетронутыми (рис. 3) и рухнул бластоцисты (рис. 4) во время периода восстановления после потепления.
12. видео Редактирование записанных бластоциста во время расширения после потепления
- Перейдите в папку проекта и найдите записанные изображения, которые примерно 80 KB в размер.
- Создайте другую папку и передавать эти образы в него. Переименуйте изображения в цифрах по времени создания. Импортируйте их в программное обеспечение как последовательности изображений для редактирования видео.
- Перейдите на вкладку видео → Фильтр → добавить и выберите пункт фильтр преобразования Null .
- Нажмите кнопку Обрезка на правой стороне и обрезать изображения, оставляя видимыми только поле с записанные бластоциста. Подтвердите с ОК и снова ОК.
- Выберите файл → → Экспорт последовательности изображений. Выберите JPEG в качестве выходного формата, задать каталог для хранения сохраненной последовательности изображений и нажмите кнопку ОК.
Примечание: Это создаст размер (КРОП) изображения, подготовленные для дальнейших измерений в видео анализ программного обеспечения.
13. Установка шкалы измерений в видео анализ программного обеспечения для изображений, созданных с покадровой записи программного обеспечения
- Запустите анализатор покадровой записи программного обеспечения.
- Откройте проект с записанные бластоциста.
- Нажмите кнопку Analyze на поле с записанные бластоциста.
Примечание: Будет открыто новое окно Analyze. Нажмите на кнопку измерения , чтобы показать средство измерения. - Используйте средство измерения для измерения ширины всего изображения.
- Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и сохраните его. В свойства установите ширину изображения в пикселях.
- Разделите фактической ширины изображения с его ширина в пикселях.
Примечание: Это рассчитывает фактическую длину одного пикселя в этом изображении. - Запустите программное обеспечение анализа видео.
- Перейдите на вкладку окна и выберите временная шкала.
- В панели Timeline нажмите на знак газа фильма и выберите Добавить медиа... добавить последовательность изображений после теплых повторное расширение бластоциста.
- Нажмите изображение → анализ → Задать шкалу измерений → Custom для открытия окна шкалы измерения. Для пикселей длины введите 1; для логическим длине введите ранее рассчитанный фактическую длину пикселей (шаг 13,6); Логические единицы введите мкм. сохранить пресет.
14. измерения бластоциста площадь поперечного сечения из изображений, созданных во время после теплого Re расширению
- Как только шкала измерения набор и импорте последовательности изображений, измерьте бластоциста поперечного области так же, как описано в шаге 8, с той лишь разницей, что измеренная поперечного области в эти измерения имеют единиц в мкм2 .
15. Редактирование файла данных с записанные бластоциста поперечного области от изображения созданные во время после теплого Re расширению
- Передачи данных записанных бластоциста поперечного сечения областей из txt-файла в табличном редакторе.
- Создайте переменную времени рядом с переменной области и добавить первое значение времени.
Примечание: В этом случае, первый раз значение 0 минут, которая является началом покадровой записи. Каждый следующий раз подряд значение рассчитывается путем добавления 5 минут к предыдущему значению времени. Пять минут — интервал времени, используемый между двух последовательных покадровой записи.
16. Создание линии схемы
- Импорт файла данных электронной таблицы в статистический анализ программного обеспечения для создания время участок бластоциста площадь поперечного сечения изменения во времени на этапе уравновешивания витрификации или ре расширение после потепления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В демонстрации мы показали бластоциста morphodynamics только один previtrification и одну фазу после потепления. Разница в объеме бластоцисты в конце этапа уравновешивания и в начале восстановления в среде культуры, показали интенсивность усадка эмбриона, который, по сути, интенсивность сохранения эмбрионов против льда кристаллизации.
Как можно заметить из рис. 1 и 1 видео, полностью разрушена нетронутыми бластоциста уравновешивания решения не было. Blastocoel контракт лишь частично, но в течение 10 минут, он медленно достиг ре расширение размер 70%. Вопреки этому искусственно рухнул бластоцисты полностью опорожнить blastocoel сразу же после лазерного лечения, но в решение уравновешивания, его объем не изменять любые более (рис. 2, 2 видео). Презентация blastocoel ре расширения в среде восстановления (рис. 3 и Рисунок 4) с микрофото и линии диаграммы показывает различные модели blastocoel роста. Отображение одного измерения площади поперечного сечения бластоциста это показано на рисунке 5.
В среде стеклования с высокой концентрацией криопротектора нетронутыми бластоцисты интенсивно сократилась еще раз, в то время как свернутые бластоциста объем остается практически неизменным. От графического представления, с помощью протокола, представленные здесь, очевидно, что нетронутыми бластоциста подвергается поэтапного сокращения blastocoel (рис. 6), один раз в раствор уравновешивания и один раз в среде витрификации, в то время как рухнула бластоцисты, усохшие стадию в начале вмешательства с помощью лазера (рис. 7). Это ставит вопрос, ли 10 минут уравновешивания фазы является действительно необходимым для свернутого бластоцисты, или же этот срок может быть сокращен.
Презентация blastocoel ре расширение может быть линейным или Прерванный с несколько больше или меньше сокращений (рис. 8).
Рисунок 1: промежуток времени микрофотографирование изменений нетронутыми бластоциста во время экспозиции для уравновешивания решение. Отдельные изображения были записаны каждые 20 секунд. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: промежуток времени микрофотографирование изменений искусственно рухнул бластоциста во время экспозиции для уравновешивания решение. Отдельные изображения были записаны каждые 20 секунд. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: промежуток времени микрофотографирование изменений нетронутыми бластоциста во время потепление recoverypost. Отдельные изображения были записаны каждые 5 минут. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: промежуток времени микрофотографирование изменения свернутого бластоциста во время recoverypost потепления. Отдельные изображения были записаны каждые 5 минут. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: отображение одного измерения площади поперечного сечения бластоциста. Бластоциста тщательно окружили с соответствующий выбор инструмента в видео анализ программного обеспечения. Zona pellucida, всегда исключаются из измерения. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: представление изменений в сечение нетронутыми бластоциста. Эти панели показывают представление изменений в сечение нетронутыми бластоциста во время экспозиции для уравновешивания решение (A) на витрификации и (B) во время восстановления после потепления. Площадь поперечного сечения указываются относительно первоначального бластоциста площадь поперечного сечения до витрификации. Пунктирная линия, соединяющая панели A и B мнимой, представляющих изменения во время стеклования, охлаждение до-196 ° C и потепление до 37 ° C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: представление изменений в сечение рухнул бластоциста. Эти панели показывают представление изменений в области поперечного сечения (A) рухнул бластоциста во время экспозиции для уравновешивания решение (B) на витрификации и (C) во время восстановления после потепления. Площади поперечного сечения указываются относительно первоначального бластоциста сечение до свертывания и витрификации. Пунктирная линия на панели A мнимой и представляет начальную и конечную точки во время развала бластоциста. Также мнимой пунктирная линия между панелями B и C, представляет изменения во время стеклования, охлаждение до-196 ° C и потепление до 37 ° C. Только сплошной линии в группах B и C являются результатом фактических измерений площади поперечного сечения во время уравновешивания и процесса восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 8: графическое представление разных форм бластоциста восстановления после потепления. Линейки шкалы — 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: покадровой видео изменений нетронутыми бластоциста во время воздействия на решение уравновешивания. Видео представляет изменения, которые длятся почти 10 минут в режиме реального времени. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2: промежуток времени видео изменения свернутого бластоциста во время экспозиции для уравновешивания решение. Видео представляет изменения, которые длятся почти 10 минут в режиме реального времени. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол для наблюдения бластоциста morphodynamics во время и после криоконсервирования также может осуществляться с помощью аналогичных инструментов и программных средств от других производителей. Промежуток времени системы, скорректированные с учетом эмбриологии позволяют непрерывный мониторинг развития эмбриона. Целью этой работы было ввести количественная оценка бластоциста поведения во время подготовки бластоцисты стеклования и после их потепления. Это было сделано путем объективного измерения изменений в морфологии на шкале. Полученные результаты этих измерений может быть математически проанализированы и по сравнению с другими результатами. Среди параметров, которые могут последовать в протоколе описаны изменения в размер бластоциста, его внутренние клетки массы, blastocoel, или zona pellucida в течение определенного периода времени. Размер может отображаться как площадь поверхности в крупнейших сечение бластоцисты, бластоциста окружности или диаметр и, после расчета, даже, как его объем.
В предыдущих исследованиях с использованием покадровой систем измерения скорости расширения blastocoel были сделаны только на свежих эмбрионов11. В стеклообразное/утепленные бластоцисты, только бластоцисты размеры были измерены сразу после потепления и до переноса эмбрионов, или период времени был проанализирован на которой согревал бластоцисты, вновь расширена вителлинового9,10 . Более подробные бластоциста ре расширение динамики были проанализированы только в наших предыдущих исследований8. В этом исследовании морфометрических протокол уже используется для отслеживания скорости и шаблон бластоциста ре разложения после потепления. Хотя эти бластоциста биомаркеров роста показали не имеют высоких прогностичность для имплантации, они могут использоваться для сравнения бластоциста восстановления потенциала после витрификации и потепление с различными криоконсервирования СМИ и протоколы . А именно большего сужения бластоциста во время blastocoel re расширению предполагают слабость trophectodermal слоя, который может быть причинен в ходе криоконсервирования и его неспособность выдерживать давление, сделанные blastocoel заполненные жидкостью.
Описанные морфометрические протокол может обеспечить много дополнительных сравнительный анализ поведения бластоцисты, не только после криоконсервирования, путем измерять скорость и интенсивность изменения в объем, количество частичной blastocoel схватки или всего бластоциста падает, время для всего blastocoel re расширению, или время для штриховки. Кроме того он также может использоваться во время фазы previtrification для определения наиболее оптимальных сроках бластоциста воздействия различных концентраций криопротектора, как был представлен в результатах. Vanderzwalmen et al. показал на мышей ооциты что витрификации также может быть успешным, если внутриклеточного осмотического давления не достичь равновесия с внешними криопротектора решение12. Этапа только проблематичным для записи бластоцисты во время сохранения является период в витрификации решения из-за ограниченного времени; эмбрион должен быть подвержены более высокую концентрацию криопротекторов и упакованы в соломе в менее чем 90 секунд. Для этих измерений он будет рекомендовано использовать только бластоцисты, которые предоставляются безвозмездно для научных исследований. Тем не менее клинически доступны бластоцисты может быть записанные и измеренных снова сразу после потепления, с тем чтобы наблюдать, как они себя ведут в разведении и мытье решения. Сразу же после передачи бластоциста из моющего раствора к средству восстановления бластоцисты, как правило, плавают от дна. Это может представлять трудности в поддержании эмбриона в одной фокальной плоскости во время записи. Чтобы решить эту проблему, рекомендуется подготовить блюдо с плоский капли среднего. Аналогичная проблема наблюдается на Vanderzwalmen и др. 12.
В дальнейших исследованиях было бы полезным изучить ли можно было бы сократить продолжительность воздействия искусственно рухнул бластоцисты криопротекторов, следовательно минимизации токсическое воздействие этих химических веществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа является частью исследовательской программы P3-0327 и исследовательского проекта J3-7177, основанная в Словенский исследовательский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
