Summary
Hier präsentieren wir ein Time-Lapse morphometrische-Protokoll, um die Intensität der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion während Previtrification Interventionen und Post-wärmende Erholung folgen. Die Anwendung des Protokolls ist möglich in in-vitro- Befruchtung Labors mit Zeitraffer Mikroskopen ausgestattet und wird bei der Entwicklung einer optimalen Blastozyste-Verglasung-Methode empfohlen.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die nicht-invasive Methode der Blastozyste Morphometrie basierend auf Time-Lapse Mikrofotografie für die präzise Überwachung von einer Blastozyste Lautstärke ändern während der einzelnen Phasen vor und nach der Verglasung. Die Methode kann bei der Suche nach den optimalen Zeitpunkt der Blastozyste Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kryoprotektanten durch die Beobachtung der Blastozyste Schrumpfung und Re-Expansion in verschiedenen Pre- und Post-Verglasung Phasen hilfreich sein. Mit dieser Methode kann die Blastozyste Verglasung Protokoll optimiert werden. Für eine bessere Demonstration von der Nützlichkeit dieser morphometrische Methode sind zwei verschiedene Blastozyste Vorbereitung Protokolle für die Verglasung im Vergleich; einmal mit einer künstlichen Blastocöl zusammenbricht und einmal ohne diese Intervention vor der Verglasung. Beide Blastozysten Volumenänderungen sind gefolgt von Time-Lapse Mikrofotografie und gemessen an Fotobearbeitungs-Software-Tools. Die Messungen sind alle 20 Sekunden in Previtrification Phasen und alle 5 Minuten in der Post-Erwärmung. Die Änderungen der Blastozyste Dimensionen pro Zeiteinheit sind in Zeile Diagrammen grafisch dargestellt. Die Ergebnisse zeigen eine lange Gleichgewichtherstellung Previtrification Phase in der intakte Blastozyste zuerst verkleinert und dann langsam füllt das Blastocöl Eingabe Verglasung mit einer Flüssigkeit gefüllten Blastocöl. Die künstlich reduzierte Blastozyste bleibt in seinen geschrumpften Phase durch die gesamte Gleichgewichtherstellung Phase. Während der Phase der Vitrifikation ändert es auch nicht sein Volumen. Da die Blastozyste Morphometrie ein konstantes Volumen künstlich reduzierten Blastozysten während der Previtrification-Schritt zeigt, scheint es, dass dieser Phase kürzer sein könnte. Das beschriebene Protokoll bietet viele zusätzliche Vergleichsparameter der Blastozyste Verhalten während und nach der Kryokonservierung auf der Grundlage der Geschwindigkeit und Intensität der die Volumenänderungen, die Anzahl der partiellen Blastocöl Kontraktionen oder total Blastozyste bricht zusammen, und die Zeit, um eine totale Blastocöl Re-Erweiterung oder die Zeit zu schlüpfen.
Introduction
Kryokonservierung von Embryonen Präimplantationsdiagnostik aus dem in-vitro- Befruchtung Programm (IVF) ist heutzutage eine Routinepraxis in die meisten IVF-Labors. Langsam Embryos Einfrieren Methode begann 1985 mit der Einführung von spezifischen Kryoprotektanten und computergesteuerte Gefriergeräten, die ermöglicht die kontrollierte Kühlung von Embryonen bis-7 ° C, bei Eisnukleation (Aussaat) im induziert wurde klinisch verwendet werden die umliegenden Cryoprotective mittlere1. Durch kontinuierliche Kühlung würde die Eiskristalle wachsen, verursachen die Hyperosmolality von der restlichen flüssigen Anteil und damit die Austrocknung und Schrumpfung der embryonalen Zellen. Bei-30 ° C oder-80 ° C würde die Embryonen in flüssigem Stickstoff bei längerer Lagerung gestürzt. Was geschah mit den Embryonen oder Eizellen beim Abkühlen konnte nur durch speziell angepasste Cryomicroscopes, die zur Verbesserung der Kryokonservierung Protokolle2beobachtet werden. Das Einfrieren von Blastozysten, ein höheres Volumen und mehr Flüssigkeit enthalten embryonalen Stadium gab weniger vielversprechende klinische Ergebnisse in diesen Tagen-3.
Der Durchbruch in der Kryokonservierung der Blastozyste war die Einführung der Vitrifikation Methode, in der die Dehydration der Zellen stattgefunden hat, vor der Kühlung mit hohen Konzentrationen von Kryoprotektanten4. Das Entfernen der Flüssigkeit von der Blastocöl vor der Verglasung kann auch erreicht werden, indem man eine mechanische Öffnung zwischen zwei Trophektoderm Zellen5. Obwohl die unmittelbare Blastozyste Überlebensrate nach Verglasung und Erwärmung oben 90 % und die klinische Outcome nach ist verglast/erwärmt Blastozyste in die Gebärmutterhöhle übertragen fast vergleichbar mit Ergebnisse nach der Übertragung der frisch Embryonen, diese Methode der Kryokonservierung wurde noch nicht standardisierten6,7. Vitrifikation Protokolle variieren je nach (a) die Art und Konzentration der Kryoprotektanten, (b) die Anzahl der previtrification Schritte, (c) die Dauer der einzelnen Schritte, (d) den Einsatz einer künstlichen Blastocöl kollabiert vor der Verglasung oder nicht, (e). zusammenbrechende Methoden, (f) die Blastozyste Erweiterung Bühne und (g) die Gleichgewichtherstellung/Verglasung-Temperatur auf die Embryonen werden sollte, verglaste8. Da Kryoprotektanten für Zellen giftig sein können, muss die Blastozyste Belichtungszeit zu diesen Lösungen genau definiert werden. Jedoch können einige Kryokonservierung Medien Hersteller sehr flexibel Protokolle.
Das Interesse der Wissenschaftler konzentriert sich in der Regel nach dem Studium der Blastozyste Re-Expansion-Fähigkeit mit dem Ziel, neue Biomarker mit einer besseren Vorhersage von Implantation6,9,10zu finden. Wie menschliche Blastozysten auf verschiedenen Stufen entwässern des Hinzufügens von Kryoprotektanten vor der Verglasung und was passiert mit Blastozysten nach Verglasung und Erwärmung, wenn Kryoprotektanten müssen entfernt werden, aus den Zellen, und wie die Blastozysten rehydrieren und Re-erweitern nach Erwärmung, ist nicht gut beschrieben noch verstanden. Die Entwicklung einer Methodik für das Ziel und quantifizierte Überwachung der Blastozyste Verhalten bei verschiedenen Kryokonservierung Schritte ist somit Begründung.
Mit Time-Lapse Mikroskope verschiedener Hersteller ist es nun möglich, das Verhalten der Blastozyste im Pre- und Post-Verglasung Phasen zu überwachen. Durch die Einbeziehung zusätzlicher Computer-Tools, können auch Messungen von ihrer Größe (Morphometrie) durchgeführt werden. Durch Messung der Abnahme oder Zunahme der Größe der Embryo zu einem bestimmten Zeitpunkt, es ist möglich, die Bewertung der Morphodynamics der Embryonen während der Austrocknung und Rehydrierung zu objektivieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der nationalen medizinischen Ethik-Kommission am 19. April 2016 (Nr. 0120-204/2016 – 2) genehmigt.
1. Aufbau der Mikroskop-Aufnahme-System
- Schalten Sie die Heizplatte des Mikroskops.
- Vor jeder Behandlung eine Momentaufnahme der Blastozyste unter einem inversen Mikroskop mit Kamera ausgestattet. Denken Sie daran, die Vergrößerung beachten Sie mit der Blastozyste aufgenommen wurde.
2. Auswahl und Prepreparation von Blastozysten für Verglasung
- Wählen Sie nur voll entfalteten Tag-5 oder 6. Tag Blastozysten für die Kryokonservierung mit wenigstens ein paar innere Zelle Masse (ICM) Zellen und kohäsive Trophektoderm.
- Laserbehandelten Blastozysten mit einer reduzierten Blastocöl Gegenstand einer Blastozyste zu einem kurzen Laserpuls (0,4 - 0,7 ms) mit einem Lochdurchmesser von 4,3 bis 9,4 µm tangential gerichtet an die Zona Pellucida und an einer Kreuzung zweier benachbarter Trophectodermal Zellen. Lassen Sie die Blastozyste ganz oder teilweise für 5 min zusammenbrechen.
- Führen Sie für unbehandelte Blastozysten mit einer intakten Blastocöl keine besondere Behandlung vor der Verglasung.
Hinweis: Diese Blastozysten gelten als intakt.
3. Vorbereitung der Kryoprotektivum und einer Petrischale für Gleichgewichtherstellung Phase
- Verwendung Pithe Pipette für Eizelle Denudation (Durchmesser 135 µm), aseptisch Gleichgewichtherstellung Medien zu füllen (M-199 HEPES gepufferten Medium mit 7,5 % DMSO, 7,5 % Ethylenglykol, 20 % DSS) in die Löcher des Microdroplet Bereichs einer 9-Brunnen-Petrischale speziell für Time-Lapse-Mikroskopie und Aufnahme.
Hinweis: Eizelle Denudation ist ein Prozess des Entfernens die Eizelle umgebenden Kumuluszellen. Die Verwendung von einer Pipette für Eizelle Denudation wird helfen, um die Erstellung von Luftblasen zu vermeiden. - Die Microdroplet Fläche mit 30 µL Gleichgewichtherstellung Medien zu überlagern.
4. Übertragung der Blastozyste Gleichgewichtherstellung Lösung
- Tauchen Sie laserbehandelten oder intakte Blastozyste ins Gleichgewichtherstellung Medium, die unten in der Microdroplet der Microdroplet Schale für 10 min bei Raumtemperatur (Gleichgewichtherstellung Phase).
- Einen 10-Minuten-Countdown zu starten, sobald die Blastozyste Gleichgewichtherstellung Medium übertragen wird.
5. Aufnahme der Blastozyste in der Gasgleichgewichtherstellung Phase
- Übertragen Sie die Microdroplet Schale mit der Blastozyste zu einem Mikroskop Kamera ausgestattet. Verwenden Sie die gleiche Vergrößerung wie zuvor für eine Momentaufnahme der gleichen Blastozyste. Position der Microdroplet Gericht, dass die Blastozyste befindet sich ungefähr in der Mitte der Aufnahme.
- Die Aufnahme mit dem Mikroskop recording-Software. Beachten Sie die Countdown-Zeit, zu der die Aufzeichnung gestartet ist.
Hinweis: Siehe repräsentative Ergebnisse von Aufnahmen von einer intakten (Abbildung 1, Video 1) und einer reduzierten Blastozyste (Abbildung 2, Video 2) während der 10-min-Exposition gegenüber einer Gleichgewichtherstellung Lösung.
(6) Verglasung der Blastozyste
- Einen Tropfen 50 µL Vitrification Lösung (M-199 HEPES gepufferten Medium mit 15 % DMSO, 15 % Ethylenglykol, 20 % DSS, 0,5 M Saccharose) in einer Petrischale 2 min vor dem Ende des Countdown aseptisch zu verzichten.
- Stoppen Sie die Aufnahme, wenn die 10-Minuten-Countdown endet und schnelle Übertragung die Blastozyste Vitrification Lösung für 30 s bei Raumtemperatur.
- Pipette vorsichtig die Blastozyste mindestens 1 X in der Verglasung-Lösung.
- Verwenden Sie eine Verglasung Stroh für das Laden der Blastozyste. Laden, versiegeln und Tauchen Sie ein die Vitrifikation Stroh in flüssigem Stickstoff (LN) innerhalb von 80 s, nicht mehr als 110 s nach der ersten Exposition der Verglasung-Lösung.
7. video-Editing der aufgezeichneten Blastozyste die Gleichgewichtherstellung Phase
- Importieren Sie eine aufgezeichnete Videodatei in Video-editing-Software.
- Den Schieberegler Chronik, 20 S. Hinweis die Frame-Nummer zu diesem Zeitpunkt.
Hinweis: Diese Nummer wird verwendet werden, unnötige Videoframes zu dezimieren. Nur Rahmen alle 20 s verwendet werden. - Klicken Sie auf die Registerkarte " Video ", dann ... Framerate. Überprüfen Sie in der Frame-Rate-Konvertierungdas Decimate durch Feld und geben Sie die oben erwähnten Frame-Nummer. Durch Klicken auf "OK"bestätigen. Klicken Sie auf Datei → exportieren → Bildsequenz.
- Wählen Sie JPEG als Ausgabeformat, das Verzeichnis die gespeicherten Reihenfolge der Bilder zu halten, und klicken Sie auf "OK".
Hinweis: Dies wird ein Verzeichnis mit bis zu 30 Bilder der aufgezeichneten Blastozyste nacheinander Gleichgewichtherstellung Phase der Verglasung erstellen.
(8) Messungen der Blastozyste Querschnittsfläche von Bildern erstellt die Gleichgewichtherstellung Phase
- Öffnen Sie die video-Analyse-Software. Klicken Sie auf die Registerkarte " Fenster " und wählen Sie Zeitplan.
- In der Timeline-Fenster klicken Sie auf das Film-Streifen-Zeichen und wählen Sie Medien hinzufügen , ein Bild der Blastozyste vor der Gleichgewichtherstellung Phase der Verglasung hinzuzufügen – und vor dem Laser-Eingriff, falls vorhanden.
Hinweis: Dieses Bild zeigt die Blastozyste an die meisten erweiterten Zustand und seine Querschnittsfläche wird als Referenz dienen. - Fügen Sie die Bildsequenz der entsprechenden Blastozyste, die zuvor mit video-editing-Software (der Gleichgewichtherstellung Phase der Verglasung) generiert.
- Gehe zu Bild → Analyse → Select Datenpunkte → Custom zum Öffnen des Fensters Wählen Sie Datenpunkte .
- Deaktivieren Sie alle Datenpunkte, dann wählen Sie nur Bereich, und durch Klicken auf "OK"bestätigen.
- Den Schieberegler Zeitleiste im Schnittfenster auf das erste Bild.
- Klicken Sie auf die Registerkarte " Fenster " und wählen Sie Werkzeuge.
Hinweis: Dadurch wird das Bedienfeld "Werkzeuge" auf der linken Seite aktiviert. - Wählen Sie das Schnellauswahl-Werkzeug.
- Position der Werkzeug-Marker im Inneren der Blastozyste, die Kante der Blastozyste zu berühren. Die Blastozyste zu skizzieren, indem die Werkzeug-Marker auf die Blastozyste Außenkante, klicken und halten Sie die linke Maustaste gedrückt, und ziehen Sie die Werkzeug-Markierung entlang der Blastozyste Außenkante bis die ganze Blastozyste Querschnittsfläche wird ausgewählt.
Hinweis: Zona Pellucida ist kein Teil der Messung, so muss es sein ausgeschlossen (Abbildung 5). - Klicken Sie im Fenster "Timeline" auf das Vermessungsprotokoll und drücken Sie die Taste Record Messungen .
Hinweis: Dies wird den ausgewählten Bereich aufzeichnen. - Zurückkehren, um die Zeitleiste mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie aufheben.
- Bewegen Sie den Schieberegler der Zeitachse um zum nächsten Bild und klicken Sie auf die entsprechende Fliese dahinter.
- Skizzieren Sie die Blastozyste in das neue Bild mit den Quick Selection Tool. Wiederholen Sie die Messung.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 8,9-8.13) Bild für Bild, bis die Bilder Querschnittsflächen gemessen und aufgezeichnet werden.
- Am Ende gehen Sie in das Protokoll Messungen wählen Sie alle Messungen unter der Variablen Bereich , und in eine txt-Datei zu exportieren.
Hinweis: Die Einheiten der Querschnittsfläche sind quadratische Pixel.
9. Bearbeiten der Datendatei mit den aufgezeichneten Blastozyste Querschnittsflächen von Bildern erstellt die Gleichgewichtherstellung Phase
- Übertragen Sie die Daten der Querschnittsflächen der aufgezeichneten Blastozyste aus der txt-Datei in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
- Verwenden Sie den ersten Querschnittsfläche Wert als Referenzwert 1 und express (Transform) alle anderen Werte zu einem Bruchteil davon Wert verweisen.
- Erstellen Sie eine neue Variable Area_r und transkodiert Bereichswerte (außer dem Referenzwert) unter ihm.
- Neben der Area_r-Variable erstellen Sie eine Zeitvariable und fügen Sie die ersten Zeitwert.
Hinweis: Die erste Zeitwert repräsentiert die Zeit, die vom ersten Moment, den die Blastozyste ausgesetzt war, an die Gleichgewichtherstellung Lösung für den Beginn der Aufnahme unter dem Mikroskop Kamera ausgestattet. - Jeder nächste Mal Wert berechnen, indem 20 s auf den vorherigen Zeitwert.
Hinweis: Dies ist die Zeitspanne zu dezimieren unnötige video-Frames erstellt während der Aufnahme verwendet.
10. Erwärmung der Blastozyste
- Bereiten Sie Medien für die Erwärmung.
- Verzichten Sie einen Tag vor Erwärmung der Blastozyste aseptisch drei 150 µL Tropfen Rettungsmediums in einer 4-Well-Schale. Auch aseptisch Rettungsmediums in ein Microdroplet 9-gut Gericht speziell für Zeitraffer-Mikroskopie und Aufnahme zu verzichten. Das Recovery-Medium mit Paraffin-Öl bedecken und bei 37 ° C mit 6 % CO2 und 5 % O2preincubate.
Hinweis: Recovery-Medium ist ein Anbau-Medium für Blastozystenstadium Embryonen mit zusätzlichen menschlichen Serum Albumin (HSA). Die HSA in das Recovery-Medium sollte 12 mg/mL. Füllen die Löcher in der Schale 9-Brunnen, eine Pipette für Eizelle Denudation verwenden, um die Erstellung von Luftblasen zu vermeiden, dann die Microdroplet Fläche mit 30 µL des Rettungsmediums überlagern. - Am Tag der Erwärmung der Blastozyste aseptisch verzichten Sie 500 µL Lösung (TS) in einem einzigen Brunnen der 4-Well Platte Auftauen zu und lassen Sie es auf 37 ° C im Brutschrank ohne CO2erwärmen.
- Bei Raumtemperatur aseptisch verzichten Sie ein 50 µL Tropfen Verdünnung Lösung (DS) und zwei Tropfen 50 µL Waschlösung (WS) in eine sterile Petrischale. Bedecken Sie die DS und die WS1 und WS2 Tropfen mit Paraffin-Öl.
Hinweis: Anstelle einer Petrischale eine 4-Well-Gericht kann auch verwendet werden.
- Verzichten Sie einen Tag vor Erwärmung der Blastozyste aseptisch drei 150 µL Tropfen Rettungsmediums in einer 4-Well-Schale. Auch aseptisch Rettungsmediums in ein Microdroplet 9-gut Gericht speziell für Zeitraffer-Mikroskopie und Aufnahme zu verzichten. Das Recovery-Medium mit Paraffin-Öl bedecken und bei 37 ° C mit 6 % CO2 und 5 % O2preincubate.
- Wärmen Sie die Blastozyste.
- Identifizieren Sie das HSV-Stroh mit verglastem Blastozyste LN Speicher entnommen werden und das Stroh auf ein LN-gefüllte tragbare Reservoir in Vorbereitung auf das wärmende Verfahren schnell übertragen.
- Heben Sie das Stroh mit der Pinzette, gerade genug, um die farbigen Umgang mit Rute aussetzen. Verwenden Sie eine selbstregelnde Abisolierzange um das Stroh auf der Höhe der farbigen Umgang mit Stange geschnitten.
- Schnappen Sie sich die Umgang mit Rute und das Stroh mit einer schnellen, aber kontrollierten Bewegung entziehen, und 37 ° C TS sofort die gebogenen Spatel aus der Umgang mit Rute stürzen.
- Vorsichtig schwenken die Umgang mit Rute um die Blastozyste trennen und lassen Sie es für eine Gesamtmenge von 1 min im TS.
- Übertragen Sie bei Raumtemperatur die Blastozyste nacheinander auf DS, WS1 und WS2 für 4 min in jedem Medium.
- Übertragen Sie nach dem wärmenden Eingriff die Blastozyste auf eine 4-Well-Platte mit Rettungsmediums und waschen Sie es in allen drei Tropfen von pipettieren sie sanft.
Hinweis: Die Wäsche wird in ca. 1 min durchgeführt. - Übertragen Sie die Blastozyste auf die Zeitraffer 9-Well-Platte mit den Rettungsmediums. Platz 9-gut Gericht unter Zeitraffer im Inkubator (bei 37 ° C mit 6 % CO2 und 5 % O2).
Hinweis: Thre Erwärmung, die immer noch mit der Platzierung der 9-Brunnen Schale unter Zeitraffer im Brutkasten, dauert ca. 17 min.
11. die Zeitrafferaufnahme der Blastozyste Re-Expansion während der Genesung nach Erwärmung
- Zeitraffer-Aufnahmesoftware ausführen.
- Wählen Sie eine Aufnahme-Kamera.
- Drücken Sie die Schaltfläche " Live-Modus ".
- Platzieren Sie den Mauszeiger auf das Bild und verwenden Sie die Scroll-Taste, um es zu vergrößern. Klicken Sie und halten Sie die linke Maustaste gedrückt und bewegen Sie den Cursor, den Brunnen mit der Blastozyste in der Mitte des Bildschirms zu platzieren.
- Verwenden Sie unter Focusingdie oben-unten grün das Aufnahme-Flugzeug der Blastozyste zu konzentrieren. Legen Sie unter Lichtintensitätdie Lichtintensität.
- Klicken Sie auf Mikroskop-Parameter , um die Belichtungszeit und Gamma festzulegen.
- Drücken Sie die live-Modus zu schließen.
- Drücken Sie die Schaltfläche Start Projekt und geben Sie die Projektdaten, wählen Sie den Kultur Gericht (3 x 3 oder 4 x 4) und deaktivieren Sie alle Positionen mit Ausnahme des aufgezeichnet werden.
- Das Capture-Timing zu fotografieren alle 5 min. eingestellt.
- Die Aufnahme durch Drücken der Schaltfläche " bestätigen ". Mindestens 150 min aufnehmen.
- Beenden Sie durch Drücken der Taste Stop Projekt Aufzeichnung.
Hinweis: Siehe die repräsentativen Ergebnisse der Aufnahme ein intakt (Abbildung 3) und einer reduzierten Blastozyste (Abbildung 4) während der Post-Erwärmung Erholungsphase.
12. video Bearbeitung der aufgezeichneten Blastozyste beim Re-Expansion nach dem Aufheizen
- Öffnen Sie den Projektordner und suchen Sie aufgenommene Bilder, die rund 80 KB groß sind.
- Erstellen Sie einen anderen Ordner und übertragen Sie diese Bilder hinein. Benennen Sie die Bilder in den Zahlen nach der Zeit erstellt. In der Video-editing-Software als Bildsequenz importieren.
- Gehen Sie zur Registerkarte "Video" → Filter → Hinzufügen und wählen Sie Null Transform -Filter.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche " Zuschneiden " auf der rechten Seite und beschneiden Sie das Bild, so dass sichtbar nur das Feld mit den aufgezeichneten Blastozyste. Bestätigen Sie mit "OK" und wieder "OK".
- Klicken Sie auf Datei → exportieren → Bildsequenz. Wählen Sie JPEG als Ausgabeformat, das Verzeichnis die gespeicherten Reihenfolge der Bilder zu halten, und klicken Sie auf "OK".
Hinweis: Dadurch wird verkleinert (beschnitten) Bilder vorbereitet für weitere Messungen in der Videoanalyse-Software erstellt.
13. Einstellung der Maßverkörperung in Video-Analyse-Software für die Bilder mit der Zeitraffer-Aufnahmesoftware erstellt
- Laufen Sie den Analyzer die Zeitraffer-Aufnahmesoftware.
- Öffnen Sie das Projekt mit den aufgezeichneten Blastozyste.
- Klicken Sie auf analysieren , auf dem Feld mit den aufgezeichneten Blastozyste.
Hinweis: Ein neue Analyse-Fenster wird geöffnet. Klicken Sie auf die Messung , das Messwerkzeug zu zeigen. - Verwenden Sie das Tool "Messungen", Messen Sie die Breite des gesamten Bildes.
- Mit der rechten Maustaste auf das Bild und speichern Sie es. Überprüfen Sie in den Eigenschaften der Bildbreite in Pixel.
- Teilen Sie die tatsächlichen Bildbreite mit seiner Breite in Pixeln.
Hinweis: Die tatsächliche Länge eines einzelnen Pixels im Bild berechnet. - Die Videoanalyse-Software ausführen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte " Fenster " und wählen Sie Zeitplan.
- Klicken Sie in der Timeline-Fenster auf das Film-Streifen-Zeichen und wählen Sie Medien hinzufügen , fügen Sie die Bildsequenz der Post-warm neu wachsenden Blastozyste.
- Klicken Sie auf Bild → Analyse → Messskala festlegen → Brauch um die Messskala-Fenster zu öffnen. Geben Sie für Pixel Länge 1; Geben Sie für logische Länge die vorher berechnete tatsächliche Länge eines Pixels (Schritt 13,6); Geben Sie für logische Einheiten µm. speichern Sie die Voreinstellung ein.
14. Messung der Blastozyste Querschnittsfläche von Bildern erstellt während der Re-Expansion nach dem warmen
- Sobald die Messskala Set und die Bildsequenz nicht importiert ist, Messen Sie die Blastozyste Querschnittsflächen genauso wie in Schritt 8, mit dem einzigen Unterschied, dass die gemessenen Querschnittsflächen bei diesen Messungen im µm2 Einheiten haben .
15. Bearbeitung der Datendatei mit den aufgezeichneten Blastozyste Querschnittsflächen von Bildern während der Re-Expansion nach dem warmen erstellt
- Übertragen Sie die Daten der Querschnittsflächen der aufgezeichneten Blastozyste aus der txt-Datei in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
- Erstellen Sie eine Zeitvariable neben dem Bereich Variable und fügen Sie die ersten Zeitwert.
Hinweis: In diesem Fall ist die erste Zeit 0 Minuten Wert was ist das Auftreten von der Zeitrafferaufnahme. Jeder nächste Mal Wert errechnet sich durch Zugabe von 5 Minuten auf den vorherigen Zeitwert. Fünf Minuten ist das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Zeitraffer Aufnahmen verwendet.
16. die Schaffung von einem Liniendiagramm
- Importieren Sie die Kalkulationstabellendatei Daten in statistischen Analyse-Software für die Erstellung von einem Zeit-Grundstück von der Blastozyste Querschnittsfläche Änderungen rechtzeitig die Gleichgewichtherstellung Phase der Verglasung oder Re-Expansion nach Erwärmung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In einer Demonstration haben wir Blastozyste Morphodynamics nur ein Previtrification und ein Post-wärmen Stadium gezeigt. Ein Unterschied in der Lautstärke der Blastozyste am Ende der Phase Gleichgewichtherstellung und zu Beginn der Wiederherstellung in Kulturmedium zeigte die Intensität der Embryo Schrumpfung, die in der Tat ist der Intensität der Embryo Konservierung gegen Eis Kristallisation.
Wie es aus Abbildung 1 und Video 1bemerkt werden kann, zusammengebrochen die intakte Blastozyste komplett nicht in Gleichgewichtherstellung Lösung. Das Blastocöl vertraglich nur teilweise, aber innerhalb von 10 Minuten langsam die Re-Expansion-Größe von 70 % erreicht. Im Gegensatz dazu die künstlich reduzierte Blastozyste vollständig entleert das Blastocöl unmittelbar nach der Laserbehandlung, aber in Gleichgewichtherstellung Lösung, änderte sich sein Volumen nicht mehr (Abbildung 2, Video 2). Die Präsentation der Blastocöl Re-Expansion in Rettungsmediums (Abbildung 3 und Abbildung 4) mit Mikrophotographien und Linie Diagramme zeigt verschiedene Muster von Blastocöl Wachstum. Eine Anzeige einer einzelnen Messung der Querschnittsfläche der Blastozyste ist in Abbildung 5dargestellt.
Vitrifikation Medium mit einer höheren Konzentration von Kryoprotektanten geschrumpft intakte Blastozysten intensiv noch einmal während der eingestürzten Blastozyste Volumen fast unverändert geblieben. Aus eine grafische Darstellung mithilfe des Protokolls, das hier vorgestellte ist ersichtlich, dass die intakte Blastozyste eine schrittweise Reduzierung der Blastocöl (Abbildung 6), einmal am Gleichgewichtherstellung Lösung und einmal in der Verglasung Medium durchläuft während der zusammengebrochen Blastozyste geschrumpften Stadium zu Beginn des Eingriffs mit einem Laser (Abbildung 7). Dies stellt die Frage, 10 Minuten von Gleichgewichtherstellung Phase braucht man wirklich für reduzierte Blastozysten, ob dieser Zeitraum verkürzt werden konnte.
Die Präsentation der Blastocöl Re-Expansion kann linear oder unterbrochenen mit mehreren größer oder kleiner Kontraktionen (Abbildung 8).
Abbildung 1: Zeitraffer Mikrofotografie Änderungen eine intakte Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung. Einzelne Bilder wurden alle 20 Sekunden aufgezeichnet. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Time-Lapse Mikrofotografie Änderungen eine künstlich reduzierten Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung. Einzelne Bilder wurden alle 20 Sekunden aufgezeichnet. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Zeitraffer Mikrofotografie Änderungen eine intakte Blastozyste während Recoverypost Erwärmung. Einzelne Bilder wurden alle 5 Minuten aufgezeichnet. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Zeitraffer Mikrofotografie der Veränderungen der eingestürzten Blastozyste während Recoverypost Erwärmung. Einzelne Bilder wurden alle 5 Minuten aufgezeichnet. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Anzeige einer einzelnen Messung der Querschnittsfläche der Blastozyste. Die Blastozyste wird sorgfältig mit dem Auswahl-Werkzeug in Videoanalyse-Software umkreist. Die Zona Pellucida ist immer von der Messung ausgeschlossen. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Darstellung der Veränderungen in der Querschnittsfläche eines intakten Blastozyste. Diese Tafeln zeigen die Darstellung der Änderungen in der Querschnittsfläche eines intakten Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung (A) bei Verglasung und (B) während der Genesung nach Erwärmung. Die Einheiten der Querschnittsfläche beziehen sich auf die ersten Blastozyste Querschnittsfläche vor der Verglasung. Die gestrichelte Linie verbindet Platten A und B ist imaginär, repräsentieren die Änderungen während der Verglasung, bis-196 ° C Kühlung und Erwärmung auf 37 ° C. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7: Darstellung der Veränderungen in der Querschnittsfläche des eingestürzten Blastozyste. Diese Tafeln zeigen die Darstellung der Änderungen in die Querschnittsfläche (A) einer eingestürzten Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung (B) bei Verglasung und (C) während der Genesung nach Erwärmung. Die Einheiten der Querschnittsfläche beziehen sich auf die ersten Blastozyste Querschnittsfläche vor einstürzenden und Verglasung. Die gestrichelte Linie an zentrale A ist imaginär und stellt den Anfangs- und Endpunkt Punkt während des Zusammenbruchs der Blastozyste. Die imaginäre gestrichelte Linie zwischen den Platten B und C, stellt auch die Änderungen während der Verglasung, bis-196 ° C Kühlung und Erwärmung auf 37 ° C. Nur die durchgehenden Linien in Platten B und C sind das Ergebnis von Messungen der Querschnittsfläche während der Gleichgewichtherstellung und Recovery-Prozess. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 8: grafische Darstellung der verschiedenen Mustern der Blastozyste Erholung nach Erwärmung. Der Maßstab ist 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1: Zeitraffer-Video der Änderungen von einer intakten Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung. Das Video stellt die Änderungen, die in Echtzeit fast 10 Minuten dauern. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2: Zeitraffer-Video der Veränderungen der eingestürzten Blastozyste während der Exposition gegenüber Gleichgewichtherstellung Lösung. Das Video stellt die Änderungen, die in Echtzeit fast 10 Minuten dauern. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Das Protokoll für die Beobachtung der Blastozyste Morphodynamics während und nach der Kryokonservierung auch mit ähnlichen Instrumenten und Software-Tools anderer Hersteller durchgeführt werden kann. Zeitraffer-bereinigt um Embryologie Systeme ermöglichen die kontinuierliche Überwachung der Entwicklung des Embryos. Das Ziel dieser Arbeit war die Quantifizierung der Blastozyste Verhalten während der Vorbereitung der Blastozysten für Verglasung und nach deren Erwärmung einzuführen. Dies geschah durch die objektive Messung der Veränderungen in der Morphologie auf einer Zeitskala. Erzielten Ergebnisse dieser Messungen können mathematisch analysiert und verglichen mit anderen Ergebnissen. Unter den Parametern, die durch das beschriebene Protokoll befolgt werden können sind Änderungen an der Größe der Blastozyste, seine innere Zellmasse, das Blastocöl oder die Zona Pellucida innerhalb einer bestimmten Frist Zeit. Die Größe kann als Fläche in der größten Blastozyste-Querschnitt, der Blastozyste Umfang oder Durchmesser, und nach der Berechnung auch als sein Volumen angezeigt werden.
In früheren Studien mit Zeitraffer-Systemen waren Blastocöl Erweiterung Geschwindigkeitsmessungen nur an frischen Embryonen11vorgenommen. Verglaste/erwärmt Blastozysten wurden nur die Blastozysten Größen gemessen unmittelbar nach Erwärmung und vor dem Embryotransfer, oder der Zeitraum wurde analysiert mit der Blastozysten erneut erweitert, um die Zona Pellucida9,10 erwärmt . Detailliertere Blastozyste Re-Erweiterung Dynamik wurden nur in unseren vorherigen Studie8analysiert. In dieser Studie wurde die morphometrische Protokoll bereits verwendet, die Geschwindigkeit und das Muster der Blastozyste Re-Erweiterungen nach Erwärmung zu verfolgen. Obwohl diese Blastozyste Wachstum Biomarker gezeigt haben, nicht zu einen hohen prädiktiven Wert für die Implantation haben, können sie für den Vergleich der Blastozyste Erholungspotenzial nach Verglasung und Erwärmung mit verschiedenen Kryokonservierung Medien und Protokolle verwendet werden . Nämlich, empfehlen die größere Kontraktionen der Blastozyste bei Blastocöl Re-Expansion die Schwäche der Trophectodermal Schicht, die während der Kryokonservierung und seine Unfähigkeit, dem Druck seitens der Flüssigkeit gefüllten Blastocöl verursacht werden könnte.
Die beschriebenen morphometrische Protokoll bieten viele weitere vergleichende Analysen der Blastozyste Verhalten, nicht nur nach Kryokonservierung, durch die Messung der Geschwindigkeit und Intensität der Veränderungen in der Lautstärke, die Anzahl der partiellen Blastocöl Kontraktionen oder insgesamt Blastozyste bricht zusammen, die insgesamt Blastocöl Re-Expansion oder die Zeit zu schlüpfen. Darüber hinaus kann es auch in Previtrification Phasen für die Bestimmung des optimalen Zeitpunkts der Blastozyste Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Kryoprotektanten, wie in den Ergebnissen vorgelegt wurde verwendet werden. Vanderzwalmen Et Al. zeigten auf Mäusen Eizellen die Verglasung auch gelingen kann, wenn intrazelluläre osmotische Druck kein Gleichgewicht mit externen Kryoprotektivum Lösung12erreicht. Nur problematische Phase für die Aufzeichnung von Blastozysten bei Erhalt ist die Periode in Verglasung Lösung aufgrund der begrenzten Zeit; der Embryo hat eine höhere Konzentration von Kryoprotektanten ausgesetzt und in weniger als 90 Sekunden in das Stroh verpackt werden. Für diese Messungen wäre es empfehlenswert, nur Blastozysten, die gespendet werden für die Forschung zu verwenden. Dennoch kann klinisch verfügbare Blastozysten aufgezeichnet und gemessenen wieder unmittelbar nach Erwärmung, mit dem Ziel zu beobachten, wie sie sich Verhalten in Verdünnung und Waschlösungen. Unmittelbar nach ein Blastozystentransfer aus der Waschlösung, des Rettungsmediums tendenziell Blastozysten aus dem Boden zu schweben. Dies kann eine Schwierigkeit den Embryo in der gleichen Brennebene zu halten, während der Aufnahme darstellen. Um dieses Problem zu lösen, empfiehlt es sich, ein Gericht mit abgeflachten Tropfen Medium vorzubereiten. Ein ähnliches Problem wurde durch Vanderzwalmen Et Al. beobachtet 12.
In weitere Forschung wäre es sinnvoll zu untersuchen, ob die Dauer der Exposition der künstlich reduzierten Blastozysten Kryoprotektanten reduziert werden könnte, damit die toxische Wirkung dieser Chemikalien zu minimieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit ist ein Teil der Forschung Programm P3-0327 und Forschungsprojekt J3-7177, von der slowenischen Research Foundation gegründet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
