Summary
وهنا يقدم بروتوكول الوقت الفاصل بين شكلي لمتابعة كثافة انكماش الكيسة والتوسع في الطاقة المتجددة خلال التدخلات بريفيتريفيكيشن والانتعاش بعد انتهاء الاحترار. من الممكن في مختبرات الإخصاب في المختبر مجهزة بالمجاهر الوقت الفاصل بين تطبيق البروتوكول ويوصي بتطوير طريقة التزجيج الكيسة الأمثل.
Abstract
توضح هذه المقالة طريقة noninvasive الكيسة مورفوميتري استناداً إلى الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي للرصد الدقيق لحجم الكيسة تغيير خلال المراحل الفردية قبل وبعد عمليات التزجيج. يمكن أن تكون الطريقة مفيدة في البحث عن توقيت المثلى الكيسة التعرض لتركيزات مختلفة من المنتجة عن طريق مراقبة انكماش الكيسة وإعادة-التوسع في مختلف قبل والتزجيج بعد انتهاء مراحل. يمكن أن يكون الأمثل مع هذه المنهجية، البروتوكول التزجيج الكيسة. لمظهر أفضل من فائدة هذا الأسلوب شكلي، تتم مقارنة البروتوكولين إعداد الكيسة مختلفة التزجيج؛ واحد مع استخدام blastocoel اصطناعية الانهيار وآخر دون هذا التدخل قبل التزجيج. كل التغييرات في الحجم blastocysts متبوعاً بالوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي ويقاس بأدوات برامج تحرير الصور. يتم أخذ القياسات كل 20 ثانية في مراحل بريفيتريفيكيشن وكل 5 دقائق في فترة ما بعد الاحترار. يتم عرض التغييرات أبعاد الكيسة كل وحدة وقت رسومياً في الرسومات التخطيطية لخط. وتبين النتائج مرحلة بريفيتريفيكيشن الموازنة طويلة فيها الكيسة سليمة ينكمش أولاً وثم ببطء الغيارات blastocoel، دخول التزجيج مع blastocoel مملوءة بسائل. الكيسة أنهار مصطنع لا يزال في مرحلته منكمش يمر بمرحلة الموازنة كاملة. وخلال مرحلة التزجيج، أيضا لا يتغير حجمه. حيث يظهر مورفوميتري الكيسة حجم ثابت من blastocysts مصطنع أنهار خلال الخطوة بريفيتريفيكيشن، ويبدو أن هذه المرحلة يمكن أن يكون أقصر. وينص البروتوكول على وصف العديد من معلمات إضافية النسبية للسلوك الكيسة أثناء وبعد تجميد بناء على سرعة وكثافة التغييرات في الحجم، وعدد تقلصات blastocoel الجزئي أو الكلي الكيسة ينهار، والوقت إجمالي blastocoel re-توسع أو الوقت الفقس.
Introduction
تجميد الأجنة البشرية برييمبلانتيشن من برنامج الإخصاب في الأنابيب (التلقيح الصناعي) في الوقت الحاضر ممارسة روتينية في معظم مختبرات التلقيح الاصطناعي. الجنين بطيء تجميد الأسلوب بدأ استخدامها سريرياً في عام 1985، مع إدخال المنتجة محددة والمجمدات الكمبيوتر التي تسيطر عليها، مما مكن التبريد التي تسيطر عليها من الأجنة وصولاً إلى-7 درجة مئوية، وعندما حملت نويات الثلج (البذور) في المحيطة كريوبروتيكتيفي متوسطة1. بالتبريد المستمر، أن ينمو بلورات الثلج، مما تسبب في هايبروسمولاليتي الكسر السائل المتبقية، وبالتالي فالجفاف وتقلص الخلايا الجنينية. -30 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية، أن سقطت الأجنة في النيتروجين السائل لتخزين أطول. ويمكن ملاحظة ما كان يحدث مع أجنة أو بويضات أثناء التبريد فقط بواسطة كريوميكروسكوبيس المكيفة خصيصا، مما ساعد على تحسين البروتوكولات للواسمات2. تجميد بلاستوسيستس، زيادة حجم والمرحلة الجنينية أكثر الوارد من السوائل، أعطت نتائج سريرية أقل واعدة في تلك الأيام3.
الاختراق في نعد الكيسة هو الأخذ بأسلوب التزجيج، التي جرت جفاف الخلايا قبل التبريد باستخدام تركيزات عالية من المنتجة4. كما يمكن إزالة السائل من بلاستوكويل قبل التزجيج بجعل افتتاح ميكانيكية بين اثنين من الخلايا تروفيكتوديرم5. على الرغم من أن معدل بقاء الكيسة الفورية بعد التزجيج والاحترار فوق 90%، وفيما يلي النتائج السريرية نقل الكيسة الشركة إنتاج حرارة في تجويف الرحم مماثل تقريبا للنتائج بعد نقل جديدة الأجنة، هذا الأسلوب للواسمات لم الموحدة6،7حتى الآن. بروتوكولات التزجيج تختلف وفقا لنوع (أ) وتركيز المنتجة، (ب) عدد الخطوات بريفيتريفيكيشن، (ج) مدة الخطوات الفردية، (د) استخدام blastocoel الاصطناعية الانهيار قبل التزجيج أو لا، (ه). انهيار الطرق والمرحلة (و) التوسع في الكيسة (ز) الموازنة/التزجيج درجة الحرارة في الأجنة التي ينبغي أن تكون الشركة إنتاج8. منذ المنتجة يمكن أن تكون سامة للخلايا، وقد الكيسة وقت التعرض لهذه الحلول لتكون واضحة المعالم. بيد أن بعض الشركات المصنعة لوسائل الإعلام نعد تسمح البروتوكولات مرنة جداً.
وتركز اهتمام العلماء عادة على دراسة إمكانية التوسع في إعادة الكيسة بهدف البحث عن المؤشرات الحيوية الجديدة مع تنبؤ أفضل من غرس6،،من910. كيف يذوي blastocysts البشرية في مختلف خطوات إضافة المنتجة قبل التزجيج وما يحدث مع blastocysts بعد التزجيج والاحترار، المنتجة عندما يكون المراد إزالتها من الخلايا، وكيف بلاستوسيستس ترطيب و إعادة توسيع بعد الاحترار، وهو ليس على ما يرام ووصف لا يفهم. تطوير منهجية لتحقيق الهدف ورصد كمياً للسلوك الكيسة أثناء الخطوات المختلفة للواسمات هو، وبالتالي، الأساس المنطقي.
مع مرور الزمن مجاهر من مختلف الشركات المصنعة، من الممكن الآن لرصد سلوك الكيسة في مرحلة ما قبل ومراحل ما بعد انتهاء عمليات التزجيج. بها بما في ذلك أدوات حاسوبية إضافية، يمكن أيضا إجراء قياسات لحجمها (مورفوميتري). قياس الانخفاض أو زيادة في حجم الجنين في وقت معين، فمن الممكن لدورهن تقييم مورفوديناميكس للأجنة أثناء الجفاف والإماهة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا عليها اللجنة الوطنية للأخلاقيات الطبية في 19 أبريل 2016 (رقم 0120-204/2016 – 2).
1-إنشاء نظام تسجيل المجهر
- إيقاف تشغيل لوحة تدفئة المجهر.
- قبل أي علاج، أخذ لقطة الكيسة تحت مجهر مقلوب مجهزة بالكاميرا. تذكر أن تقوم بملاحظة التكبير التي تم تسجيلها في الكيسة.
2-اختيار وبريبريباريشن من بلاستوسيستس التزجيج
- حدد فقط blastocysts يوم 5 أو 6 يوم كامل الموسعة لنعد مع على الأقل عدد قليل من الخلايا (ICM) كتلة الخلية الداخلية وتروفيكتوديرم متماسكة.
- للمعالجة بالليزر بلاستوسيستس مع blastocoel منهارة، موجه الموضوع الكيسة إلى نبضة ليزر قصيرة (0.4-0.7 مللي) حفرة قطرها تتراوح ما بين 4.3 إلى 9.4 ميكرومتر، عرضية بيلوسيدا زونا ومفترق الطرق من خليتين تروفيكتوديرمال المجاورة. السماح الكيسة إلى انهيار كلياً أو جزئيا لمدة 5 دقائق.
- لعلاج بلاستوسيستس مع blastocoel سليمة، إجراء لا معاملة خاصة قبل التزجيج.
ملاحظة: تعتبر هذه بلاستوسيستس سليمة.
3-إعداد كريوبروتيكتانت وطبق بيتري لمرحلة الموازنة
- استخدام بيثي ماصة لتعرية البويضيه (قطرها 135 ميكرومتر) لملء أسيبتيكالي وسائل الإعلام الموازنة (M-199 المتوسطة هيبيس مخزنة مع 7.5 ٪ [دمس]، غليكول الإثيلين 7.5 ٪، 20 ٪ DSS) في ثقوب منطقة ميكرودروبليت صحن بيتري 9-جيدا مصممة خصيصا ل الوقت الفاصل بين الفحص المجهري والتسجيل.
ملاحظة: تعرية البويضيه عملية إزالة الركام الخلايا المحيطة البويضات. استخدام ماصة لتعرية البويضيه سيساعد على تجنب نشوء فقاعات الهواء. - تراكب منطقة ميكرودروبليت مع 30 ميليلتر لوسائل الإعلام في الموازنة.
4-نقل الكيسة في الحل الموازنة
- تغرق الكيسة سليمة أو المعالجة بالليزر في المتوسط الموازنة إلى الجزء السفلي من منطقة ميكرودروبليت للطبق ميكرودروبليت لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (مرحلة الموازنة).
- بدء العد تنازلي 10-دقيقة حالما يتم نقل الكيسة إلى متوسط الموازنة.
5-تسجيل الكيسة في مرحلة الموازنة
- نقل الطبق ميكرودروبليت مع الكيسة إلى مجهر مجهز بكاميرا. استخدم التكبير نفسه كما سبق لأخذ لقطة من الكيسة نفسها. الموقف ميكرودروبليت طبق حيث أن يتوضع في الكيسة تقريبا في مركز التسجيل.
- بدء التسجيل مع المجهر تسجيل البرامج. ملاحظة وقت العد التنازلي الذي يتم بدء تشغيل التسجيل.
ملاحظة: راجع نتائج تمثيلية للتسجيلات على حالها (الشكل 1، 1 فيديو) ومن الكيسة مطوية (الشكل 2، 2 فيديو) خلال التعرض 10-مين إلى حل الموازنة.
6-التزجيج الكيسة
- أسيبتيكالي الاستغناء عن قطره 50 ميليلتر من التزجيج الحل (M-199 المتوسطة حبيس مخزنة مع [دمس] 15%، 15% جليكول، 20% مفاجآت صيف دبي، السكروز 0.5 M) في طبق بتري 2 دقيقة قبل أن ينتهي العد التنازلي.
- إيقاف التسجيل عندما ينتهي العد التنازلي 10-دقيقة ونقل بسرعة الكيسة إلى حل التزجيج لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
- بلطف "الماصة؛" الكيسة س 1 على الأقل داخل الحل التزجيج.
- استخدام عمليات التزجيج قش لتحميل الكيسة. تحميل وختم يغرق التزجيج القش في النتروجين السائل (LN) داخل 80 s، لا تتجاوز 110 s بعد التعرض الأولى للحل التزجيج.
7-الفيديو تحرير الكيسة مسجل أثناء مرحلة الموازنة
- استيراد ملف فيديو مسجل في برامج تحرير الفيديو.
- حرك مربع التمرير الجدول الزمني إلى عدد الإطار 20 س. ملاحظة في هذا الوقت.
ملاحظة: سيتم استخدام هذا الرقم لتهلك إطارات الفيديو لا لزوم لها. إطارات فقط كل 20 s سيتم استخدامها. - انقر فوق علامة التبويب الفيديو ، ثم معدل الإطار... تحت الإطار معدل التحويل، تحقق من الحقل ديسيماتي قبل وأدخل رقم الإطار لوحظ سابقا. تأكد من النقر فوق موافق. انقر فوق ملف ← ← تصدير تسلسل الصور.
- اختر JPEG كتنسيق الإخراج وتعيين الدليل إجراء تسلسل الصور المحفوظة، وانقر فوق موافق.
ملاحظة: هذا سوف إنشاء دليل مع الصور تصل إلى 30 من الكيسة مسجل في تسلسل أثناء مرحلة الموازنة التزجيج.
8-قياسات مساحة مقطعية الكيسة من الصور التي تم إنشاؤها أثناء مرحلة الموازنة
- فتح برنامج تحليل أشرطة الفيديو. انقر فوق علامة التبويب نافذة وتحديد الجدول الزمني.
- في جزء المخطط الزمني، انقر فوق على علامة قطاع السينما واختر إضافة الوسائط... لإضافة صورة الكيسة قبل مرحلة الموازنة التزجيج – وقبل تدخل الليزر، إذا كان هناك أي.
ملاحظة: سوف تظهر هذه الصورة الكيسة في حالته الأكثر الموسعة وبه مساحة مقطعية سيكون بمثابة مرجع. - إضافة تسلسل صورة الكيسة المقابلة التي تم إنشاؤها مسبقاً مع برامج تحرير الفيديو (من مرحلة الموازنة التزجيج).
- انتقل إلى الصورة ← تحليل ← ← تحديد نقاط بيانات مخصص لفتح نافذة حدد نقاط البيانات .
- قم بإلغاء تحديد كافة نقاط البيانات، ثم حدد فقط في المنطقة، وتأكيد عن طريق النقر فوق موافق.
- حرك مربع التمرير المخطط الزمني في الإطار الزمني للصورة الأولى.
- انقر فوق علامة التبويب نافذة واختر أدوات.
ملاحظة: هذا سيتم تنشيط لوحة الأدوات على الجانب الأيسر. - اختر أداة التحديد السريع.
- ضع علامة أداة داخل الكيسة للمس على حافة الكيسة. الخطوط العريضة الكيسة بوضع علامة أداة على الحافة الخارجية الكيسة، النقر فوق ومحددا بالضغط على زر الماوس الأيسر، وسحب علامة أداة على طول الحافة الخارجية الكيسة حتى مساحة مقطعية الكيسة كلها.
ملاحظة: Zona pellucida ليست جزءا من القياس، حيث يجب أن تكون مستبعدة (الشكل 5). - في إطار المخطط الزمني، انقر فوق سجل القياس واضغط على زر سجل القياسات .
ملاحظة: هذا سوف يسجل في المنطقة المحددة. - العودة إلى المخطط الزمني، وانقر بالزر الأيمن على الصورة، واختر إلغاء التحديد.
- قم بتحريك المنزلق الجدول الزمني إلى الصورة التالية وانقر على المربعات المقابلة تحته.
- مخطط الكيسة في صورة جديدة "استخدام أداة التحديد السريع". كرر القياس.
- كرر هذا الإجراء (خطوات 8.9-8.13) الصورة بالصورة حتى يتم قياس المقطعية المناطق جميع هذه الصور وسجلت.
- وفي النهاية، انتقل إلى "سجل القياسات"، حدد كافة القياسات تحت مجال المتغير، وتصديرها في ملف.txt.
ملاحظة: وحدات مساحة مقطعية بكسل مربعة.
9-تحرير ملف البيانات مع المناطق الكيسة المسجلة في مستعرضة من الصور التي تم إنشاؤها أثناء مرحلة الموازنة
- نقل البيانات الكيسة المسجلة في المناطق مستعرضة من الملف.txt إلى محرر جدول بيانات.
- استخدام مساحة مقطعية القيمة الأولى كمرجع قيمة 1 وصريح (التحويل) كافة القيم الأخرى لتكون جزءا صغيراً من أن تشير إلى قيمة.
- إنشاء Area_r متغير جديد ولصق القيم المحولة المنطقة (باستثناء القيمة المرجعية) تحته.
- بجوار المتغير Area_r، قم بإنشاء متغير وقت وإضافة القيمة الأولى للوقت.
ملاحظة: قيمة الوقت الأول يمثل الوقت الذي مر منذ اللحظة التي تعرضت له الكيسة إلى حل الموازنة بداية التسجيل تحت مجهر مجهزة بكاميرا. - حساب كل قيمة الوقت على التوالي القادمة بإضافة 20 ثانية إلى قيمة الوقت السابق.
ملاحظة: هذا هو الفترة الزمنية المستخدمة في يهلك إطارات الفيديو غير الضرورية التي تم إنشاؤها أثناء التسجيل.
10-ارتفاع درجة حرارة الكيسة
- تعد وسائل الإعلام للاحترار.
- أسيبتيكالي تستغني يوميا قبل الاحترار في الكيسة، ثلاث قطرات 150 ميليلتر من الانتعاش المتوسطة في صحن 4-جيدا. أيضا، أسيبتيكالي الاستغناء عن الانتعاش المتوسطة في طبق 9-بئر ميكرودروبليت المصممة خصيصا للوقت الفاصل بين الفحص المجهري وتسجيلها. تغطية متوسطة الانتعاش مع زيت البارافين وبريينكوباتي أنه عند 37 درجة مئوية مع أول أكسيد الكربون 6%2 و % 5 س2.
ملاحظة: الانتعاش المتوسطة وسيلة زراعة للأجنة مرحلة الكيسة مع إضافة ألبومين المصل البشري (HSA). وينبغي أن يمتلكهما في الأجلين المتوسط واسترداد 12 مغ/مل. لملء الثقوب في الطبق 9-حسنا، استخدم ماصة أجل تعرية البويضيه لتجنب نشوء فقاعات الهواء، ثم تراكب منطقة ميكرودروبليت مع 30 ميليلتر من الانتعاش المتوسطة. - اليوم الاحترار في الكيسة، أسيبتيكالي الاستغناء عن 500 ميليلتر من ذوبان الحل (TS) في بئر واحدة من طبق 4-جيدا والسماح لها بالحارة إلى 37 درجة مئوية في حاضنة دون CO2.
- في درجة حرارة الغرفة، أسيبتيكالي الاستغناء عن واحد قطره 50 ميليلتر من تمييع الحل (DS) ونقطتين 50-ميليلتر من الغسيل الحل (WS) في طبق بتري معقم. تغطية قطرات DS و WS1 و WS2 مع زيت البارافين.
ملاحظة: بدلاً من طبق بيتري، طبق 4-كذلك يمكن أيضا استخدامها.
- أسيبتيكالي تستغني يوميا قبل الاحترار في الكيسة، ثلاث قطرات 150 ميليلتر من الانتعاش المتوسطة في صحن 4-جيدا. أيضا، أسيبتيكالي الاستغناء عن الانتعاش المتوسطة في طبق 9-بئر ميكرودروبليت المصممة خصيصا للوقت الفاصل بين الفحص المجهري وتسجيلها. تغطية متوسطة الانتعاش مع زيت البارافين وبريينكوباتي أنه عند 37 درجة مئوية مع أول أكسيد الكربون 6%2 و % 5 س2.
- الحارة في الكيسة.
- تحديد سترو HSV مع الكيسة المزججة إزالته من مخزن LN وسرعة نقل القش إلى خزان محمولة مملوءة بقانون الجنسية في التحضير لهذا الإجراء الاحترار.
- رفع القش بالملقط، ما يكفي لفضح قضيب مناولة الملونة. استخدام سلك متجرد ضبط النفس لقطع القش في ذروة قضيب مناولة الملونة.
- الاستيلاء على قضيب المناولة واستخراجها من القش بحركة سريعة، غير الخاضعة للرقابة، وفورا يغرق ملعقة منحنى قضيب المناولة في 37 درجة مئوية TS.
- بلطف دوامة قضيب المناولة فصل في الكيسة واتركه لمدة 1 دقيقة في الملخص.
- في درجة حرارة الغرفة، نقل الكيسة التتالي إلى DS و WS1 و WS2 لمدة 4 دقائق في المتوسط كل.
- بعد هذا الإجراء الاحترار، نقل الكيسة إلى طبق 4-جيدا مع الانتعاش المتوسطة وغسله في كل ثلاث قطرات بلطف بيبيتينج أن.
ملاحظة: يجري الغسيل في حوالي 1 دقيقة. - نقل الكيسة أن الوقت الفاصل بين الطبق 9-جيدا مع الانتعاش المتوسطة. ضع الطبق 9-البئر تحت كاميرا الوقت الفاصل بين في حاضنة (عند 37 درجة مئوية مع أول أكسيد الكربون 6%2 و % 5 س2).
ملاحظة: الإجراء ثلاث الاحترار، التي ما زالت مع وضع الطبق 9-البئر تحت كاميرا الوقت الفاصل في حاضنة، يستمر حوالي 17 دقيقة.
11-تسجيل الوقت الفاصل بين الكيسة Re-توسيع أثناء الانتعاش بعد انتهاء الاحترار
- تشغيل تسجيل الوقت الفاصل بين البرامج.
- اختر كاميرا تسجيل.
- اضغط على زر يعيش الوضع .
- ضع مؤشر الماوس على الصورة واستخدم زر التمرير لتكبيره. انقر فوق، واضغط بالزر الأيسر للماوس ونقل المؤشر مكان البئر مع الكيسة في منتصف الشاشة.
- تحت التركيز، استخدم الأسهم الخضراء من أعلى إلى أسفل للتركيز الطائرة تسجيل الكيسة. تحت كثافة الضوء، وتعيين شدة الضوء.
- انقر فوق الزر مجهر المعلمات لتعيين زمن التعرض للضوء وأشعة غاما.
- اضغط على إغلاق وضع حية.
- اضغط على زر بدء المشروع وإدخال بيانات المشروع، وحدد نوع الطبق الثقافة (3 × 3 أو 4 × 4) وإلغاء جميع الوظائف ما عدا واحدة لتسجيل.
- تعيين توقيت التقاط لالتقاط صورة كل 5 دقائق.
- بدء التسجيل عن طريق الضغط على زر الموافقة . تسجيل 150 دقيقة على الأقل.
- إيقاف التسجيل بالضغط على زر إيقاف المشروع .
ملاحظة: انظر نتائج تمثيلية لتسجيل حالها (الشكل 3) والكيسه مطوية (الشكل 4) خلال فترة الانتعاش بعد انتهاء الاحترار.
12-فيديو تحرير الكيسة مسجل أثناء التوسع في الطاقة المتجددة بعد ارتفاع درجة حرارة
- انتقل إلى مجلد المشروع وتحديد موقع الصور المسجلة التي هي تقريبا 80 كيلو بايت في الحجم.
- إنشاء مجلد آخر ونقل هذه الصور إلى ذلك. إعادة تسمية الصور في أرقام طبقاً لوقت إنشائه. استيرادها إلى برنامج كتسلسل صورة تحرير الفيديو.
- انتقل إلى علامة التبويب الفيديو ← تصفية ← إضافة وحدد عامل تصفية تحويل فارغة (null) .
- انقر فوق زر الاقتصاص على الجانب الأيمن واقتصاص الصورة، وترك الحقل فقط مرئية مع الكيسة مسجل. تأكيد مع موافق و موافقمرة أخرى.
- انقر فوق ملف ← ← تصدير تسلسل الصور. اختر JPEG كتنسيق الإخراج وتعيين الدليل إجراء تسلسل الصور المحفوظة، وانقر فوق موافق.
ملاحظة: هذا سوف إنشاء صور (اقتصاص) حجمها على استعداد لمزيد من القياسات في برمجيات تحليل أشرطة الفيديو.
13-إعداد مقياس القياس في برمجيات تحليل أشرطة الفيديو للصور تم إنشاؤها بواسطة تسجيل الوقت الفاصل بين البرامج
- تشغيل المحلل لتسجيل الوقت الفاصل بين البرامج.
- قم بفتح المشروع مع الكيسة مسجل.
- انقر فوق الزر تحليل في الميدان مع الكيسة مسجل.
ملاحظة: سيتم فتح نافذة تحليل جديدة. انقر على زر القياس لإظهار أداة القياس. - استخدام أداة القياس لقياس عرض الصورة بأكملها.
- انقر بالزر الأيمن على الصورة وحفظها. في الخصائص، تحقق من عرض الصورة بالبكسل.
- تقسيم العرض الفعلي للصورة مع العرض بالبكسل.
ملاحظة: هذا يحسب الطول الفعلي من بكسل واحد في هذه الصورة. - قم بتشغيل برنامج تحليل أشرطة الفيديو.
- انقر فوق علامة التبويب نافذة وتحديد الجدول الزمني.
- في جزء المخطط الزمني، انقر فوق على علامة قطاع السينما واختر إضافة الوسائط... لإضافة تسلسل صورة الكيسة إعادة توسيع الحارة بعد.
- انقر فوق الصورة ← تحليل ← ضبط مقياس القياس ← مخصص لفتح نافذة "مقياس القياس". لطول البيكسل، قم بإدخال 1؛ لطول المنطقية، قم بإدخال الطول الفعلي المحسوب مسبقاً بكسل (الخطوة 13.6)؛ للوحدات المنطقية، أدخل ميكرومتر. حفظ الإعداد المسبق.
14-القياسات من الكيسة منطقة مستعرضة من الصور التي تم إنشاؤها أثناء الحارة بعد التوسع في الطاقة المتجددة
- مجرد مقياس القياس مجموعة وتسلسل الصور المستوردة، قياس المجالات مستعرضة الكيسة بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوة 8، مع الفارق الوحيد هو أن مجالات مستعرضة المقاسة في هذه القياسات لها وحدات في2 ميكرومتر .
15-تحرير ملف البيانات مع المناطق الكيسة المسجلة في مستعرضة من الصور التي تم إنشاؤها أثناء الحارة بعد التوسع في الطاقة المتجددة
- نقل البيانات الكيسة المسجلة في المناطق مستعرضة من الملف.txt إلى محرر جدول بيانات.
- إنشاء متغير وقت جانب المتغير مجال وإضافة القيمة الأولى للوقت.
ملاحظة: في هذه الحالة، قيمة المرة الأولى يتم تعيين إلى 0 دقيقة، وهو بدء تسجيل الوقت الفاصل بين. يتم حساب كل قيمة مرة على التوالي القادم بإضافة 5 دقائق للقيمة الزمنية السابقة. خمس دقائق من الفترة الزمنية المستخدمة بين اثنين من تسجيلات الوقت الفاصل بين متتالية.
16-إنشاء رسم تخطيطي للخط
- استيراد ملف بيانات جدول البيانات في برنامج التحليل الإحصائي لإنشاء قطعة وقت منطقة مستعرضة التغييرات الكيسة في الوقت المناسب خلال مرحلة الموازنة التزجيج أو الاحترار re-التوسع في ما بعد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في تظاهرة، أظهرنا مورفوديناميكس الكيسة في بريفيتريفيكيشن واحدة فقط ومرحلة ما بعد الاحترار. فرق في حجم الكيسة نهاية مرحلة الموازنة، وفي بداية فترة نقاهة في الثقافة المتوسطة أظهرت كثافة انكماش الجنين، الذي، في الواقع، كثافة للحفاظ على الجنين ضد تبلور الجليد.
الكيسة سليمة كما يمكن ملاحظة ذلك من الشكل 1 و الفيديو 1، لم ينهار تماما في الحل الموازنة. بلاستوكول التعاقد جزئيا فقط، ولكن في غضون 10 دقائق، ببطء وصلت إلى حجم التوسع في الطاقة المتجددة بنسبة 70%. على العكس من ذلك، الكيسة أنهار مصطنع تفرغ تماما blastocoel فورا بعد العلاج بالليزر، ولكن في حل الموازنة، لم يتغير حجمه أي أكثر (الشكل 2، 2 فيديو). عرض blastocoel re-التوسع في الانتعاش المتوسطة (الشكل 3 و الشكل 4) مع ميكروفوتوجرافس ومع خط رسومات تخطيطية تبين أنماط مختلفة من النمو blastocoel. ويرد عرض لقياس واحد لمنطقة مستعرضة الكيسة في الشكل 5.
في التزجيج المتوسطة بتركيز أعلى من المنتجة، blastocysts سليمة مكثف تقلص مرة أخرى، بينما حجم الكيسة المنهار لظلت دون تغيير تقريبا. رسماً بيانيا، باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، فإنه من الواضح أن الكيسة سليمة يخضع لتخفيض تدريجي من بلاستوكول (الشكل 6)، ومرة واحدة في الحل الموازنة ومرة واحدة في المتوسط التزجيج، في حين وقد أنهار الكيسة التي وصلت إلى مرحلة منكمش في بداية التدخل بليزر (الشكل 7). وهذا يطرح السؤال ما إذا كان 10 دقائق المرحلة الموازنة ضرورية حقاً لانهار بلاستوسيستس، أم يمكن أن تقصر هذه الفترة.
يمكن أن يكون عرض blastocoel re-التوسع الخطي أو توقف مع عدة تقلصات أكبر أو أصغر (الشكل 8).
رقم 1: الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي للتغييرات التي حدثت في الكيسة سليمة أثناء التعرض للحل الموازنة. وسجلت الصور واحدة كل 20 ثانية. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي لتغيرات الكيسة مصطنع انهارت أثناء التعرض للحل الموازنة. وسجلت الصور واحدة كل 20 ثانية. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي للتغييرات التي حدثت في الكيسة سليمة خلال الاحترار ريكوفيريبوست. وسجلت الصور واحدة كل 5 دقائق. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الوقت الفاصل بين التصوير الميكروفيلمي لتغيرات الكيسة أنهار خلال الاحترار ريكوفيريبوست. وسجلت الصور واحدة كل 5 دقائق. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: عرض قياس واحد من منطقة مستعرضة من الكيسة. هو مطوقة الكيسة بعناية باستخدام أداة التحديد المناسبة في برمجيات تحليل أشرطة الفيديو. وتستثنى بيلوسيدا زونا دائماً من القياس. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تمثيل للتغيرات التي حدثت في منطقة مستعرضة الكيسة سليمة. إظهار هذه اللوحات تمثيل التغييرات في منطقة مستعرضة الكيسة سليمة أثناء التعرض للحل الموازنة (A) في التزجيج) و (ب) أثناء الانتعاش بعد انتهاء الاحترار. ووحدات منطقة مستعرضة بالنسبة إلى مساحة مقطعية الكيسة الأولى قبل التزجيج. خط متقطع يربط اللوحات A و B وهمي، تمثل التغييرات أثناء التزجيج، التبريد إلى-196 درجة مئوية، والاحترار إلى 37 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: تمثيل للتغيرات التي حدثت في منطقة مستعرضة الكيسة المنهار. إظهار هذه اللوحات تمثيل التغييرات في منطقة مستعرضة (A) الكيسة أنهار أثناء التعرض للموازنة الحل (ب) في التزجيج و (ج) أثناء الانتعاش بعد انتهاء الاحترار. الوحدات الخاصة بمنطقة مستعرضة نسبة إلى مساحة مقطعية الكيسة الأولى قبل الانهيار والتزجيج. خط متقطع في الفريق A هو وهمي، ويمثل نقطة البداية والنهاية أثناء انهيار الكيسة. كما يمثل خط متقطع وهمي بين اللوحات و ب ج، التغييرات أثناء التزجيج، التبريد إلى-196 درجة مئوية، والاحترار إلى 37 درجة مئوية. الخطوط الصلبة فقط في اللوحات B و C هي نتيجة للقياسات الفعلية من منطقة مستعرضة خلال عملية الانتعاش والموازنة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: العرض الرسومي لأنماط مختلفة من استرداد الكيسة بعد الاحترار. هو شريط مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
1 الفيديو: فيديو الوقت الفاصل بين التغييرات الكيسة سليمة أثناء التعرض للحل الموازنة. الفيديو يمثل التغييرات التي تدوم 10 دقائق تقريبا في الوقت الحقيقي. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
2 الفيديو: فيديو الوقت الفاصل بين التغييرات الكيسة أنهار أثناء التعرض للحل الموازنة. الفيديو يمثل التغييرات التي تدوم 10 دقائق تقريبا في الوقت الحقيقي. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول لمراقبة مورفوديناميكس الكيسة أثناء وبعد تجميد يمكن أيضا تنفذ باستخدام أدوات البرمجيات من الشركات المصنعة الأخرى والصكوك المماثلة. الوقت الفاصل بين أنظمة معدلة لعلم الأجنة السماح بالرصد المستمر للتنمية الجنين. وكان الغرض من هذا العمل لإدخال التحديد الكمي للسلوك الكيسة أثناء إعداد بلاستوسيستس التزجيج وبعد عن الاحترار. وقد تم ذلك بهدف قياس التغيرات في التشكل في مقياس الوقت. ويمكن تحليل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه القياسات رياضيا ومقارنة مع نتائج أخرى. بين المعلمات التي يمكن اتباعها من قبل بروتوكول وصف التغييرات في حجم الكيسة، الداخلية في الخلية الجماعية، في بلاستوكويل، أو بيلوسيدا زونا خلال فترة معينة من الوقت. يمكن عرض الحجم كمساحة السطح في المقطع العرضي الكيسة أكبر، ومحيط الكيسة أو القطر، وبعد عملية حسابية، بل كحجمه.
في استخدام نظم الوقت الفاصل بين الدراسات السابقة، أجريت قياسات سرعة التوسع blastocoel على الأجنة الطازجة11فقط. في blastocysts الشركة إنتاج حرارة، قيست فقط أحجام blastocysts فور الاحترار وقبل نقل الأجنة، أو الفترة الزمنية التي تم تحليلها الذي استعد blastocysts إعادة توسيع zona pellucida9،10 . تم تحليل ديناميات التوسع في إعادة الكيسة أكثر تفصيلاً إلا في أعمالنا السابقة دراسة8. في هذه الدراسة، استخدمت الفعل بروتوكول شكلي للمسار بسرعة ونمط من الكيسة re-التوسعات بعد الاحترار. على الرغم من أن هذه المؤشرات الحيوية نمو الكيسة أظهرت لا أن يكون قيمة تنبؤية عالية لغرس، فيمكن أن تستخدم للمقارنة بين الكيسة الاسترداد المحتملة بعد التزجيج والاحترار بتجميد مختلف وسائل الإعلام والبروتوكولات . هي انكماش أكبر الكيسة أثناء blastocoel re-توسيع تشير إلى ضعف الطبقة تروفيكتوديرمال التي يمكن أن تسبب خلال تجميد وعدم قدرتها على الصمود في وجه الضغط الذي أدلى به blastocoel مملوءة بسائل.
بروتوكول وصف شكلي يمكن أن توفر الكثير من التحليلات المقارنة إضافية من السلوك الكيسة، ليس فقط بعد تجميد، بقياس السرعة وكثافة للتغيرات في حجم وعدد تقلصات blastocoel جزئية أو مجموعة الكيسة يطوي، الوقت المناسب لمجموع blastocoel re-التوسع، أو الوقت الفقس. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدامه خلال مراحل بريفيتريفيكيشن لتحديد توقيت المثلى الكيسة التعرض لتركيزات مختلفة من المنتجة، كما قدم في النتائج. وأظهرت فانديرزوالمين et al. في بويضات الفئران هذا التزجيج يمكن أيضا أن تكون ناجحة إذا كان الضغط الاسموزي داخل الخلايا لا تصل إلى توازن مع الحل كريوبروتيكتانت الخارجية12. هي المرحلة الإشكالية فقط لتسجيل blastocysts أثناء الحفاظ على الفترة في حل التزجيج بسبب ضيق الوقت؛ الجنين قد تكون معرضة لوجود تركيز أعلى من المنتجة ومعبأة في القش في أقل من 90 ثانية. لهذه القياسات، سوف يوصي باستخدام blastocysts فقط التي يتم التبرع بها للبحوث. ومع ذلك، يمكن أن blastocysts سريرياً المتاحة مسجل وقياسها مرة أخرى فور الاحترار، بهدف مراقبة كيف يتصرفون في تمييع والغسيل الحلول. مباشرة بعد نقل الكيسة من الحل الغسيل إلى الانتعاش المتوسطة، blastocysts تميل إلى أن تطفو قبالة الجزء السفلي. وهذا يمكن أن تمثل صعوبة في الاحتفاظ الجنين في نفس المستوى البؤري أثناء التسجيل. لحل هذه المشكلة، ينصح بتحضير طبق مع قطرات مسطح من المتوسطة. وقد لوحظ مشكلة مماثلة قبل فانديرزوالمين et al. 12.
في بحوث أخرى، سيكون من المفيد استكشاف ما إذا كان يمكن تخفيض مدة تعرض blastocysts أنهار مصطنع للمنتجة، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد من التأثير السمي لهذه المواد الكيميائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل جزء من برنامج P3-0327 والبحث المشروع البحثي J3-7177، تأسست على يد "مؤسسة البحوث السلوفيني".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
