Summary
Nous présentons ici un protocole de time-lapse morphométriques pour suivre l’intensité du rétrécissement du blastocyste et re-expansion durant les interventions de previtrification et récupération après réchauffement. L’application du protocole est possible dans les laboratoires in vitro fertilization équipés de microscopes time-lapse et est recommandée dans le développement d’une méthode de vitrification de blastocyste optimale.
Abstract
Cet article décrit la méthode non invasive de blastocyste morphométrie basée sur microphotographie time-lapse pour le contrôle précis du volume du blastocyste changeant au cours des différentes phases avant et après vitrification. La méthode peut être utile dans la recherche pour le moment optimal de l’exposition à différentes concentrations de cryoprotectants blastocyste en observant le rétrécissement du blastocyste et re-expansion dans différentes avant et phases après vitrification. Avec cette méthode, le protocole de vitrification de blastocyste peut être optimisé. Pour une meilleure démonstration de l’utilité de cette méthode morphométrique, comparaison des deux protocoles de préparation de blastocyste différents pour la vitrification ; l’un avec l’aide d’un blastocèle artificiel s’effondrer et l’autre sans cette intervention avant vitrification. Les deux variations de volume des blastocystes sont suivies de microphotographie time-lapse et mesurées par des outils logiciels de retouche photo. Les mesures sont faites toutes les 20 secondes en phases de previtrification et toutes les 5 minutes dans la période post-réchauffement de la planète. Les changements des dimensions blastocyste par unité de temps sont présentées graphiquement dans les schémas de ligne. Les résultats montrent une phase de previtrification long d’équilibration dans lequel le blastocyste intact tout d’abord se rétrécit et puis lentement recharges le blastocèle, entrant dans la vitrification avec un blastocèle remplis de liquide. Le blastocyste artificiellement réduit reste dans sa phase ratatinée par le biais de la phase d’équilibration ensemble. Au cours de la phase de vitrification, elle aussi ne change pas son volume. Puisque la morphométrie du blastocyste montre un volume constant des blastocystes artificiellement s’est effondrés lors de l’étape de previtrification, il semble que cette étape pourrait être plus courte. Le protocole décrit fournit plusieurs paramètres supplémentaires de comparatives du comportement de blastocyste pendant et après cryoconservation sur la base de la vitesse et l’intensité les changements de volume, le nombre de contractions blastocèle partielle ou totale blastocyste s’effondre et le temps d’une dilatation blastocèle total ou le temps jusqu'à l’éclosion.
Introduction
Cryoconservation d’embryons préimplantatoires depuis le programme de fécondation in vitro (FIV) est aujourd'hui une pratique courante dans la plupart des laboratoires de FIV. L’embryon lente méthode de congélation ont commencé à être utilisés cliniquement en 1985, avec l’introduction des cryoprotecteurs spécifiques et congélateurs commandés par ordinateur, permettant le refroidissement contrôlé des embryons jusqu'à-7 ° C, lorsque la nucléation de glace (semis) a été induite chez les entourant le cryoprotecteur moyen1. Par un refroidissement continu, augmenterait les cristaux de glace, provoquant l’hyperosmolalité de la fraction liquide restante et, par conséquent, la déshydratation et le rétrécissement des cellules embryonnaires. À-30 ° C ou à-80 ° C, les embryons seraient plongés dans l’azote liquide pour une conservation plus longue. Ce qui se passait avec les embryons ou les ovocytes au cours du refroidissement pourrait être observé seulement par cryomicroscopes spécialement adaptés, ce qui a contribué à améliorer les protocoles de cryoconservation2. Le gel des blastocystes, un volume plus élevé et le stade embryonnaire plus fluide-contenus, a donné des résultats cliniques moins prometteuses dans ces jours3.
La percée dans la cryoconservation du blastocyste est l’introduction de la méthode de vitrification, où la déshydratation des cellules a eu lieu avant le refroidissement à l’aide de fortes concentrations de cryoprotecteurs4. L’élimination du fluide de la blastocèle avant vitrification est possible aussi en faisant une ouverture mécanique entre deux trophectoderme cellules5. Bien que le taux de survie de blastocyste immédiate après la vitrification et le réchauffement de la planète est supérieure à 90 % et la suite de résultats cliniques le transfert de blastocyste vitrifié/réchauffé dans la cavité utérine est presque comparable aux résultats obtenus après le transfert de produits frais cette méthode de cryoconservation des embryons, n’a pas encore été standardisé6,7. Protocoles de vitrification varient selon le type et la concentration des cryoprotectants, (b) le nombre d’étapes previtrification, (c) la durée des différentes étapes, (d) l’utilisation d’un blastocèle artificiel s’effondrer avant vitrification, ou non, (e). effondrement des méthodes, stade (f) l’expansion de blastocyste et (g) la température de l’équilibration/vitrification à laquelle les embryons devraient être vitrifié8. Comme cryoprotecteurs peuvent être toxiques pour les cellules, le temps d’exposition de blastocyste à ces solutions doit être bien défini. Cependant, certains fabricants de médias de cryoconservation permettent des protocoles très flexibles.
L’intérêt des scientifiques est généralement axé sur l’étude de la capacité de dilatation de blastocyste dans le but de trouver de nouveaux biomarqueurs avec une meilleure prédiction de l’implantation de6,9,10. Comment les blastocystes humains déshydratent à différentes étapes de l’ajout de cryoprotectants avant vitrification et que se passe-t-il avec les blastocystes après vitrification et le réchauffement de la planète, quand cryoprotecteurs doivent être retirés des cellules et comment réhydrater les blastocystes et Développez à nouveau après le réchauffement de la planète, n’est pas bien décrit ni compris. Le développement d’une méthodologie pour l’objectif et le suivi quantifiés du comportement de blastocystes au cours des étapes différentes de cryoconservation sont donc raison d’être.
Avec les microscopes time-lapse de différents fabricants, il est maintenant possible de contrôler le comportement du blastocyste en avant et les phases après vitrification. En incluant les outils informatiques supplémentaires, mesures de leur taille (morphométrie) peuvent également être réalisées. En mesurant la diminution ou augmentation de taille de l’embryon à un moment donné, il est possible d’objectiver l’évaluation de la morphodynamique des embryons au cours de la déshydratation et de réhydratation.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité National d’éthique médicale sur 19 avril 2016 (n° 0120-204/2016-2).
1. mise en place du système d’enregistrement de Microscope
- Éteindre la plaque chauffante du microscope.
- Avant tout traitement, prendre un instantané d’un blastocyste sous un microscope inversé équipé de caméra. N’oubliez pas de noter le grossissement au cours de laquelle a été enregistré le blastocyste.
2. sélection et Prepreparation des blastocystes de Vitrification
- Sélectionnez seules pleinement développées jour 5 ou le jour-6 blastocystes de cryoconservation avec au moins quelques cellules de (ICM) massives cellulaire interne et cohésif trophectoderme.
- Pour blastocystes imprégnées de laser avec un blastocèle s’est effondré, sujet un blastocyste à une impulsion laser court (0,4 - 0,7 ms) avec un trou de diamètre allant de 4,3 à 9,4 µm, dirigée tangentiellement à la zone pellucide et à la jonction de deux cellules adjacentes trophectodermal. Permettre le blastocyste entièrement ou partiellement effondrement pendant 5 min.
- Pour les blastocystes non traitées avec un blastocèle intact, n’effectuer aucun traitement particulier avant vitrification.
Remarque : Ces blastocystes sont considérés comme intacts.
3. préparation du cryoprotecteur et une boîte de pétri pour la Phase d’équilibration
- Pipette de pithe utilisation de dénudation d’ovocytes (µm de diamètre 135) remplir aseptiquement médias d’équilibration (milieu tampon HEPES M-199 7,5 % DMSO, 7,5 % d’éthylène glycol, 20 % mas) dans les trous de la zone de microgouttelettes d’une boîte de Petri 9-cupule spécialement conçus pour time-lapse microscopie et enregistrement.
Remarque : Dénudation des ovocytes est un processus d’élimination des cellules du cumulus entourant l’ovocyte. L’utilisation de la pipette pour dénudation ovocyte contribuera à éviter la création de bulles d’air. - Le recouvrement de la zone de microgouttelettes avec 30 µL des médias de l’équilibration.
4. transfert de blastocyste dans la Solution de l’équilibration
- Immerger un blastocyste imprégnées par le laser ou intact dans le milieu de l’équilibration au fond de la zone de microgouttelettes de microgouttelettes plat pendant 10 min à température ambiante (phase d’équilibration).
- Un compte à rebours de 10 min commence dès que le blastocyste est transféré vers le milieu de l’équilibration.
5. enregistrement du blastocyste à la Phase d’équilibration
- Placer la capsule de microgouttelettes avec blastocyste et un microscope équipé de caméra. Utilisez le même grossissement que précédemment pour prendre un instantané du blastocyste même. Position des microgouttelettes plat afin que le blastocyste est placé environ dans le centre de l’enregistrement.
- Commencer l’enregistrement avec le microscope, logiciel d’enregistrement. Remarque le compte à rebours au cours de laquelle l’enregistrement est lancé.
Remarque : Voir résultats représentatifs d’enregistrements d’un intact (Figure 1, Video 1) et un blastocyste effondré (Figure 2, Video 2) lors de l’exposition de 10 min à une solution d’équilibration.
6. vitrification du blastocyste
- Une goutte de 50 µL de solution de vitrification (milieu tampon HEPES M-199 avec 15 % DMSO, 15 % d’éthylène glycol, 20 % mas, 0,5 M de sucrose) dans une boîte de pétri 2 min avant la fin du compte à rebours de façon aseptique.
- Arrêter l’enregistrement quand le compte à rebours de 10 min se termine et transférer rapidement le blastocyste à solution de vitrification pour 30 s à température ambiante.
- Pipetez doucement le blastocyste au moins 1 x au sein de la solution de vitrification.
- Utilisez une paille de vitrification pour charger le blastocyste. Charger, sceller et plonger la vitrification paille dans l’azote liquide (LN) au sein de 80 s, ne dépassant ne pas 110 s après l’exposition initiale à la solution de vitrification.
7. vidéo montage du blastocyste enregistré au cours de la Phase d’équilibration
- Importer un fichier vidéo enregistré dans le logiciel de montage vidéo.
- Déplacez le curseur de la timeline à 20 s. Note le numéro du cadre en ce moment.
Remarque : Ce numéro servira à décimer les images vidéo inutiles. Seulement encadre toutes les 20 s sera utilisé. - Cliquez sur l’onglet vidéo , puis la cadence.... Au titre de la conversion du taux d’armature, cochez le champ Decimate par et entrez le numéro de châssis a été mentionné précédemment. Confirmez en cliquant sur OK. Cliquez sur fichier → → exporter séquence d’images.
- Choisissez JPEG comme format de sortie, définissez le répertoire pour contenir la séquence enregistrée d’images et cliquez sur OK.
Remarque : Ceci créera un répertoire avec jusqu'à 30 images du blastocyste enregistré dans l’ordre au cours de la phase d’équilibration de la vitrification.
8. les mesures de la section transversale des Images créées pendant la Phase d’équilibration du blastocyste
- Ouvrez le logiciel d’analyse vidéo. Cliquez sur l’onglet de la fenêtre et sélectionnez la chronologie.
- Dans le volet de la chronologie, cliquez sur le signe de la bande de film et choisissez Ajouter des médias... pour ajouter une image du blastocyste avant la phase d’équilibration de la vitrification — et avant l’intervention laser, s’il y en avait aucune.
Note : Cette image affiche le blastocyste à l’état plus étendu et son aire de section servira de référence. - Ajouter la séquence d’images du blastocyste correspondant généré précédemment avec le logiciel de montage vidéo (de la phase d’équilibration de la vitrification).
- Allez dans Image → analyse → Sélectionner des Points de données → personnalisé pour ouvrir la fenêtre de sélection de points de données .
- Désélectionner tous les points de données, puis sélectionnez uniquement la zone et confirmez en cliquant sur OK.
- Déplacez le curseur de la timeline dans la fenêtre de montage sur la première image.
- Cliquez sur l’onglet de la fenêtre et choisissez outils.
Remarque : Ceci activera la palette d’outils sur le côté gauche. - Choisissez l' outil Sélection rapide.
- Positionner le marqueur de l’outil à l’intérieur du blastocyste à toucher le bord du blastocyste. Décrire le blastocyste en plaçant le repère outil sur le bord extérieur du blastocyste, en cliquant et maintenant le bouton gauche de la souris et en faisant glisser le marqueur de l’outil le long du bord extérieur du blastocyste jusqu'à ce que la section transversale du blastocyste entier sont sélectionné.
Remarque : la zone pellucide n'est pas une partie de la mesure, il doit donc être exclue (Figure 5). - Dans la fenêtre de montage, cliquez sur le Journal des mesures et appuyez sur le bouton d’Enregistrement des mesures .
Remarque : Ceci permettra d’enregistrer la zone sélectionnée. - Revenir à la chronologie, faites un clic droit sur l’image et choisissez désélectionner.
- Déplacez le curseur de la timeline à l’image suivante et cliquez sur la plaquette correspondant situé en dessous.
- Un aperçu du blastocyste dans la nouvelle image avec l’outil de sélection rapide. Recommencez la mesure.
- Répétez cette procédure (étapes 8,9-8.13) image par image, jusqu'à ce que des coupes transversales de toutes les images sont mesurées et enregistrées.
- En fin de compte, allez dans le journal des mesures, sélectionnez toutes les mesures dans la zone variable et les exporter dans un fichier .txt.
Remarque : Les unités de la section transversale sont pixels carrés.
9. modification du fichier de données dont les sections du blastocyste enregistré des Images créées pendant la Phase d’équilibration
- Transférer les données de surfaces transversales du blastocyste enregistré dans le fichier .txt à un éditeur de feuille de calcul.
- Utilisez la première transversale valeur comme valeur de référence 1 et express (transform) toutes les autres valeurs une fraction de cette valeur de référence.
- Créer une nouvelle Area_r variable et collez les valeurs de la zone transcodé (sauf la valeur de référence) en dessous.
- À côté de la variable Area_r, créez une variable de temps et ajouter la première valeur de temps.
Remarque : La première valeur de temps représente le temps qui passait dès l’instant où que le blastocyste a été exposé à la solution d’équilibration au début de l’enregistrement sous un microscope équipé de caméra. - Calculer chaque valeur fois consécutive suivante en ajoutant 20 s à la valeur de temps précédente.
Note : Ceci est l’intervalle de temps utilisé à décimer les images vidéo inutiles créés lors de l’enregistrement.
10. le réchauffement du blastocyste
- Préparer les milieux pour le réchauffement de la planète.
- Un jour avant le stade de blastocyste, le réchauffement aseptique trois gouttes de 150 µL de milieu de récupération dans un plat de 4 puits. En outre, aseptique moyen de récupération dans un plat de 9 puits de microgouttelettes spécialement conçu pour la microscopie time-lapse et enregistrement. Recouvrir le support de récupération d’huile de paraffine et il príncuber à 37 ° C, avec 6 % de CO2 et 5 % O2.
Note : Support de récupération est un milieu de culture des embryons au stade blastocyste avec l’albumine sérique humaine (Ash) ajouté. L’APD dans le milieu de la récupération doit être de 12 mg/mL. Pour combler les trous dans le plat de 9 puits, utiliser une pipette pour dénudation des ovocytes pour éviter l’apparition de bulles d’air, puis recouvrir la zone de microgouttelettes avec 30 µL de milieu de récupération. - Le jour du réchauffement du blastocyste, aseptiquement pipeter 500 µL de solution (TS) dans un seul puits d’un plat de 4 puits de dégel et laissez-le se réchauffer à 37 ° C dans un incubateur sans CO2.
- À température ambiante, aseptique une goutte de 50 µL de solution de dilution (DS) et deux gouttes de 50 µL de solution (WS) de lavage dans une boîte de Petri stérile. Couvrir les gouttes DS et WS1 et WS2 avec huile de paraffine.
Remarque : Au lieu d’une boîte de pétri, un plat de 4 puits peut également être utilisé.
- Un jour avant le stade de blastocyste, le réchauffement aseptique trois gouttes de 150 µL de milieu de récupération dans un plat de 4 puits. En outre, aseptique moyen de récupération dans un plat de 9 puits de microgouttelettes spécialement conçu pour la microscopie time-lapse et enregistrement. Recouvrir le support de récupération d’huile de paraffine et il príncuber à 37 ° C, avec 6 % de CO2 et 5 % O2.
- Réchauffer le blastocyste.
- Identifier la paille HSV avec blastocyste vitrifié à LN déstocké et transférer rapidement la paille vers un réservoir portable LN rempli en vue de la procédure de réchauffement de la planète.
- Lever la paille avec une pince, juste assez pour exposer la tige de manipulation coloré. Utilisez une pince à dénuder autoréglable pour couper la paille à la hauteur de la tige de manipulation coloré.
- Prenez la tige de la manipulation et l’extraire de la paille avec un mouvement rapide, pourtant contrôlé immédiatement plonger la spatule incurvée de la tige de la manutention dans les 37 ° C TS.
- Agiter doucement de la tige de manipulation pour détacher le blastocyste et laissez-le pendant un total de 1 min en TS.
- À température ambiante, transférer le blastocyste consécutivement à DS et WS1 WS2 pendant 4 min sur chaque support.
- Après l’intervention de réchauffement de la planète, transférer le blastocyste dans un plat de 4 puits avec un moyen de récupération et lavez-le dans toutes les trois gouttes de pipetage doucement il.
Note : Le lavage s’effectue en environ 1 min. - Transfert de blastocyste dans la boîte de 9 cupule time-lapse avec support de récupération. Posez le plat de 9 puits sous un time-lapse caméra dans un incubateur (à 37 ° C, avec 6 % de CO2 et 5 % O2).
Remarque : La procédure réchauffement Thre, qui continue à placer la boîte 9-cupule sous un time-lapse caméra dans un incubateur, dure environ 17 min.
11. time-lapse enregistrement le blastocyste Re-expansion au cours de la récupération post-réchauffement climatique
- Exécutez le logiciel d’enregistrement time-lapse.
- Choisir un appareil d’enregistrement.
- Appuyez sur la touche mode direct .
- Placez le curseur de la souris sur l’image et utilisez le bouton de défilement pour l’agrandir. Cliquez et maintenez enfoncé le bouton gauche de la souris et déplacez le curseur pour placer le puits avec le blastocyste dans le milieu de l’écran.
- Au titre de la mise au point, utilisez les flèches vertes haut-bas se pour concentrer le plan de l’enregistrement du blastocyste. En vertu de l' intensité lumineuse, régler l’intensité lumineuse.
- Cliquez sur le bouton paramètres de Microscope pour définir la durée d’exposition et Gamma.
- Appuyez sur fermer le mode direct.
- Appuyez sur le bouton Démarrer le projet et entrer les données du projet, sélectionnez le type de plat de culture (3 x 3 ou 4x4) et décochez toutes les positions sauf celui d’être enregistré.
- Régler le calage de la capture de prendre une photo toutes les 5 min.
- Démarrer l’enregistrement en appuyant sur le bouton approuver . Enregistrer au moins 150 min.
- Arrêter l’enregistrement en appuyant sur le bouton arrêter le projet .
Remarque : Voir les résultats représentatifs de l’inscription d’un intact (Figure 3) et s’est effondré blastocyste (Figure 4) au cours de la période de récupération après réchauffement.
12. video Editing du blastocyste enregistré au cours de la dilatation post-réchauffement climatique
- Allez dans le dossier de projet et recherchez des images enregistrées qui sont à peu près 80 KB dans la taille.
- Créez un autre dossier et transférer ces images dedans. Renommer des images en nombre selon le moment de la création. Importez-les dans la vidéo éditant le logiciel comme une séquence d’images.
- Allez dans l’onglet vidéo → filtre → ajouter et sélectionnez le filtre de transformation de la valeur Null .
- Cliquez sur le bouton rogner sur le côté droit et recadrer l’image, laissant visible uniquement le champ avec le stade de blastocyste enregistré. Confirmez avec OK et encore OK.
- Cliquez sur fichier → → exporter séquence d’images. Choisissez JPEG comme format de sortie, définissez le répertoire pour contenir la séquence enregistrée d’images et cliquez sur OK.
Remarque : Cela va créer des images redimensionnées de (recadrées) préparés pour des mesures supplémentaires dans le logiciel d’analyse vidéo.
13. définition d’une échelle de mesure dans le logiciel d’analyse vidéo pour les Images créées avec le logiciel d’enregistrement time-lapse
- Exécutez l’analyseur du logiciel enregistrement time-lapse.
- Ouvrez le projet avec le stade de blastocyste enregistré.
- Cliquez sur le bouton analyser sur le terrain avec le stade de blastocyste enregistré.
Remarque : Ouvrira une nouvelle fenêtre d’analyse. Cliquez sur le bouton de mesure pour afficher l’outil de mesure. - Utilisez l’outil de mesure pour mesurer la largeur de l’image complète.
- Faites un clic droit sur l’image et l’enregistrer. Dans les propriétés, vérifier la largeur de l’image en pixels.
- Divisez la largeur réelle de l’image avec sa largeur en pixels.
Remarque : Calcule la longueur réelle d’un seul pixel dans l’image. - Exécutez le logiciel d’analyse vidéo.
- Cliquez sur l’onglet de la fenêtre et sélectionnez la chronologie.
- Dans le volet de la chronologie, cliquez sur le signe de la bande de film et choisissez Ajouter des médias... pour ajouter la séquence d’images du blastocyste ré-expansion après chaud.
- Cliquez sur Image → analyse → Définir une échelle de mesure → personnalisé pour ouvrir la fenêtre de l’échelle de mesure. Pour la longueur de Pixel, entrez 1 ; pour longueur logique, entrez la longueur réelle calculée précédemment d’un pixel (étape 13,6) ; pour les unités logiques, entrez µm. enregistrer le préréglage.
14. les mesures de transversale de blastocyste d’Images créées pendant la chaude après Re-expansion
- Une fois l’échelle de mesure ensemble et la séquence d’images importées, mesurer les surfaces transversales du blastocyste pareillement comme décrit à l’étape 8, avec la seule différence étant que les surfaces transversales mesurées dans ces mesures ont des unités en µm2 .
15. modification du fichier de données dont les sections du blastocyste enregistré des Images créées pendant la chaude après Re-expansion
- Transférer les données de surfaces transversales du blastocyste enregistré dans le fichier .txt à un éditeur de feuille de calcul.
- Créez une variable de temps à côté de la variable de la zone et ajouter la première valeur de temps.
Remarque : dans ce cas, la première valeur de temps est définie sur 0 minutes, qui est le début de l’enregistrement time-lapse. Chaque prochaine fois consécutive est calculée en ajoutant 5 minutes la valeur de temps précédente. Cinq minutes est l’intervalle de temps entre deux enregistrements de time-lapse consécutives.
16. création d’un schéma de ligne
- Importer le fichier de données de feuille de calcul dans le logiciel d’analyse statistique pour créer une courbe de temps des changements de section transversale du blastocyste en temps pendant la phase d’équilibration de la vitrification ou re-expansion après réchauffement.
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Representative Results
Dans une démonstration, nous avons montré morphodynamique de blastocyste dans un seul previtrification et une phase de réchauffement de la planète après. Une différence dans le volume du blastocyste à la fin de la phase d’équilibration et au début de la récupération en milieu de culture a montré l’intensité du retrait d’embryon, qui est, en fait, l’intensité de la conservation d’embryons contre cristallisation de glace.
Comme il peut être remarqué sur la Figure 1 et 1 vidéo, blastocyste intact ne pas s’effondrer complètement en solution de l’équilibration. Le blastocèle ne contracté que partiellement, mais moins de 10 minutes, il a lentement atteint la taille de ré-expansion de 70 %. Contrairement à cela, le blastocyste artificiellement effondré complètement vidé le blastocèle immédiatement après le traitement au laser, mais dans la solution de l’équilibration, son volume n’a pas changé tout plus (Figure 2, Video 2). La présentation du blastocèle re-expansion dans le milieu de la récupération (Figure 3 et Figure 4) avec photomicrographie et ligne diagrammes montre des modèles différents de croissance blastocèle. Un affichage d’une seule mesure de la section transversale du blastocyste est illustré à la Figure 5.
Dans un milieu avec une concentration plus élevée des cryoprotecteurs vitrification, intacts blastocystes rétréci intensivement une fois de plus, tandis que le volume du blastocyste effondré est resté presque inchangé. D’une présentation graphique, en utilisant le protocole présenté ici, il est évident que le blastocyste intact subit une réduction progressive de la blastocèle (Figure 6), une fois dans la solution de l’équilibration et une fois dans le milieu de la vitrification, tandis que la s’est effondré de blastocyste atteint un stade ratatiné au début de l’intervention au laser (Figure 7). Cela pose la question que 10 minutes de la phase d’équilibration est vraiment nécessaire pour des blastocystes s’est effondrés, ou si ce délai pourrait être raccourci.
La présentation du blastocèle dilatation peut être linéaire ou interrompu avec plusieurs des plus grandes ou plus petites contractions (Figure 8).
Figure 1 : time-lapse microphotographie des changements d’un blastocyste intact pendant l’exposition à la solution de l’équilibration. Images individuelles ont été enregistrés toutes les 20 secondes. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : time-lapse microphotographie des changements d’un blastocyste artificiellement réduit pendant l’exposition à la solution de l’équilibration. Images individuelles ont été enregistrés toutes les 20 secondes. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : time-lapse microphotographie des changements d’un blastocyste intact pendant le réchauffement recoverypost. Images individuelles ont été enregistrés toutes les 5 minutes. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : time-lapse microphotographie des changements du blastocyste s’est effondré au cours de la chauffe-recoverypost. Images individuelles ont été enregistrés toutes les 5 minutes. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : affichage d’une seule mesure de la section transversale d’un blastocyste. Le blastocyste est encerclé avec précaution avec l’outil de sélection approprié dans le logiciel d’analyse vidéo. La zone pellucide est toujours exclue de la mesure. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : représentation des changements dans la section transversale d’un blastocyste intacte. Ces panneaux indiquent la représentation des changements dans la section transversale d’un blastocyste intact pendant l’exposition à la solution (A) de l’équilibration à la vitrification et (B) au cours de la récupération après réchauffement. Les unités de la section transversale sont par rapport à la section transversale du blastocyste initiale avant vitrification. La ligne pointillée reliant des panneaux A et B est imaginaire, ce qui représente les changements au cours de la vitrification, refroidissement à-196 ° C et le réchauffement à 37 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : représentation des changements dans la section transversale d’un blastocyste effondré. Ces panneaux montrent la représentation des changements dans la section transversale (A) un blastocyste s’est effondré au cours de l’exposition à l’équilibration solution (B) à la vitrification et (C) au cours de la récupération après réchauffement. Les unités de la section transversale sont par rapport à la section transversale du blastocyste initial avant de s’effondrer et la vitrification. La ligne pointillée à paroi A est imaginaire et représente le point de début et de fin lors de l’effondrement du blastocyste. La ligne pointillée imaginaire entre B et C, panneaux représente également les changements au cours de la vitrification, refroidissement à-196 ° C et le réchauffement à 37 ° C. Seules les lignes pleines dans les séries B et C sont le résultat des mesures réelles de la section transversale pendant le processus de récupération et d’équilibration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : représentation graphique des différents modes de récupération de blastocyste après réchauffement. La barre d’échelle est 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : vidéo time-lapse des changements d’un blastocyste intact pendant l’exposition à la solution de l’équilibration. La vidéo représente les modifications, qui durent près de 10 minutes en temps réel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2 : vidéo time-lapse des changements du blastocyste s’est effondré au cours de l’exposition à la solution de l’équilibration. La vidéo représente les modifications, qui durent près de 10 minutes en temps réel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Le protocole pour l’observation du blastocyste morphodynamique pendant et après que cryoconservation peut également être effectuée en utilisant des instruments similaires et des outils logiciels provenant d’autres fabricants. Time-lapse systèmes ajustés embryologie permettent la surveillance continue du développement embryonnaire. Le but de ce travail a été d’introduire la quantification du comportement de blastocyste lors de la préparation des blastocystes de vitrification et après leur réchauffement de la planète. Cela a été fait par la mesure objective des changements dans la morphologie sur une échelle de temps. Les résultats obtenus de ces mesures peuvent être mathématiquement analysés et comparés à d’autres résultats. Parmi les paramètres qui peuvent être suivies par le protocole décrit les changements dans la taille du blastocyste, son intérieur cell mass, le blastocèle, ou la zone pellucide dans un certain délai de temps. La taille peut être affichée comme la surface de la section transversale du blastocyste plus grande, la circonférence de blastocyste ou de diamètre et, après calcul, même en tant que son volume.
Dans des études précédentes à l’aide de systèmes de time-lapse, mesures de vitesse blastocèle expansion ont été faites que sur des embryons frais11. En céramique/réchauffé blastocystes, uniquement les formats des blastocystes ont été mesurées immédiatement après le réchauffement de la planète et avant le transfert d’embryon, ou le délai a été analysé au cours de laquelle réchauffé blastocystes re-étendues à la zone pellucide9,10 . Plus détaillée blastocyste re-expansion dynamique ont été analysée dans notre précédente étude8. Dans cette étude, le protocole morphométriques a déjà servi pour suivre le modèle du blastocyste re-extensions et vitesse après réchauffement. Bien que ces biomarqueurs de croissance blastocyste ont montré ne pas d’avoir une grande valeur prédictive pour l’implantation, ils peuvent être utilisés pour la comparaison du potentiel de rétablissement de blastocyste après vitrification et le réchauffement de la planète avec les protocoles et les médias de cryoconservation différents . À savoir, les contractions plues du blastocyste blastocèle re-expansion suggèrent la faiblesse de la couche de trophectodermal qui pourrait être causée au cours de la cryoconservation et son incapacité à résister à la pression faite par le blastocèle remplis de liquide.
Le protocole décrit morphométriques peut fournir de nombreuses analyses comparatives supplémentaires du comportement de blastocyste, non seulement après cryoconservation, en mesurant la vitesse et l’intensité des changements de volume, le nombre de contractions blastocèle partiel ou total blastocyste s’effondre, le temps de dilatation total blastocèle, ou le temps jusqu'à l’éclosion. En outre, il peut être utilisé au cours des phases de previtrification pour déterminer le moment optimal de blastocyste une exposition à différentes concentrations de cryoprotectants, a été présenté dans les résultats. Vanderzwalmen et coll. ont montré sur des ovocytes de souris que vitrification peut également être couronnée de succès si la pression osmotique intracellulaire ne parvient pas à un équilibre avec la solution de substances cryoprotectrices externe12. La phase seulement problématique pour l’enregistrement des blastocystes au cours de la conservation est la durée en solution de vitrification en raison du temps limité ; l’embryon doit être exposé à une concentration plus élevée des cryoprotecteurs et emballé dans la paille en moins de 90 secondes. Pour ces mesures, il recommande d’utiliser uniquement les blastocystes qui sont donnés pour la recherche. Néanmoins, des blastocystes cliniquement disponibles peuvent être enregistré et encore mesurée immédiatement après le réchauffement de la planète, dans le but d’observer comment ils se comportent en dilution et solutions de lavage. Immédiatement après un transfert de blastocyste de la solution de lavage dans le milieu de la restauration, les blastocystes ont tendance à flotter au dessus du fond. Ceci peut représenter une difficulté à maintenir l’embryon dans le plan focal même pendant l’enregistrement. Pour résoudre ce problème, il est recommandé de préparer un plat avec des gouttes aplaties du milieu. Un problème similaire a été observé par Vanderzwalmen et al. 12.
Dans d’autres recherches, il serait utile d’examiner si la durée d’exposition des blastocystes artificiellement réduits à cryoprotecteurs pourrait être réduite, par conséquent minimisant l’effet toxique de ces produits chimiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail est une partie du projet P3-0327 et recherche de programme recherche J3-7177, créée par la fondation de recherche slovène.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
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