Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Funktionel overflade-immobilisering af gener ved hjælp af omstændelig Strand forskydning litografi

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en simpel Litografisk metode for immobilisering af gen-længde DNA molekyler på en overflade, som kan bruges til at udføre celle-fri gen expression eksperimenter på biochips.

Abstract

Immobilisering af gener på lithographically strukturerede overflader giver studiet af opdelte gen expression processer i en åben mikrofluid bioreaktor system. I modsætning til andre tilgange til kunstige cellulære systemer, sådan en opsætning giver mulighed for en konstant forsyning med gen expression reagenser og samtidige dræning af affaldsprodukter. Dette letter gennemførelsen af celle-fri gen expression processer over længere perioder, hvilket er vigtigt for realiseringen af dynamiske gen regulerende feedbacksystemer. Her giver vi en detaljeret protokol for fabrikation af genetiske biochips ved hjælp af en simpel at bruge Litografisk teknik baseret på DNA streng forskydning reaktioner, som udelukkende bruger kommercielt tilgængelige komponenter. Vi giver også en protokol om integration af opdelte gener med en Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret mikrofluid system. Vi viser desuden, at systemet er kompatibelt med total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi, som kan bruges til direkte observation af molekylære interaktioner mellem DNA og molekyler, der indgår i blandingen, udtryk.

Introduction

Celle-gratis genekspression reaktioner er af stor interesse for forskellige anvendelser i biokemi, bioteknologiske og syntetisk biologi. Celle-fri udtryk for proteiner var medvirkende til fremstilling af ren protein prøver, som blev grundlaget for talrige undersøgelser i strukturbiologi. For eksempel, blev celle-fri systemer med succes brugt til udtryk for protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige at producere ved hjælp af celle-baseret udtryk. Navnlig, celle-fri genekspression reaktioner blev også brugt til at belyse strukturen af den genetiske kode, begyndende med de banebrydende eksperimenter af Nirenberg og Matthaei i 19613.

For nylig har der været en fornyet interesse i celle-gratis metoder inden for bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-fri systemer kan være forøget med ikke-biologiske forbindelser, og komponenter af forskellige biologiske oprindelse kan kombineres flere uden sammenligning7. Selv om celle-fri systemer har den tilsyneladende ulempe, at de ikke "vokse og dele", er det tænkeligt at forberede åben celle-fri bioreaktorer med grundlæggende metaboliske funktioner og lad dem syntetisere metabolitter når forsynet med enkel kulstof og energi indgange8. Inden for det nye syntetiske biologi lover celle-fri systemer at være en mere forudsigelig "kabinet" for gennemførelsen af syntetiske biologiske funktioner.

I øjeblikket, celle-fri gen expression reaktioner foretages enten ved hjælp af celle ekstrakter (fra forskellige kilder såsom bakterier, gær, insekter), eller omskrivning/oversættelse systemer, som var optimeret til forskellige applikationer (f.eks. prokaryote vs eukaryotisk genekspression, produktion af membranproteiner, osv.). En populær protokol til forberedelse af bakteriel celle ekstrakt (almindeligvis kaldt TXTL) blev leveret for nylig af V. Noireaux og kolleger9. Dens biofysiske egenskaber har været grundigt karakteriseret10, og TXTL systemet har været allerede anvendt med succes til at udføre en række komplekse biokemiske opgaver: fx samling af funktionelle Bakteriofager via celle-fri udtryk for phage genom11, syntesen af bakteriel protein filamenter12eller gennemførelsen af celle-fri gen kredsløb13,14.

Et andet system populære i celle-fri syntetisk biologi er den rene system, som er fremstillet af renset komponenter15,16. I forhold til TXTL systemet, indeholder det ikke nukleaser eller protein nedbrydning maskiner. Mens nedbrydning af lineære DNA er RNA molekyler eller proteiner mindre af et problem i den rene system, henfald veje er faktisk vigtigt for gennemførelsen af dynamiske funktioner. For at reducere effekten af exonuclease nedbrydning af lineære gen skabeloner i TXTL systemet (gennem RecBCD), har beskyttelse af slutningen GamS protein at blive tilføjede. Både TXTL og den rene system er kommercielt tilgængelige.

Et emne beslægtet nært med celle-fri biologi bekymringer undersøgelse af effekten af opdelingen på biokemiske reaktioner, og yderligere at skabe kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,,19 ,20. Forskning på kunstige celler involverer typisk indkapsling af en biokemisk reaktion system indersiden af vesikulære segmenter fremstillet af fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens sådanne systemer hjælpe med at udforske fundamentale aspekter af opdelingen eller fremkomsten af celleforandringer og selvkopierende strukturer, de står over for de typiske problemer af lukkede systemer: i mangel af en fungerende stofskifte og passende membran transportmekanismer, det er svært at holde opdelte reaktioner kørende i længere tid - brændstof molekyler er brugt op og affaldsstoffer akkumulere.

Et interessant alternativ til opdelingen i sådan celle-efterligne rum er den rumlige organisering af genetisk materiale ved hjælp af photolithographic metoder. Immobilisering af "gener på en chip" var banebrydende ved Bar-Ziv-gruppen på Weizmann-instituttet for mere end ti år siden21. Blandt de store spørgsmål, der skulle løses var uspecifikke adsorption af DNA og den potentielle denaturering af proteiner på chip overflade. Bar-Ziv et al. udviklet en dedikeret fotolitografi modstå betegnes "Daisy", som var sammensat af en reaktiv terminal silan for immobilisering af modstå molekyler på siliciumdioxid overflader, en lang polyethylenglycol (PEG) spacer, der forsikrede biokompatibilitet, og en photocleavable headgroup, som blev omdannet til en reaktiv Amin ved bestråling med ultraviolet (UV) lys. Det har vist sig at Daisy kan bruges til at immobilisere gen-længde DNA molekyler (med længder af flere kilo-basepar (kbp)) på en chip overflade. Fra en polymer fysik synspunkt repræsenteret systemerne polymer pensler podet på et fast underlag. På grund af DNA polyelectrolyte karakter er kropsbygning af disse pensler stærkt påvirket af osmotisk og andre ion-specifikke effekter22,23.

Vigtigst af alt, har det vist sig at substrat-immobiliseret gener er stadig funktionel og kan være transskriberede og oversættes til RNA og protein. Gen pensler er tilgængelige for RNA polymeraser fra løsning24, og den komplekse makromolekylære blanding af omskrivning/oversættelse er ikke denatureret på overfladen. En af fordelene ved immobilisering af genetiske komponenter på et substrat er, at de kan betjenes i en åben mikrofluid reaktor system, der løbende leveres med små forløber molekyler og fra hvilke affaldsprodukter kan være fjernet25 , 26.

Vi har for nylig udviklet en variant af denne metode kaldes Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var baseret udelukkende på kommercielt tilgængelige komponenter og udnyttet sekvens-specifikke DNA streng invasion reaktioner for realiseringen af en enkel at implementere omstændelig litografi procedure til oprettelse af chip-baserede kunstige celler. En skematisk oversigt over proceduren er vist i figur 1. Det er baseret på DNA hårnål molekyler, der indeholder en photocleavable gruppe, der er immobiliseret på et biokompatibelt PIND lag. Photocleavage af hårnålen udsætter en enkeltstrenget fodfæste sekvens, gennem hvilke DNA molekyler af interesse (som indeholder den "fortrænger" DIS sekvens) kan være vedhæftet via fodfæste-medieret strand invasion.

Mens Bephore er potentielt enklere at gennemføre, Daisy tillader realiseringen af meget tætte og rene "gen pensler", som har fordele i visse anvendelser. I princippet, men kunne Daisy og Bephore litografi nemt kombineres. En beslægtet litografi metode udnytter DNA streng forskydning for strukturering DNA børster på guld var tidligere udviklet af Huang et al., men blev ikke udnyttet i forbindelse med celle-fri gen expression28,29.

I følgende protokol giver vi en detaljeret beskrivelse af produktionen af DNA børster for celle-fri genekspression ved hjælp af metoden Bephore. Vi beskriver hvordan gen chips er fabrikeret og demonstrere brugen af Multi-trins foto-litografi for den rumligt struktureret immobilisering af gener på en chip. Vi diskuterer også fabrikation af reaktion kamre og anvendelsen af mikrofluidik for udførelsen af på chip gen expression reaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: En tidsplan for foranstaltninger i de forskellige sektioner er givet i de supplerende oplysninger (afsnit 1).

1. hak fabrikation

Bemærk: som substrater, brug silicium wafers (100 mm i diameter, 0.525 mm tykkelse) med en 50 nm tykke lag af siliciumdioxid eller glas dias (24 mm x 24 mm, no. 1,5; 22 mm x 50 mm, nr. 4). Afhængigt af programmet, kan andre størrelser og tykkelser være mere egnet.

  1. Rengøring af substrater via en RCA ren procedure (vand, ammoniakopløsning NH3(aq) 30% og hydrogenperoxid H2O2 30%, i forholdet 5:1:1)
    1. Bland vand og ammoniak løsning i et bægerglas glas og varme blanding til 70 ° C på en varm tallerken under omrøring.
    2. Tilføje hydrogenperoxid og substrat. For højere overførselshastighed, skal du placere flere substrater (især små glas dias) i en holder, polytetrafluorethylen (PTFE).
    3. Efter 30 min, tag substratet, skylle det grundigt med vand fra en vaskeflaske og tør det med en nitrogen pistol. Straks fortsætte med PEGylation af substratet.
      Forsigtig: Bære hud-og øjenbeskyttelse og arbejde i et stinkskab. Luk ikke spildbakken stramt for at muliggøre gas release fra blandingen.
  2. PEGylation af underlaget
    Bemærk: Gentagen nedfrysning og optøning af Biotin-PIND-silan stock reducerer reaktivitet af silan på grund af kondensering af luft fugt. Derfor forberede 5 mL-rør med passende mængder af Biotin-PIND-silan (f.eks. 10-20 mg) og fylde dem med tørt argon før frysning dem indtil brug.
    1. Opløses Biotin-PIND-silan i tørre toluen ved vortexing (5 mg/mL).
    2. Placer substrat i et glas petriskål (120 cm i diameter, 2 cm højde) i et stinkskab.
    3. Afpipetteres løsning (≈200 µL for et enkelt glas dækning slip, et par mL til en stor silicium wafer) på substrat, der dækker hele overfladen, men undgå løsningen flyder over kanten af underlaget.
    4. Luk petriskålen. For at formindske udtørring af substratet, tilføje en ekstra dækning med en våd køkkenrulle.
    5. Efter 30 min, tilsættes ca. 40 ml isopropylalkohol, så tag substratet, skyl det igen grundigt med isopropylalkohol og tør det med en nitrogen pistol (til glas lysbilleder, Husk pegyleret side). Gemme underlaget i mørke indtil brug.
      Forsigtig: Bære hud-og øjenbeskyttelse og arbejde i et stinkskab.

2. forberedelse af gener for immobilisering

Bemærk: Primer sekvenser, DNA ændringer og en eksemplarisk PCR-protokol er angivet i de supplerende oplysninger (afsnit 2-4).

  1. Bruge modificerede primere til at forstærke gen af interesse ved polymerase kæde reaktion (PCR). En primer bærer en fluorophore til visualisering i Fluorescens mikroskopi, og anden primeren er adskilt fra DIS sekvens af en triethylene glycol spacer for at holde DIS sekvens enkeltstrenget hele PCR.
  2. Rense DNA ved hjælp af en spin kolonne rensning kit og måle koncentrationen ved hjælp af en absorption fotometer. Koncentrationen bør ikke være meget lavere end 100 nM.
  3. Justere koncentrationen af NaCl til 1 M ved hjælp af en koncentreret 5 M NaCl opløsning. Den høje saltkoncentration letter DNA børste forsamling proces22.

3. fotolitografi

Bemærk: Photocleavable DNA (PC) behandles kun i en gul-lys miljø. Gul folie til renrum kan bruges til at filtrere på baggrund af konventionelle hvide lys lamper.

  1. Forberedelse af substratet
    1. Forberede Bephore-mix (1 µM streptavidin, 1,5 µM PC DNA, 7,5 µM PH DNA i 1 x PBS (fosfatbufferet saltopløsning)) og passivation mix (10 µM umærket DIS DNA, 1 mg/mL BSA (bovin serum albumin), i 1 x PBS). Begge dele kan opbevares i mørke i køleskabet i flere uger.
    2. Klip underlaget i mindre stykker (et par cm2), enten ved hjælp af et glas kutter eller ved at bryde en silicium wafer langs en krystal linje ved at trykke på en kant med en skalpel. Som en enkel justering er markeret, skal du oprette en kort ridse fra midten mod kanten af underlaget ved hjælp af glas cutter. Blow små partikler ud chip med en nitrogen pistol.
    3. Bland to dråber af to-komponent silikone lim, omrøring det f.eks. med en pipette spids, og anvende lim på overfladen af chip, så området omkring spidsen af scratch tomt (figur 2A). Limen giver en hydrofobe barriere, der letter vask trin og reducerer mængden af DNA, der kræves for inkubationer. I et senere trin, kan limen være let pillet ud.
    4. Ruger 10 µL (eller så meget som nødvendigt for at dække chippen) af Bephore-mix ved stuetemperatur (RT) på chippen. Under inkubation, sted chip i en boks, f.eks. en pipette tip box delvist fyldt med vand for at mindske fordampningen.
    5. Efter 1 h, vaske chippen ubundet flere gange (5 x med 50 µL) af pipettering med 1 x PBS til at fjerne Bephore-mix.
    6. Tage så meget buffer som muligt uden at udtørre chippen og Ruger 10 µL af passivation-mix på chip på RT.
    7. Efter 2 h, vaske chippen flere gange (10 x med 50 µL) af pipettering med 1 x PBS fjerne ubundne passivation agenter.
  2. Projektion litografi
    Bemærk: For litografi, en opretstående mikroskop med en 60 x vand fordybelse mål kan bruges. Belysning gange afhænger af mål, den lyskilde, masken, substrat (silicium-chip eller glas dias) og den ønskede DNA overflade tæthed. Med en 60 x mål, typisk eksponeringstider varierede fra under et minut for en to-trins litografi med overlappende områder (15 s for silicium-chips, 45 s til glas lysbilleder) til 2-3 min for en fuld eksponering. Brug ikke en cover slip (undtagen smeltet kvarts) oven på underlaget, da det blokerer UV-lys.
    1. Skære en trykt photomask (Se supplerende fil med eksemplarisk litografi masker og supplerende afsnit 5) til en passende størrelse til at passe en egnet maske indehaveren, som kan indsættes på placeringen af feltet stop (figur 2B). For præcis multi-step litografi, justere maske med justering mærker på indehaveren.
    2. Sætte underlaget på en mikroskopi dias og flytte det til stadiet mikroskop. Mønstret af Bephore glas lysbilleder, indsætte sort folie (f.eks. ekstra folie fra den trykte komponeneter) mellem mikroskopi og Bephore dias til at give en mørk baggrund for litografi.
    3. Indsæt et rødt filter i belysning stien, fokus på substrat overflade og navigere til regionen af substrat, som vil blive udsat, fx region på spidsen af bunden.
    4. Indsæt maske indehaveren, blokere belysning og ændre til UV-filter (figur 2 c). På en lav lysintensitet, åbne lukkeren og bruge kameraet til at fokusere hurtigt masken på underlaget.
    5. Blokere den lette vej til kameraet og belyse substrat på en høj lysintensitet for de ønskede eksponeringstid.
    6. Tag eksemplet fra mikroskop og fjern forsigtigt så meget buffer som muligt fra underlaget uden at udtørre den.
    7. Tilføje 10-20 µL DNA med DIS sekvens. Sted substrat i en våd boks til at holde det fra tørring. Inkuber DNA på substrat for 2 h (oligonukleotider ved en micromolar koncentration) eller flere timer/overnatning (kbp lange DNA på ca. 100 nM koncentration) på RT.
    8. Fjerne DNA fra chippen og vaske det flere gange med 1 x PBS. For at reducere spild af DNA (især for længere fragmenter), gemme DNA taget fra underlaget og genbruge den.
  3. Multi-trins litografi
    Bemærk: For præcis justering af to eller flere engagementer i et enkelt område, holde prøven på scenen for at undgå kantede forskydning. Kontroller, at chippen ikke tørre op. Positionering af flere DNA pensler i forskellige regioner på et substrat, brugsfasen motoriserede drev til det udpegede område eller bruge et substrat med passende justering mærker.
    1. Efter den første eksponering (punkt 3.2), der inkuberes DNA med DIS sekvens på underlaget. Det er vigtigt, at alle bindingssteder som følge af den første eksponering er besat. Derfor, inkuberes oligonukleotider (10 µM) i ca 3 timer ved RT.
    2. For at immobilisere DIS mærket gener, placere dem på underlaget i flere timer eller natten over på RT, og derefter vaske prøven og tilføje passivation blandingen til en anden 2 h på RT. Fortsæt med den næste eksponering.
    3. Gentag de forrige trin for yderligere engagementer, (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS enheder

Bemærk: Fortrinsvis, arbejde i et rent værelse. Fabrikation af en PDMS enhed følger en standard-protokol, som beskrevet af McDonald et al. 30

  1. Fabrikation af master forme via fotolitografi
    1. Rense en silicium wafer (76.2 mm diameter, 525 µm tykkelse) ved hjælp af sonikering i acetone i 5 min ved høj effekt og skyl med isopropylalkohol og afioniseret vand. Derefter placere wafer på en varmeplade ved 150 ° C i 15 min.
    2. Valgfrit, for at forbedre vedhæftning af modstå til wafer, tilføje 2-3 mL friktion promotor og spin på 3000 rpm for 30 s. varme wafer til 120 ° C i 2 min.
    3. Tilføje om 2-3 mL photoresist (Se Tabel af materialer). Spin wafer for 15 s på 500 rpm, så ved 3000 rpm for 30 s. Dette bør resultere i en 20 µm tykt lag af photoresist. Lad photoresist lag slappe af ved stuetemperatur i 10 min.
    4. Pre-eksponering bages, at placere wafer på en varm tallerken ved 50 ° C i 2 min., derefter ved 85 ° C i 5 min.
    5. Sted wafer under photomask med blueprint af rum. Helst bruge en maske-aligner. Photomask skal have en opløsning på 64.000 dpi (Se supplerende fil med litografi masker og supplerende afsnit 5).
    6. Udsætte wafer for 1 min med UV-lys (-line 5-10 mW/cm2) gennem photomask.
    7. Efter eksponering bages, læg wafer ved 50 ° C i 2 min og derefter på 85 ° C i 5 min. Lad wafer køle ned og slap af i 1 time ved stuetemperatur.
    8. Sted wafer i et fad med udvikleren for 3 min mens forsigtigt agiterer bægerglasset. Skyl wafer med isopropylalkohol og tør det med en nitrogen pistol. Placer wafer på en varmeplade ved 130 ° C i 45 min.
  2. Forberedelse af enhedens PDMS
    1. Mix PDMS base og PDMS hærdning agent i forholdet 10:1 og hæld det over på wafer i en lukket beholder indtil et lag på ca. 5 mm har dannet over wafer. For at opnå en PDMS enheden kun 1 mm tykkelse, spin i stedet pels wafer med PDMS på 100 rpm i 2 min.
    2. Beholderen anbringes i en ekssikkator og anvende et vakuum (omkring 85 kPa) i ca 30 min. Derefter, varme PDMS til omkring 70° C i 1-2 timer i ovn.
    3. Adskille PDMS enheden fra wafer. Skær PDMS i plader, således at hvert stykke indeholder et sæt af rum. I tilfælde af PDMS vil blive forbundet til et mikrofluid setup, punch huller (1 mm i diameter) som en tilgangs- og afgangsåbninger i enderne af levering kanal.
    4. Ren PDMS med isopropylalkohol og afioniseret vand og tør det med en nitrogen pistol. Gemme PDMS støv-fri.

5. opdelte genekspression

Bemærk: Følgende procedure beskriver forsamlingen af en prøveholderen (figur 3) til iagttagelse af opdelte genekspression på en inverteret mikroskop med et bur inkubator for temperaturkontrol. Indehaveren var bygget ved hjælp af let tilgængelige materialer og værktøjer (3,5-5 mm tyk polyvinylchlorid (PVC) plast, skruer og møtrikker, drill) og kan tilpasses til at passe forskellige typer mikroskoper. Trinene beskrevet i 5.1 og 5.2 skal udføres således, at begge dele af indehaveren er parat på samme tid.

  1. Bunden indehaveren forsamling
    1. Forberede en Bephore chip med positionsmærket netop (f.eks. en skramme) og lim det på chip indehaver bruger dobbelt-sidet klæbebånd (figur 3B). Chippen bør være større end den PDMS enhed, som vil dække det.
    2. Immobilisere én eller flere gener på en chip (Se afsnit 2 og 3).
    3. Tilføj nogle vakuum fedt omkring den centrale hul i bunden indehaveren, så stik i chip indehaveren.
      Bemærk: Chip indehaveren nu klæber til indehaveren af bunden ved hjælp af fedt, samtidig bevare muligheden for re positionering af chip i x-y-planet.
  2. Top indehaveren forsamling
    1. Forberede en tynd PDMS chip med rum ved hjælp af spin coating procedure i trin 4.2.1. Skære PDMS så lille som muligt, forlader en kanal åbne til den ene side at give mulighed for udveksling af affald og forløber molekyler ved diffusion.
    2. Rengør et glas dækning slip (24 mm x 24 mm, no. 1,5) og bagsiden af PDMS chip (side uden rum) med ilt plasma for 42 s (drives på 200 W og 0,8 mbar med prøven i et Faraday bur).
    3. Placer PDMS chip midt på glas dias med de rum, der peger opad. Bage glas med PDMS for 1 h ved 70 ° C.
    4. Tilføj nogle vakuum fedt omkring det store hul i den øverste indehaveren.
    5. Før du starter eksperimentet, rene glas dias og PDMS chip med ilt plasma for 42 s til at gengive PDMS hydrofile.
    6. Placer glas dias med PDMS holderen til den øverste ( figur 3 c) og tryk forsigtigt på glas på fedt (figur 3 c).
  3. Indehaveren forsamling
    1. Forberede 100 µL af en celle-gratis expression system og holde det på is.
    2. Forsigtigt fjerne bufferen fra chippen og vaske det engang med 10 µL af celle-gratis expression system. Dernæst tilsættes 60 µL af celle-gratis expression system på chippen og fjerne den to-komponent silikone lim fra kanten af chippen (allerede fjernet i figur 3B).
    3. Tilføj 20 µL af ekspressionssystem på PDMS. Efter at placere denne droplet til PDMS, hurtigt tjekke i stereoskopisk mikroskopet at rum er godt våd og uden luftbobler. Hvis der er luftbobler, forsøge at vaske dem med resten af celle-gratis expression system.
    4. At samle to stykker af indehaveren og for at justere kamre og DNA pensler, arbejde under en stereoskopisk mikroskop og immobilisere indehaveren af bunden med en grebets arm, så de to skruer og wingnuts er let tilgængelige med begge hænder (figur 3D-F ).
    5. Indsæt den øverste indehaveren i bunden holderen og sænke det indtil celle-gratis expression system dråber fuse (figur 3D). Kontrollere gennem den stereoskopiske mikroskop om rum og positionsmærket netop er i en lignende region i x-y-planet, ellers trækker op den øverste indehaveren og fornyet stilling glasset slide på den øverste indehaveren.
    6. Fra bunden, skal du skrue op i wingnuts, indtil de rører den nederste side af indehaveren. Omhyggeligt stramme wingnuts, samtidig med at tilpasse rum og chip i den x-y-fly via håndtag i bunden af chip indehaveren (figur 3). En gang i kontakt, stramme wingnuts kun meget forsigtigt (figur 3F).
      Bemærk: Dette trin kræver nogle erfaringer og afhænger af opsætningen af eksperimenterende. Under mikroskop, kan interferens mønstre som følge af væske mellem PDMS og glas indikere at den anvendte kraft er for lille, mens en lavere fluorescens intensitet (fra en DNA børste eller udtrykte proteiner) i midten af et rum antyder en for høj pres (Se også supplerende oplysninger, afsnit 6).
    7. Sprøjte svamp i anti-fordampning kabinet med vand og sæt kortholderen i boksen. Fyld en 5 mL sprøjte med to-komponent silikone lim og bruge den til at forsegle boksen (figur 3 g).
    8. Overføre boksen til en temperatur-kontrolleret mikroskop og DNA pensel og reaktion i Fluorescens mikroskopi billedet. Selv uden belysning svinder fluorescens af DNA pensel i en celle-gratis expression system. Ikke desto mindre bevarer penslen sin aktivitet, som kan påvises ved gentagne genekspression fra samme pensel.
      Bemærk: Når du bruger en Bephore glas dias i stedet for en silicium-chip, position (øverste/nederste) af PDMS og Bephore chip kan udveksles, tillader anvendelse af mål med mindre arbejde afstande.

6. vedvarende udtryk i mikrofluid enheder

Bemærk: Den eksperimentelle setup er samlet fra de dele, der er vist i figur 4A. Oplysninger om montering af den temperatur-kontrollerede fase er givet i de supplerende oplysninger (afsnit 7).

  1. Celle-gratis expression system og slanger
    1. Forberede den celle-fri ekspressionssystem i et prøveglas (ca. 200 µL). Polystyren perler mærket med fluorescerende farvestoffer kan tilføjes senere skærm strømningshastigheden gennem en levering kanal.
    2. Tilslut røret til et pres controller. Glasset anbringes i en stor is reservoir, der holder kolde for omkring 12 timer. Refill is, hvis det er nødvendigt.
      Bemærk: Som et alternativ til et pres controller, en sprøjten pumpe giver en konstant gennemstrømningshastighed på celle-fri ekspressionssystem selvom flow modstand ændringer, fx på grund af luftbobler, som kan hjælpe med lang sigt forsøg.
    3. Tilslut røret indeholder celle-gratis expression system til PTFE slanger (indre diameter 0,8 mm), som når ud til det opvarmede fase. Bryde en sprøjte nål (diameter på 0,9 mm) i 1-2 cm stykker med stumpe ender og indsætte et stykke i PTFE slanger. Det vil senere fungere som stik til PDMS. Prøv at minimere længden af slangen mellem scenen og røret (figur 4 c).
    4. For at køle PTFE slangen, Pak det omkring større gummi slange, der er tilsluttet en is vandreservoir og en peristaltisk pumpe. Tape dem sammen med Scotch tape (figur 4 c).
  2. Top indehaveren forsamling
    1. Rengør den flade side af PDMS chip med ilt plasma (42 s) og placere den på en mikroskopi dias med huller montering indsugnings- og udstødningsporte af PDMS (figur 4B). Huller i glasset kan være boret på forhånd med et glas bore hovedet. Sørg for, at mikro-afdelingerne ikke står glas dias.
    2. Anvende dobbelt-sidet selvklæbende tape til den flade side af indehaveren PDMS. Holde sig et stykke sort folie (f.eks. fra et litografi maske) i området mellem de to huller af indehaveren til at undgå baggrund fluorescens fra selvklæbende tape.
    3. Stick glas dias med PDMS chip til indehaveren.
    4. Behandle PDMS og PDMS holderen med den vedlagte glas dias med ilt plasma i en plasma renere (42 s).
    5. Anvende vakuum fedt omkring det store hul i den øverste indehaveren og indsætte PDMS indehaveren (figur 4B). Indehaveren af PDMS nu klæber til den øverste indehaveren, samtidig bevare muligheden for re positionering i x-y retninger.
    6. Tilslut PTFE slanger med sprøjte nål stik tilsluttes udluftningsindgangsstudsen PDMS chip. For at lette adgangen til PDMS gennem den øverste indehaveren, kan den øvre plastplade fjernes kort for dette og de følgende trin.
    7. Indsæt et andet stykke af PTFE slanger (ca. 5 cm) med en sprøjte nål stik på outlet (figur 4D).
    8. Placer PDMS indehaveren i den øverste indehaveren, så det er gratis at flytte i alle retninger. Sted den øverste indehaveren løst på opvarmet scenen som i figur 4E uden stramning nogen wingnuts.
    9. Med mikroskop, navigere til placeringen af PDMS rum og center dem i kameraets synsfelt. Flyt ikke scenen fra dette punkt.
    10. Fjern den øverste indehaveren med PDMS fra scenen.
  3. Opvarmet fase og Bephore glas dias
    1. Indstil temperaturen af stadiet opvarmet til 37 ° C
    2. Lim en Bephore glas dias (nr. 4) med gen børster til temperatur-kontrollerede fase af inverteret fluorescens mikroskop med dobbeltklæbende tape, med positionsmærket netop omtrent i midten af den mikroskop synsfelt. Denne placering af positionsmærket netop sikrer, at rum vil blive sænket omtrent til samme region.
    3. Tage et billede i den tilsvarende fluorescens kanal af genet pensel og markere dens position i kamerabilledet.
    4. Fjerne bufferen fra gen børste, men lad det gå tør ikke. Tilføj 20 µL af celle - gratis expression system til gen børste og bruge pincet til at fjerne silikone lim ramme.
  4. Montering af mikrofluid opsætning
    1. Tilføje pres til prøveglas, indtil den celle-fri ekspressionssystem har fyldt PTFE slanger og vises i bunden af enheden PDMS. Derudover afpipetteres 10 µL af celle-gratis expression system på mikro-kamre på PDMS. Kontroller, at rum, der er fri for luftbobler.
    2. Omhyggeligt lavere øverste indehaveren diaset glas og justere mikro-kamre med gen pensel. Før både PDMS og justering mark nå samme brændplanet, bruge de små skruer på bagsiden PDMS indehaveren til at justere præcist x-y-placering og orientering af PDMS enheden med gen børste (figur 4E).
    3. Hold positionen og tryk på PDMS på glas dias ved at stramme wingnuts langs de skruer, der forbinder den øverste indehaveren til mikroskop fase (figur 4E).
    4. Øge trykket i røret som indeholder celle-gratis expression system og overvåge strømmen af de fluorescerende perler gennem levering kanal (flow priser mellem 0,5 til 5 µl pr. time anbefales) (figur 4F). Hvis det er nødvendigt, øge presset fra PDMS på glasset ved at stramme wingnuts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

To-trins litografi: figur 5 viser resultatet af en Litografisk totrinsproces på glas dias med overlappende mønstre af fluorescently mærket DIS tråde.

Udtryk for en fluorescerende proteiner fra et gen pensel: figur 6 viser udtryk for de fluorescerende proteiner YPet fra immobiliseret DNA. På flere punkter i tid vi vurderet gen expression sats af delvis blegning de fluorescerende proteiner og observere inddrivelse af fluorescens signal, ses bort fra den øjeblikkelig tilbagesøgning, som ikke skyldes protein udtryk. Efter den første blegning på to timer af udtryk, fluorescens-intensiteten inddrives hurtigt og steg over dets værdi før blegning. Efter fire og seks timer, gjorde fluorescens ikke gendanne til sin tidligere intensitet, der angiver, at uden levering af frisk udtryk mix, reaktionen opsagt efter ca 3-4 timer.

Kobling til mikrofluidik: genekspression kan fastholdes over længere tid ved at levere udtryk rum med ekstra forløber molekyler via mikrofluidik. Figur 7 viser et sådant system giver udtryk for YPet over 10 h.

JOHANNAS observation: Bephore kan også anvendes til at studere samspillet mellem fluorescently mærket proteiner og DNA pensel på enkelt-molekyle niveau. Især i støjende omgivelser, litografi hjælper med at skelne mellem specifikke og uspecifikke interaktion med pensel eller overfladen, henholdsvis. Figur 8 giver sådan et eksempel med fluorescently mærket T7 RNA polymerase bindende eller overholde fortrinsvis DNA penslen i forhold til den omgivende overflade.

Figure 1
Figur 1 : Bephore fotolitografi. A. et substrat med en overflade af siliciumdioxid (SiO2) er dækket med et lag af biotinylated polyethylenglycol (PEG-bt), som er biokompatible og muliggør fastgørelse af en photocleavable DNA hårnål via Biotin-streptavidin interaktioner. Her, PC indeholder sekvens domæner abcb * og en photocleavable ændring (lilla stjerne) og er hybridiseret at strand PH med domæne en *. B. Ultraviolet (UV) belysning kløver PC, frigive en DNA-fragment (cb *) i løsning. C-D. Den resulterende enkeltstrenget region på PC (b) aids som en fodfæste for forskydning af PH af en fluorescently mærket (grøn stjerne) DIS strand. E. også længere, dobbelt-strenget DNA ("skabelon") kan knyttes til mønstret overflade. Sådanne DNA er udarbejdet af PCR med en primer transporterer en DIS sekvens på sin 5' ende, hvor primer og DIS er adskilt af en triethylene glycol spacer at holde DIS enkeltstrenget under PCR (Se også supplerende oplysninger, punkt 2-4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Prøve forberedelse til fotolitografi. A. placere en Bephore chip med en positionsmærket netop på en mikroskopi dias eller en anden chip indehaveren (f.eks. indehaveren i figur 3B). Anvende to-komponent silikone lim som en hydrofobe barriere langs kanten af chippen (trin 3.1.2-3). B. Placer maske en maske holderen til. Her, vi fjernet iris af feltet stop og ændret holderen, så masken kan afholdes af små magneter. Præcise (kantet) justering i Multi-trins litografi, sikre at justering markerer på indehaveren og maske match (trin 3.2.1). C. at navigere på chippen og justere maske med justering mærker på chippen glide i den røde filter. For UV-eksponering, indsætte UV-filter (trin 3.2.2-5). Figur gengivet fra den støtte oplysninger af tidligere arbejde27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Samling af en holder til observation af opdelte genekspression. A. dele af indehaveren (lineal enhed: cm). B-C. Øverste og nederste del af indehaveren samles separat, med bunden indehaveren transporterer en mønstret Bephore chip (afsnit 5.1) og den øverste indehaveren transporterer en PDMS chip med rum (punkt 5.2). D-F. Chip og PDMS er omhyggeligt bragt i tæt kontakt, samtidig observere og tilpasse rum og DNA pensler i en stereoskopisk mikroskop (trin 5.3.1-6). G. før du overfører indehaveren til en omvendt, temperatur-kontrolleret mikroskop, hele systemet er indkapslet i en anti-fordampning boks (trin 5.3.7-8). Figur gengivet fra den støtte oplysninger af tidligere arbejde27. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Mikrofluid installation og prøve holder til den opdelte genekspression. A. dele af prøveholderen, PDMS enhed, temperatur-kontrolleret mikroskop scenen og Bephore glas dias (lineal enhed: cm). B. en mikroskopi dias transporterer PDMS med rum er limet til PDMS indehaveren og udsat for ilt plasma samt PDMS i en plasma renere. PDMS er derefter indsættes i den øverste indehaveren (trin 6.2.2-5). C. celle-gratis expression system tube er tilsluttet en pres controller og lagt på is. Slangen (rød stiplet linje i indsatsen) for celle-gratis expression system er køles af gummi slanger (blå stiplet linje) gennem hvilken is vand pumpes af en peristaltisk pumpe (afsnit 6.1). D. Slangen er tilsluttet indløb holdning til PDMS enhed. Et andet stykke af slangen er tilsluttet stikkontakt (trin 6.2.6-7). E. den øverste indehaveren er placeret på stadiet mikroskop og omhyggeligt sænkes mod Bephore dias. PDMS indehaveren kan stadig flyttes i x-y-fly til at justere rum i PDMS med gen børste på Bephore chip. Wingnuts bruges til at presse PDMS på Bephore chip og lave den øverste indehaveren til mikroskop fase (trin 6.4.1-3). F. celle-fri ekspressionssystem pumpes gennem mikro-kanaler i PDMS og genekspression fra DNA pensler kan overvåges i epifluorescensmikroskop mikroskopi (trin 6.4.4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : To-trins fotolitografi. A-B. Fluorescently mærket oligonukleotider (grøn: ATTO 532; red: Alexa Fluor 647) var fortløbende immobiliseret på en Bephore glas dias via maske projektion litografi med eksponeringstider på 45 s. C. Overlejring af subfigures A og B, demonstrerer den præcise justering af enkelt engagementer. Skalere barer: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Opdelte genekspression. A. A DNA børste på en Bephore glas dias (UV eksponeringstid: 2 min), kodning for fluorescerende protein YPet blev justeret med et rum på en PDMS chip (Se afsnit 5 og figur 3). B. genekspression i salen med DNA viste en stærk fluorescens signal med et protein koncentration forløb danner langs en kanal, som tilsluttet salen til udtryk mix uden for PDMS enhed. Kontrol kammer uden immobiliseret gener forblev relativt dark. C. fluorescens intensitet profil over tid i begge kamre. Hver to timer de fluorescerende proteiner var delvis bleget (sorte pile) til at kontrollere, om udtrykket var stadig aktiv. Efter 4 h, gjorde fluorescens ikke gendanne til sin tidligere intensitet, der angiver, at udtrykket havde opsagt. Skalere barer: 300 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Vedvarende opdelte genekspression. A. A DNA børste på en Bephore glas dias (UV eksponeringstid: 2 min), kodning for YPet blev justeret med et rum på en PDMS chip. Rum, der er tilsluttet en levering kanal (hvid pil) hvorigennem celle-fri ekspressionssystem pumpes (Se afsnit 6 og figur 4). B. de rum, der indeholder genet børste viser et fluorescens signal fra YPet udtryk (i grønt) af celle-fri gen expression system. Den tilstødende rum uden et gen børste forbliver relativt dark. Frisk komponenter af den celle-fri ekspressionssystem flow gennem levering kanal og diffus i rum, mens affaldsprodukter transporteres væk. C. fluorescens intensitet profil over tid i begge kamre. De fluorescerende proteiner var delvis bleget på forskellige punkter i tid (sorte pile) til at kontrollere, om udtryk var stadig aktiv. På grund af flow i levering kanal, blev Gen-ekspression opretholdt for mindst 10 h. (peak i det røde spor præget af den røde pil var forårsaget af en luftboble, der midlertidigt drænet løsning fra rum). Skalere barer: 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Enkelt-molekyle studier på Bephore glas dias i total interne reflection Fluorescens mikroskopi (TIRFM). A. mål-type TIRFM giver mulighed for enkelt-molekyle imaging tæt på glas-vand-grænseflade. Vi ubevaegeligt fluorescently mærket gener (grøn, ATTO 532, UV eksponeringstid: 2 min) med en T7 promotor langs lithographically defineret striber og observerede opførsel af T7 RNA polymerase (orange, mærket med Alexa Fluor 647) interagere med overfladen. B. fluorescens billede viser to striber af immobiliserede gener. C. T7 RNA polymeraser vedhæfte specifikt og ikke-specifikt til overflade (enkelt billede, 50 ms eksponeringstid). D. En gennemsnitlig billede fremstillet af alle rammer af en video fluorescens (5.000 rammer som i subfigure C) udsætter RNA-polymerase specifikke interaktionen med DNA pensel. Skalere barer: 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bephore litografi er en robust og alsidig teknik for den mønstrede immobilisering af DNA eller RNA. Endnu, proceduren, der omfatter flere trin, som - hvis ændret - kan være en kilde til fejl eller reduceres systemets ydeevne.

Et afgørende skridt i fabrikation af Bephore chips er PEGylation af substrat, som giver biokompatibilitet af overfladen. Her er trinnet rengøring med en RCA procedure vigtigt, da det også aktiverer overflade for den efterfølgende silanisering. Under den faktiske PEGylation, skal underlaget ikke tørre ud. Derudover oplagres silan-PIND-Biotin hensigtsmæssigt at bevare sin reaktivitet (afsnit 1.2) og undgå crosslinking. For at vurdere resultaterne af PEGylation, kan substrater inkuberes med fluorescently mærket streptavidin og i forhold til ikke-pegyleret kontrol. Med held bør pegyleret substrater binde betydeligt mere streptavidin end kontrol.

Også, i senere faser af den litografiske proces, tørring af chippen har negative virkninger, som f.eks. fjernelse af allerede bundne DNA eller en højere adsorption af DNA til eksponerede områder på underlaget.

Som nævnt ovenfor (punkt 3.2), opløsning af den litografiske proces og de nødvendige eksponeringstider afhænger af opsætningen af eksperimenterende (mål, lyskilde, osv.). Derfor, i et første skridt, bør en bred vifte af eksponering gange testes.

For gen expression eksperimenter, bør opsætningen af eksperimenterende tilpasses for at passe den tilgængelige hardware (mikroskop, temperaturregulering, osv.). Vi viste to sådanne implementeringer, en for kort eksperimenter (4 h, punkt 5), hvor systemet var indkapslet i en boks for at reducere fordampningen af udtryk mix, og en for lang observation (afsnit 6), hvor en mikrofluid enhed aktiveret en kontinuerlig levering af forløber molekyler. I begge tilfælde, justering af DNA børster på underlaget og rum i PDMS repræsenteret det sværeste skridt. Vi anbefaler derfor forsøger dette trin flere gange med en dummy substrat før ved hjælp af en mønstrede (Se også supplerende oplysninger, afsnit 6). I store systemer af forskellige gen forsamling kan pensler, lang inkubationstid gange, præcise kantede justering af kamre og børster over lange afstande, og forurening af adsorption af DNA til ikke-mønstrede regioner afhængig af kvaliteten af passivation, udgøre begrænsninger for størrelsen af praktisk muligt systemer.

Et alternativ til denne teknik blev demonstreret af Karzbrun et al. 25, der skabte rum i en chip af Induktivt koblet plasma reaktiv-ion radering (Bosch proces), efterfulgt af plasma-forstærket dampudfældning (PECVD) af en siliciumdioxid lag. Efter overfladen functionalization, mønstre og placering af nanoliter DNA dråber af en pipettering robot, blev rum lukket med en PDMS-dækket glas dias. Denne fremgangsmåde har den fordel, at DNA kan være direkte immobiliseret inde rum uden fare for kontaminerende i nærheden kamre, men det kræver yderligere fabrikation trin og laboratorieudstyr.

Protokollen præsenteres her gør det muligt for forskere, der arbejder i celle-fri syntetisk biologi til at overføre deres systemer af undersøgelse fra løsning-baseret opsætninger til chip-baserede reaktion containere. Udnytte DNA strand forskydning som den centrale skridt i udviklingen af modstå gør det muligt for mærkning af udsatte regioner med unikke DNA-sekvenser, som giver en let tilgang til biokompatible omstændelig litografi. Kombination med mikrofluidik giver observation af gen expression processer over længere perioder. Ud over undersøgelsen af celle-fri gen expression processer under åben strømningsforhold reaktor, kan samme metode bruges til at immobilisere og rumligt organisere andre biomolekyler på en chip overflade. Dette skulle vise sig nyttigt for en bred vifte af funktionelle og Biofysisk undersøgelser, såsom fluorescens-baserede enkelt-molekyle eksperimenter viste her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi parlamentsarbejdet finansiel støtte til dette projekt af Volkswagen Stiftung (grant nr. 89 883) og det Europæiske Forskningsråd (grant aftale nr. 694410 - AEDNA). M.S.-S. anerkender støtte af DFG gennem GRK 2062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Tags

Bioteknologi spørgsmål 140 celle-fri Gen-ekspression syntetisk biologi biochips litografi mikrofluidik DNA streng forskydning
Funktionel overflade-immobilisering af gener ved hjælp af omstændelig Strand forskydning litografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling,… More

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter