Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Функциональные поверхности иммобилизация генов с использованием многоэтапных Strand перемещения литография

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

Мы опишем простой литографических процедуры для иммобилизации молекул ДНК гена длина на поверхности, которая может использоваться для выполнения экспериментов выражение гена свободных клеток на биочипов.

Abstract

Обездвиживание генов на lithographically структурированных поверхностей позволяет исследование разобщенным ген выражение процессов в системе открытого microfluidic биореактора. В отличие от других подходов к искусственным сотовых систем такая установка позволяет для бесперебойного снабжения с ген выражение реагентов и одновременного слива отходов. Это облегчает осуществление процессов выражение гена свободных клеток более продолжительных периодов времени, что имеет важное значение для реализации систем регулирования обратной связи динамического гена. Здесь мы предоставляем подробный протокол для изготовления генетических биочипов, с использованием simple-to-use литографические техники на основе ДНК пряди перемещения реакций, который использует исключительно коммерчески доступных компонентов. Мы также предоставляем протокол по вопросам интеграции разобщенным генов с полиэфиром (PDMS)-на основе microfluidic системы. Кроме того мы показываем, что система совместима с микроскопии флуоресцирования (TIRF) полного внутреннего отражения, который может быть использован для прямого наблюдения молекулярных взаимодействий между ДНК и молекул, содержащихся в наборе выражений.

Introduction

Ячейки свободной экспрессии генов, которые реакции представляют большой интерес для различных применений в синтетической биологии, биохимии и биотехнологии. Ячейки свободный экспрессию белков сыграл для подготовки образцов чистого белка, которые были основой для многочисленных исследований в структурной биологии. Например клетки бесплатные системы успешно использовались для выражения протеина комплексы1 или мембранные белки2, которые трудны для того производить с помощью выражения на основе ячеек. В частности клетки бесплатно экспрессии генов, реакции также использовались для уточнения структуры генетического кода, начиная с новаторским эксперименты Ниренберг и Matthaei в 1961 году3.

Недавно наблюдается возрождение интереса к свободной ячейки методы в области биотехнологии и синтетической биологии4,5,6. Ячейки свободной системы могут быть дополнены-биологических соединений, и компоненты различных биологического происхождения могут быть объединены более легко7. Несмотря на то, что клетки свободной системы имеют явный недостаток, что они не «расти и делиться», это мыслимо подготовить открытых свободных клеток биореакторах с основные метаболические функции и пусть синтезировать метаболитов при наличии простой углерода и энергии 8входов. В рамках новой области синтетической биологии клетки-систем обещают быть более предсказуемым» шасси» для осуществления синтетических биологических функций.

В настоящее время свободных клеток ген выражение реакции осуществляется либо с помощью клеток экстрактов (из различных источников, таких как бактерии, дрожжи, насекомых), или транскрипция/перевод систем, которые были оптимизированы для различных приложений (например, прокариот против эукариотической экспрессии генов, производство мембранных белков и т.д.). Популярный протокол для подготовки бактериальной клетке экстракт (обычно называют TXTL) был недавно представленной V. Noireaux и coworkers9. Биофизические свойства были тщательно характеризуется10, и TXTL система уже успешно используется для выполнения ряда сложных биохимических задач: например, Ассамблея функциональных бактериофагов через клетки бесплатно выражение генома Фаговые11, синтеза бактериального белка нитей12или осуществление свободных клеток гена цепей13,14.

Другой системы популярны в свободной ячейке синтетической биологии является чистая система, которая воссоздается из очищенных компонентов,1516. По сравнению с TXTL системы, он не содержит nucleases или механизм деградации белков. При деградации линейной ДНК молекулы РНК и белки меньше вопроса в чистой системе, распад пути действительно важны для реализации динамических функций. Для того, чтобы уменьшить влияние деградации при exonuclease линейной гена шаблонов в системе TXTL (через RecBCD), белок GamS конце защита должна быть добавлена. TXTL и чистая система коммерчески доступны.

Тема тесно связана с проблем биологии клетки Бесплатные Изучение эффекта дробления на биохимических реакций и далее создание искусственных клеток подобных структур или protocells17,18,19 ,20. Исследования на искусственные клетки обычно включает инкапсуляцию биохимические реакции системы внутри везикулярного отсеков, сделанные из фосфолипидов или других amphiphiles. Хотя такие системы помогают исследовать фундаментальные аспекты дробления, или возникновение клеточности и самовоспроизводящаяся структур, они сталкиваются типичные проблемы замкнутых систем: в отсутствие функционирующего метаболизма и соответствующие мембранных транспортных механизмов, трудно держать разобщенным реакции для длительных периодов времени - молекулы топлива используются и накопления отходов.

Интересной альтернативой раздробленности внутри таких отделений, подражая клеток является пространственной организации генетического материала, офсетным способами. Иммобилизация «генов на чипе» был впервые предложен бар-Зив группы в институте Вейцмана более десяти лет назад21. Среди основных вопросов, которые должны быть решены были неспецифической адсорбционной ДНК и потенциальных денатурация белков на поверхности чипа. Бар-Зив et al. разработали выделенный фотолитографии сопротивляться, называют «Маргаритка», который состоит из реактивной терминала силана для иммобилизации противостоять молекул на поверхности кремния диоксид, длинные полиэтиленгликоля (PEG) разделителя, который заверил биосовместимость и photocleavable headgroup, который был преобразован в реактивной Амин после облучения с ультрафиолетового (УФ) света. Было показано, что Дейзи может использоваться для иммобилизации молекул ДНК гена Длина (с длиной несколько Кило-пар оснований (kbp)) на поверхности чипа. С точки зрения физики полимеров полимерные щетки, привитые на твердом субстрате представлены системы. Из-за характера полиэлектролит ДНК конформация этих кистей сильно зависит от осмотического и другие Ион специфические эффекты22,23.

Самое главное было показано, что субстрат прикол генов по-прежнему функционирует и могут быть расшифрованы и переведен на РНК и белка. Джин кисти доступны для РНК полимеразы решение24, и комплекс макромолекулярных смесь транскрипция/перевод не денатурировано на поверхности. Одним из преимуществ иммобилизации генетических компонентов на подложке является, что они могут эксплуатироваться в открытой microfluidic реакторная система, которая постоянно поставляется с небольшой прекурсоров молекулы и от которых отходы могут быть удалены25 , 26.

Мы недавно разработали вариант этот метод называется Bephore (для биосовместимых электронно лучевые и фоторезиста)27, которое было основано исключительно на коммерчески доступных компонентов и использовать специфичные для последовательности ДНК пряди вторжения реакции для Реализация простой в реализации многоступенчатое литографии процедуры для создания на основе чипа искусственные клетки. Схематический обзор процедуры показан на рисунке 1. Он основан на молекулы ДНК шпильки, содержащие photocleavable группу, которые иммобилизованных на слое биосовместимых КОЛЫШЕК. Photocleavage шпилька предоставляет последовательность одноцепочечной зацепки, через который ДНК молекул интерес (содержащие последовательности «вытеснения» DIS) может быть прилагаемый через зацепки опосредованной стренги вторжения.

В то время как Bephore является потенциально проще реализовать, Дейзи позволяет реализации очень густой и чистой «ген кисти», которые имеет преимущества в некоторых приложениях. В принципе однако, Дейзи и Bephore литография может легко сочетаться. Связанной с литографией метод использования которых перемещение нити ДНК для структурирования ДНК щетки на золото был ранее разработан Хуан et al., но не был использован в контексте свободных клеток ген выражение28,29.

В следующий протокол мы предоставляем подробное описание производства ДНК щетки для экспрессии генов клеток бесплатно, с помощью метода Bephore. Мы описываем, как ген фишки изготовлены и демонстрируют использование многоступенчатой фото литография пространственно структурированных иммобилизации генов на чипе. Мы также обсуждаем изготовление реакции камер и применение микрофлюидика для проведения реакций выражение гена на чипе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Время расписание для действия в разных разделах приведен в дополнительной информации (раздел 1).

1. чип изготовление

Примечание: в качестве подложек, использования кремниевых пластин (диаметром 100 мм, толщина 0,525 мм) 50 Нм толстым слоем диоксида кремния или стеклянных скольжениях (24 x 24 мм, № 1,5; 22 мм x 50 мм, № 4). В зависимости от приложения другие размеры и толщина может быть более подходящим.

  1. Очистка поверхностей через RCA очистки процедуры (вода, раствор аммиака NH-3(aq), 30% и перекиси водорода H2O2 30%, в соотношении 5:1:1)
    1. Смесь воды и аммиака раствор в стеклянный стакан и Нагрейте смесь до 70 ° C на горячей плите помешивая.
    2. Добавьте перекись водорода и субстрата. Для более высокой пропускной способности место нескольких субстратов (особенно мелких стеклянных скольжениях) в держатель, политетрафторэтилен (ПТФЭ).
    3. После 30 мин вывезти субстрат, промойте его водой из бутылки вымыть и высушить его с пистолетом азота. Немедленно с ПЭГилирование субстрата.
      Предупреждение: Носить защита кожи и глаз и работать в зонта. Не закрывайте контейнер для отходов плотно для выпуска газа из смеси.
  2. ПЭГилирование субстрата
    Примечание: Повторного замораживания и оттаивания акций биотин-PEG-силана уменьшает реактивность силана конденсирующей влаги воздуха. Таким образом, подготовить 5 мл трубы с соответствующее количество биотина-PEG-силана (например 10-20 мг) и заполнить их с сухим аргона до замораживания их до использования.
    1. Растворяют биотин-PEG-силана в сухой толуола, vortexing (5 мг/мл).
    2. Место в Зонта субстрата в чашку Петри стеклянная (диаметром 120 см, высота 2 см).
    3. Пипетка решение (мкл ≈200 для одного стекла Крышка выскальзования, несколько мл для большой кремниевой пластины) на подложке, охватывающих всю поверхность, но избежать решения, протекающей через край субстрата.
    4. Закройте чашку Петри. Чтобы уменьшить сушки субстрата, добавьте дополнительные накрыть влажной салфеткой.
    5. После 30 мин, добавить примерно 40 мл изопропиловый спирт, а затем вывезти субстрат, промойте его снова изопропиловый спирт и высушить его с пистолетом азота (для стеклянных скольжениях, помните стороне Пегилированный). Храните субстрата в темноте до использования.
      Предупреждение: Носить защита кожи и глаз и работать в зонта.

2. Подготовка генов для иммобилизации

Примечание: Грунтовка последовательностей, модификации ДНК и образцовый протокол постановки ПЦР приводятся в дополнительной информации (разделы 2-4).

  1. Используйте измененный Праймеры для того чтобы усилить гена интереса полимеразной цепной реакции (ПЦР). Один грунтовка Флюорофор для визуализации в микроскопии флуоресцирования, и другие грунт отделена от последовательности дис триэтиленгликольдиметакри гликоль заполнитель для того, чтобы сохранить DIS последовательность одноцепочечной во всем ПЦР.
  2. Очистить ДНК с помощью комплекта очистки столбец спин и измерить его концентрации с использованием фотометра поглощения. Концентрация не должна быть намного меньше, чем 100 Нм.
  3. Регулировка концентрации NaCl до 1 М с помощью концентрированный раствор NaCl 5 М. Высокая концентрация соли облегчает ДНК кисти Ассамблеи процесса22.

3. Фотолитография

Примечание: Photocleavable ДНК (PC) следует использовать только в среде желтый свет. Желтая пленка для чистых помещений может использоваться для фильтрации света обычного белого света лампы.

  1. Подготовка субстрата
    1. Подготовить Bephore микс (1 мкм стрептавидина, 1,5 мкм PC ДНК, ДНК рН 7,5 мкм в однократном ПБС (фосфат амортизированное saline)) и пассивации смесь (без маркировки DIS ДНК, BSA (бычий сывороточный альбумин), 1 мг/мл в 1 x PBS 10 мкм). Оба могут храниться в темноте в холодильнике в течение нескольких недель.
    2. Вырежьте субстрата на более мелкие куски (несколько см2), либо с помощью стеклорез или разорвать кремниевой пластины вдоль линии кристалл, нажав на края с помощью скальпеля. Как знак простого выравнивания создайте короткий царапина от центра к краю субстрата, используя стеклорез. Мелкие частицы удар покинуть чип с ружьем азота.
    3. Смешайте две капельки двухкомпонентный силиконовый клей, помешивая, например с кончиком пипетки и применять клей на поверхности чипа, оставляя пустой области вокруг кончика нуля (рисунок 2A). Клей обеспечивает гидрофобный барьер, который облегчает Стиральная шаги и уменьшает количество ДНК, необходимых для использования инкубаторов. В дальнейшем клей может быть легко снимают.
    4. Инкубировать 10 мкл (или столько, сколько необходимо для покрытия чип) Bephore-смеси при комнатной температуре (RT) на чипе. Во время инкубации место чип в коробке, например поле наконечник пипетки частично заполнен водой, чтобы уменьшить испарение.
    5. После того, как 1 h, стирать чип несколько раз (5 x с 50 мкл), дозирование с ПБС удалить несвязанные Bephore микс.
    6. Снять столько буфера как можно без сушки чип и инкубировать 10 мкл пассивации микс на чипе на RT.
    7. После 2 ч стирать чип несколько раз (10 x с 50 мкл), дозирование с ПБС удалить несвязанные пассивации агентов.
  2. Проекция литография
    Примечание: Для литографии, может использоваться вертикально микроскоп с 60 x цель погружения воды. Освещение раз зависит от цели, источника света, маска, плотность поверхности субстрата (кремний чип или стекла слайд) и желаемый ДНК. С целью 60 x, типичный воздействия раз варьировались снизу одной минуты для двухступенчатого литографии с перекрывающимися регионов (15 s для кремниевых чипов, 45 s для стеклянных скольжениях) до 2-3 мин для полного воздействия. Не использовать покрытие скольжения (за исключением плавленого кварца) поверх подложки, так как он блокирует УФ-излучения.
    1. Резать печатного фотошаблонов (см. дополнительный файл с образцовым литографии маски и дополнительного раздела 5) для соответствующего размера установите держатель подходящий маски, которые могут быть вставлены в позиции поля стоп (рис. 2B). Для точного многоступенчатый литографии выровняйте маску с меток выравнивания на держателе.
    2. Место субстрата на слайде микроскопии и переместить его на этап микроскопа. Для патронирования Bephore стекла слайдов, Вставьте черный фольги (например запасные фольги от печатных фотошаблонов) между микроскопии слайд и Bephore слайд предоставлять темный фон для литографии.
    3. Вставьте красный фильтр в освещение пути, фокус на поверхность субстрата и перейдите в регионе субстрата, который будет подвергаться, например региона на кончике нуля.
    4. Вставьте держатель Маска, блокировать освещение и измените на УФ-фильтр (рис. 2 c). В низкой интенсивности света откройте затвор и использовать камеру, чтобы быстро выделить маску на подложке.
    5. Блокировать свет путь к камере и освещать субстрата на высокой интенсивности света для желаемого воздействия времени.
    6. Взять образец из микроскопа и тщательно удалить столько буфера как можно из подложки без сушки.
    7. 10-20 мкл ДНК с дис последовательности. Место субстрата в мокрой поле, чтобы держать его от высыхания. Инкубировать ДНК на подложке для 2 h (олигонуклеотидов на обработку концентрации) или несколько часов/ночь (kbp Лонг ДНК в концентрации около 100 Нм) на RT.
    8. Удаление ДНК из чипа и мыть его несколько раз с ПБС. Для того чтобы уменьшить отходы ДНК (особенно для больше фрагментов), хранить ДНК, взяты из субстрата и повторно использовать его.
  3. Многоступенчатый литография
    Примечание: Для точного выравнивания воздействия двух или более в одной области, держите образец на сцену, чтобы избежать углового смещения. Убедитесь, что чип не пересыхала. Для позиционирования нескольких кистей ДНК в различных регионах на подложке, используйте моторизованного столика на диск в назначенный район или подложки с соответствующим выравниванием знаков.
    1. После первого воздействия (статья 3.2) Инкубируйте ДНК с дис последовательности на подложке. Важно, что все привязки сайтов, вытекающие из первой экспозиции заняты. Таким образом Инкубируйте олигонуклеотиды (10 мкм) для примерно в 3 ч на RT.
    2. Обездвижить дис помечены генов, разместить их на субстрат для нескольких часов или на ночь на RT, затем мыть образца и добавьте пассивации микс еще 2 h на RT. Proceed с Следующая выдержка.
    3. Для дополнительного облучения, повторите предыдущие шаги (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS устройства

Примечание: Желательно, работают в чистой комнате. Изготовление PDMS устройства следует стандартного протокола, такие, как описано в McDonald et al. 30

  1. Изготовление мастер формы через Фотолитография
    1. Очистите пластины кремния (76,2 мм диаметр, толщина 525 мкм), sonication в ацетоне в течение 5 мин при высокой мощности и ополосните деионизированной водой и изопропиловый спирт. После этого место пластины на горячей плите при 150 ° C 15 мин.
    2. При необходимости для улучшения адгезии противостоять вафля, добавить 2-3 мл промоутер адгезии и спина на 3000 об/мин за 30 с. тепло пластин до 120 ° C на 2 мин.
    3. Добавить около 2-3 мл фоторезиста (см. Таблицу материалы). Вращение пластин для 15 s на 500 об/мин, а затем на 3000 об/мин за 30 s. Это должно привести к 20 мкм толстом слое фоторезиста. Пусть в слое фоторезиста расслабиться при комнатной температуре в течение 10 мин.
    4. Для выпекать до воздействия место пластины на горячей плите при 50 ° C за 2 мин, затем на 85 ° C за 5 мин.
    5. Поместите пластины под photomask с планом отсеков. Предпочтительно Используйте маски выравниватель. Photomask должны иметь разрешение 64,000 dpi (см. дополнительный файл с литографией маски и дополнительный раздел 5).
    6. Разоблачить вафельные для 1 мин через photomask с УФ света (-линия 5-10 МВт/см2).
    7. Постконтактная пекут Поместите пластины при 50 ° C за 2 мин, а затем на 85 ° C за 5 мин. Пусть вафельные успокоиться и расслабиться в течение 1 ч при комнатной температуре.
    8. Место вафельные в блюдо с разработчиком на 3 мин во время нежно агитацию стакан. Промойте пластины с изопропиловым спиртом и высушить его с пистолетом азота. Поместите пластины на горячей плите при 130 ° C на 45 мин.
  2. Подготовка устройства PDMS
    1. Mix PDMS базы и PDMS Вулканизирующий агент в соотношении 10:1 и залить его на вафельные в закрытом контейнере до слоя около 5 мм сформировала выше пластин. Чтобы получить устройство PDMS только толщиной 1 мм, вместо спина пальто вафельные с PDMS при 100 об/мин на 2 мин.
    2. Поместите контейнер в эксикаторе и применить вакуум (около 85 кПа) около 30 мин. Затем тепло PDMS до 70° C для 1-2 ч в духовке.
    3. Отдельные устройства PDMS от пластины. Разрежьте PDMS на плиты, так что каждая часть содержит один набор отсеков. В случае, если PDMS будет подключен к microfluidic установки, Пробейте отверстия (диаметром 1 мм) как вход и выход на концах канала поставок.
    4. Очистить PDMS изопропиловый спирт и деионизированной водой и высушить его с пистолетом азота. Храните PDMS пыли.

5. разобщенным ген выражение

Примечание: В следующей процедуре описывается Ассамблея держатель образца (рис. 3) для наблюдения за выражение разобщенным гена на инвертированным микроскопом с Кейдж инкубатор для контроля температуры. Владелец был построен с помощью легко доступных материалов и инструментов (3,5-5 мм толщиной поливинилхлорид (ПВХ) пластмасс, винты и гайки, дрель) и могут быть настроены с учетом различных видов микроскопов. Таким образом, чтобы обе части держателя готовы в то же время необходимо выполнить действия, описанные в 5.1 и 5.2.

  1. Внизу держателя Ассамблея
    1. Подготовка Bephore чип с выравнивание Марк (например нуля) и приклейте его на чип держатель с помощью двухсторонний скотч (рис. 3B). Чип должен быть больше, чем PDMS устройство, которое будет охватывать его.
    2. Иммобилизации одного или нескольких генов на чипе (см. разделы 2 и 3).
    3. Добавить некоторые вакуумные жир вокруг центрального отверстия внизу держателя, затем подключите в держателе чип.
      Примечание: Держатель чип сейчас придерживается внизу держателя путем смазки, сохраняя при этом возможность для повторного позиционирования чипа в плоскости x-y.
  2. Верхний патрон
    1. Подготовьте тонкий чип PDMS с отсеками с помощью процедуры покрытия спина на шаге 4.2.1. Вырежьте PDMS как можно меньше, оставляя открытым каналом в одну сторону позволяет для обмена отходами и прекурсоров молекулы путем диффузии.
    2. Экологически чистые стекла Крышка выскальзования (24 x 24 мм, № 1,5) и задней PDMS чип (сторона без отсеков) с кислородной плазмы для 42 s (работает на 200 Вт и 0.8 мбар с образцом в клетку Фарадея).
    3. Место PDMS чип в центре слайда, стекло с перегородками, указывая вверх. Печь стекла с PDMS за 1 час при температуре 70 ° C.
    4. Добавьте некоторые вакуумные жир вокруг большое отверстие держателя верхней.
    5. Перед началом эксперимента, чистой стеклянное скольжение и PDMS чип с кислородной плазмы для 42 s для отображения PDMS гидрофильные.
    6. Место стекла слайд с PDMS на верхний держатель ( рис. 3 c) и аккуратно нажмите стекла на смазка (рис. 3 c).
  3. Держатель Ассамблеи
    1. Подготовка 100 мкл ячейки свободного выражения системы и держать его на льду.
    2. Тщательно удалить буфер из чипа и промойте его один раз 10 мкл свободных клеток выражение системы. Далее 60 мкл ячейки свободного выражения системы на чипе и удалить клей двухкомпонентный силиконовый от краев чипа (уже удалены в рисунке 3B).
    3. 20 мкл выражение системы на PDMS. После размещения капелька на PDMS, быстро проверьте в стереоскопические отсеках хорошо мокрой и без пузырьков воздуха. Если есть пузырьки воздуха, попробуйте мыть их с остальной частью системы свободных клеток выражение.
    4. Собрать две части держателя и для выравнивания камеры и ДНК щетки, работать под стереоскопическим микроскопом и иммобилизации внизу держателя с захвата рукой, поэтому два винта и wingnuts легко доступны с обеими руками (рис. 3D-F ).
    5. Вставьте верхний держатель в нижней держатель и опустите его до капельки системы свободных клеток выражение предохранитель (Рисунок 3D). Проверьте через стереоскопические отсеков и выравнивание Марк в аналогичных региона в плоскости x-y, иначе подтянуть верхнего держателя и повторно позиции, стекло слайд на держателе топ.
    6. От дна до тех пор, пока они соприкасаются с нижней стороны держателя прикрутите вверх wingnuts. Тщательно затяните wingnuts, одновременно выравнивая отсеков и чип в плоскости x-y через рукоятку в нижней части держателя чип (Рисунок 3E). Однажды в контакте, затяните wingnuts только очень осторожно (Рисунок 3F).
      Примечание: Этот шаг требует некоторого опыта и зависит от экспериментальной установки. Под микроскопом вмешательство узоры, вытекающих из жидкости между PDMS и стекло может указывать, что усилие слишком мал, то время как снижение интенсивности флуоресценции (от ДНК кистью или выраженной белков) в центре отсека намеки на слишком высокий давление (см. также дополнительная информация, раздел 6).
    7. Спрей губки в корпусе анти испарения с водой и вставьте держатель в поле. Заполните шприц 5 мл с двухкомпонентный силиконовый клей и использовать его для запечатывания коробки (рис. 3 g).
    8. Передать поле температуры микроскоп и изображения ДНК кисти и реакция в микроскопии флуоресцирования. Даже без подсветки флуоресценции ДНК кисти исчезает в системе ячейки свободного выражения. Тем не менее кисть сохраняет свою деятельность, как может быть отображено неоднократные ген выражение из той же кисти.
      Примечание: При использовании стекла слайд Bephore вместо кремниевый чип, позиция (сверху/снизу) PDMS и Bephore чип могут быть обменены, позволяя для использования целей с меньше рабочего расстояния.

6. устойчивое выражение в Microfluidic приборы

Примечание: Экспериментальной установки собран из частей, показано на рисунке 4A. Подробная информация о Ассамблеи стадии контролируемой температуры приводятся в дополнительной информации (раздел 7).

  1. Бесплатно мобильный выражение системы и труб
    1. Подготовка системы свободных клеток выражение в образец трубки (около 200 мкл). Шарики полистироля с флуоресцентными красителями могут добавляться позднее монитор скорости потока через канал поставок.
    2. Подсоедините трубку к контроллер давления. Поместите трубку в большой лед водохранилище, которое держит холодной около 12 часов. При необходимости пополните льда.
      Примечание: Как альтернатива контроллер давления, шприцевый насос обеспечивает постоянной скорости потока системы свободных клеток выражение даже если изменения сопротивления потока, например из-за воздушные пузыри, которые могли бы помочь в долгосрочной перспективе экспериментов.
    3. Подключить трубку, содержащий ячейки свободного выражения системы для PTFE Шланги (внутренний диаметр 0,8 мм), которая достигает до стадии с подогревом. Перерыв на 1-2 см кусочки с тупыми концами иглой шприца (диаметр 0,9 мм) и вставьте одну часть в трубопровод PTFE. Позднее он будет служить соединитель для PDMS. Постарайтесь свести к минимуму длина трубопровода между сценой и трубки (рис. 4 c).
    4. Для охлаждения PTFE Шланги, оберните его вокруг больших резиновой трубки, который подключен к льду водохранилища и Перистальтический насос. Лента их вместе с скотч (рис. 4 c).
  2. Верхний патрон
    1. Очистите плоской стороне PDMS чип с кислородной плазмы (42 s) и поместите его на слайде микроскопии с отверстиями для установки входе и выходе PDMS (рис. 4B). Отверстия в стекле может быть пробурена заранее с бокалом сверлильной головкой. Убедитесь, что микро камеры не обращены стеклянное скольжение.
    2. Применять двухсторонний скотч на плоской стороне держателя PDMS. Палка кусок черного фольги (например от литографии маски) в регионе между два отверстия держателя избежать флуоресценции фон из клейкой ленты.
    3. Придерживаться стекла слайд с чипом PDMS держателю.
    4. Лечить PDMS и держателя PDMS прилагаемой стеклом слайдов с кислородной плазмы в плазме чистого (42 s).
    5. Применение вакуумного жир вокруг большое отверстие в держателе Топ и вставьте держатель PDMS (рис. 4В). Держатель PDMS сейчас придерживается верхнего держателя, сохраняя при этом возможность для повторного позиционирования в направлениях x-y.
    6. Подключите трубопровод PTFE с разъемом иглой шприца на входе PDMS чипа. Для облегчения доступа к PDMS через верхний держатель, верхняя пластиковые пластины могут быть кратко удалены для этот и следующий шаг.
    7. Вставьте вторую часть PTFE Шланги (около 5 см) с разъемом иглой шприца на выходе (рис. 4 d).
    8. Расположите держатель PDMS в держателе Топ это свободно двигаться во всех направлениях. Место держателя верхней слабо на подогревом сцену как в рисунке 4E не затягивая любой wingnuts.
    9. С микроскопом перейдите к позиции PDMS отсеков и центр их в поле зрения камеры. Не перемещайте сцену с этой точки зрения.
    10. Снимите верхний держатель с PDMS со сцены.
  3. Подогреваемый столик и Bephore стекло слайд
    1. Установите температуру Подогреваемый столик до 37 ° C
    2. Клей Bephore стекла слайд (№ 4) с кистями гена к стадии контролируемой температурой Перевернутый флуоресцентным микроскопом с помощью двухсторонней клейкой лентой, с выравнивание Марк примерно в центре поля зрения микроскопа. Этот позиционирования марки выравнивание гарантирует, что отделения будут снижены примерно в том же регионе.
    3. Возьмите изображение в соответствующем канале флуоресценции гена кисти и Марк свои позиции в изображение с камеры.
    4. Удалить буфер из гена кисти, но не отпустил сухой. 20 мкл системы клеток - свободное выражение гена кисти и использовать пинцет, чтобы удалить кадр силиконовый клей.
  4. Ассамблея microfluidic установки
    1. Добавьте давления образец трубки до тех пор, пока система свободных клеток выражение заполнила PTFE Шланги и появляется в нижней части устройства PDMS. Кроме того Пипетка 10 мкл ячейки свободного выражения системы на микро камеры на PDMS. Убедитесь, что отсеках свободны от пузырьков воздуха.
    2. Осторожно опустите верхний держатель на стекло слайд и выровняйте микро камеры с помощью кисти ген. Прежде чем PDMS и выравнивание Марк достичь той же плоскости фокуса, используйте небольшие винты на задней части держателя PDMS точно выровнять x-y позиции и ориентации PDMS устройства с Джин кисти (рис. 4E).
    3. Удерживайте позицию и нажмите PDMS слайд стекла, затянув wingnuts вдоль винты, которые соединяют верхний держатель для микроскопа (Рисунок 4E).
    4. Увеличение давления в пробирку, содержащую ячейки свободного выражения системы и монитор потока флуоресцентные бусины через канал поставки (поток порекомендованное ставки от 0,5 до 5 мкл в час) (Рисунок 4F). При необходимости увеличивают давление PDMS на стекле, затянув wingnuts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Двухступенчатый литография: Рисунок 5 показывает результат двухэтапный литографический процесс на слайде стекла с перекрывающимися моделей дневно обозначенные DIS пряди.

Выражение флуоресцентный белок от гена кисти: на рисунке 6 показано выражение флуоресцентный белок YPet от подвижности ДНК. В нескольких точках в времени что мы оценили уровень выражения гена, частично отбеливания флуоресцентный белок и наблюдая за восстановление сигнала флуоресценции игнорируя немедленного восстановления, который не является результатом выражения протеина. После первого отбеливания на два часа выражения, интенсивности флуоресценции быстро оправился и закрывается выше его значение до отбеливания. После четырех и шести часов флюоресценция не взял его предыдущих интенсивности, указав, что без поставок свежих выражение микс, реакция прекращается после приблизительно 3-4 ч.

Сцепка микрофлюидика: экспрессия генов может продолжаться в течение длительных периодов времени, указав выражение отсеков с дополнительной прекурсоров молекулы через микрофлюидика. Рисунок 7 показывает такой системы, позволяя выражение YPet свыше 10 h.

TIRF наблюдения: Bephore может также применяться для изучения взаимодействия дневно обозначенные протеины с кистью на уровне одной молекулы ДНК. Особенно в шумной обстановке литография помогает различать между конкретными и неспецифическим взаимодействие с кисти или поверхности, соответственно. Рисунок 8 дает такой пример, с дневно обозначенные T7 РНК-полимеразы, привязки или преференциально придерживаясь кисти ДНК, по сравнению с окружающей поверхностью.

Figure 1
Рисунок 1 : Bephore фотолитографии. А. субстрат с поверхностью двуокиси кремния (SiO2) покрыта слоем биотинилированным полиэтиленгликоля (PEG-bt), который биосовместимых и позволяет для крепления photocleavable ДНК шпильки через биотин стрептавидина взаимодействий. Здесь, PC содержит последовательность доменов abcb * и модификация photocleavable (purple звезда) и гибридизированных к стренги PH с доменом *. B. освещение ультрафиолетовой (УФ) расщепляет PC, выпустив фрагмент ДНК (cb *) в раствор. C-D. Результате одноцепочечной региона на PC (b) СПИДа зацепки для перемещения PH дневно обозначенные (Зеленая звезда) дис стренги. E. также дольше, двуцепочечной ДНК («шаблон») может крепиться к образцу поверхности. Такие ДНК готовится методом ПЦР с грунтом, перевозящих DIS последовательность на 5' конца, где грунт и DIS разделены триэтиленгликольдиметакри гликоль spacer сохранить DIS одноцепочечной во время ПЦР (см. также дополнительная информация, разделы 2-4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Figure 2
Рисунок 2 : Пробоподготовка для фотолитографии. A. место Bephore чип с Марк выравнивания на слайде микроскопии или другой чип держатель (например держателя в рисунок 3B). Двухкомпонентный силиконовый клей наносится как гидрофобный барьер по краям чип (шаги 3.1.2-3). B. поместите маску на держатель Маска. Здесь, мы удалили Ирис остановки поля и изменение ее держателю так маски могут проводиться маленькие магниты. Для точного выравнивания (угловой) в многоэтапный литографии убедитесь, что выравнивание метки на держатель и матч маски (шаг 3.2.1). C. для перехода на чипе и выровняйте маску с меток выравнивания на чипе, слайд в красный фильтр. Для УФ-облучения вставьте УФ-фильтр (шаги 3.2.2-5). Рисунок воспроизводится от поддержки информацию о предыдущей работе27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Ассамблея держателя для наблюдения за экспрессии генов разобщенным. A. части держателя (правитель единица: cm). B-C. Верхней и нижней части держателя собираются отдельно, с нижней держателя, перевозящих узорной чип Bephore (раздел 5.1) и верхний держатель, перевозящих PDMS чип с отсеками (раздел 5.2). D-F. Чип и PDMS тщательно принесли в плотный контакт, при одновременном соблюдении и выравнивание отсеков и ДНК щетки в стереоскопические (шаги 5.3.1-6). G. перед передачей держатель перевернутый, температуры Микроскоп, вся система инкапсулируется в коробке анти испарения (шаги 5.3.7-8). Рисунок воспроизводится от поддержки информацию о предыдущей работе27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Microfluidic установки и образец держатель для экспрессии генов разобщенным. A. части держателя образца, PDMS устройства, микроскопа с контролируемой температурой и Bephore стекла слайд (правитель единица: cm). Б. микроскопия слайд, перевозящих PDMS с отсеками приклеены к держателю PDMS и воздействию кислорода плазмы вместе с PDMS в плазме чище. PDMS затем вставляется в верхний держатель (шаги 6.2.2-5). C. трубки системы свободных клеток выражение подключены к контроллеру давления и помещены на льду. Трубки (красная пунктирная линия в вставкой) для системы свободных клеток выражение охлаждается резиновой трубки (синяя пунктирная линия), через который ледяная вода перекачивается перистальтического насоса (раздел 6.1). D. Трубы подключен к позиции входе на устройстве PDMS. Еще один кусок трубы подключен к розетке (шаги 6.2.6-7). E. держателя верхней уделено микроскопа и аккуратно опустил к Bephore слайд. Держатель PDMS все еще могут быть перемещены в плоскости x-y для выравнивания отсеков в PDMS щеткой гена на чипе Bephore. Wingnuts используются нажать PDMS микросхему Bephore и исправить верхний держатель для микроскопа (шаги 6.4.1-3). F. свободных клеток выражение системы перекачивается через микро каналы в PDMS и экспрессии генов от ДНК кисти могут контролироваться в эпифлуоресцентного (шаг 6.4.4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : Двухступенчатого фотолитографии. А-б. Дневно помечены олигонуклеотиды (зеленый: 532 Атто; красный: Alexa Fluor 647) были последовательно иммобилизованных на Bephore стекла слайд через маски проекции литографии с временем экспозиции 45 s. C. Наложение subfigures A и B, демонстрируя точное выравнивание одной экспозиции. Масштаб бары: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Разобщенным экспрессии генов. A. ДНК кисти на слайде стекло Bephore (время экспозиции УФ: 2 мин), кодирования для флуоресцентных белков, YPet был согласован с отсека на чипе PDMS (см. раздел 5 и рис. 3). B. экспрессии генов в камере с ДНК принесли сильная флуоресценция сигнал с градиента концентрации белка, формируя вдоль канала, который соединен выражение смесь вне PDMS устройство камеры. Контрольная палата без иммобилизованных гены оставались относительно тёмная. C. профиль интенсивности флуоресценции со временем для обеих палат. Каждые два часа флуоресцентный белок был частично отбеленный (черные стрелки) для проверки, является ли выражение по-прежнему активно. После 4 ч флюоресценция не взял его предыдущих интенсивности, указывающее, что выражение прекращено. Масштаб бары: 300 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Выражение устойчивый разобщенным гена. A. ДНК кисти на слайде стекло Bephore (время экспозиции УФ: 2 мин), кодирование для YPet был согласован с отсека на чипе PDMS. Отсеков подключены к каналу поставок (белая стрелка), через который перекачивается ячейки свободного выражения системы (см. раздел 6 и рис. 4). B. отсек, содержащие ген кисти показывает флуоресценции сигнала от YPet выражения (в зеленом) по системе выражение гена свободных клеток. Соседних отсек без кисти гена остается относительно темным. Свежие компоненты системы свободных клеток выражение через канал поставки и диффундируют в отсеках, в то время как отходы перевозятся прочь. C. профиль интенсивности флуоресценции со временем для обеих палат. Флуоресцентные белки были частично отбеленная в различных точках во времени (черные стрелки), чтобы проверить, является ли выражение по-прежнему активно. Из-за потока в канале поставок экспрессии генов была сохранена для по крайней мере 10 h. (пик в красный след, отмеченные красной стрелкой было вызвано воздушный пузырь, который временно слить раствор из отсеков). Масштаб бары: 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Молекулы одного исследования по Bephore стекла слайды в микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM). A. цель типа TIRFM позволяет одной молекулы изображений рядом стекла вода интерфейс. Мы иммобилизованных дневно обозначенные генов (зеленый, 532 Атто, время воздействия УФ: 2 мин) с Т7 промоутер вдоль lithographically определенные полосы и наблюдается поведение T7 РНК-полимеразы (оранжевый, обозначенные с Alexa Fluor 647) взаимодействовать с поверхностью. B. флуоресценции изображения показаны две полосы иммобилизованных генов. C. полимеразы T7 RNA прикрепить непосредственно и конкретно на поверхности (одного изображения, время воздействия 50 мс). D. Среднее изображение, полученное из всех фреймов флуоресценции видео (5000 кадры, такие как в subfigure C) предоставляет конкретные взаимодействия РНК-полимеразы с ДНК кисти. Масштаб бары: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Литография Bephore — это надёжный и универсальный метод для узорной иммобилизации ДНК или РНК. Тем не менее процедура включает несколько этапов, которые - если изменено - может быть источником для отказа или снижению производительности системы.

Решающим шагом в изготовление Bephore чипов является ПЭГилирование субстрата, который обеспечивает биосовместимость поверхности. Здесь очистки шаг с RCA процедуры важно, так как он также активирует поверхности для последующего silanization. Во время фактической ПЭГилирование субстрат не должна высыхать. Кроме того силан-PEG-биотин должны храниться правильно сохранить его реактивности (раздел 1.2) и избежать сшивки. Для оценки результатов ПЭГилирование, субстраты можно инкубировали с дневно обозначенные стрептавидина и по сравнению с не Пегилированный элементов управления. Успешно Пегилированный подложки следует привязать стрептавидина значительно больше, чем элементы управления.

Кроме того в более поздних стадиях процесса литографии, сушка чип имеет отрицательные последствия, например удаления уже привязанного ДНК или в более высокой адсорбции ДНК неэкспонированные регионы на подложке.

Как указывалось выше (раздел 3.2), резолюции литографический процесс и время необходимые воздействия зависят от экспериментальной установки (цель, источник света и т.д.). Таким образом в качестве первого шага, широкий спектр воздействия раз должны быть протестированы.

Для экспериментов выражение гена экспериментальной установки должны быть настроены с учетом доступных аппаратных (микроскоп, контроль температуры и т.д.). Мы показали два таких реализаций, один для коротких экспериментов (4 h, раздел 5), где системы был воплощен в поле, чтобы уменьшить испарение выражение смеси и один для длительного наблюдения (раздел 6), где microfluidic устройство с поддержкой непрерывного поставки прекурсоров молекулы. В обоих случаях выравнивание ДНК щетки на подложке и отсеков в PDMS представляет собой сложный шаг. Поэтому мы рекомендуем попробовать этот шаг несколько раз с Макетные подложки перед использованием одним рисунком (см. также дополнительная информация, раздел 6). В Ассамблее больших систем различных гена щетки, длительный инкубационный раз, точное выравнивание угловых камер и щетки на большие расстояния и загрязнения путем адсорбции ДНК-узорные регионы в зависимости от качества пассивирование, Май создают ограничения на размер практически осуществимым систем.

Альтернативой этой техники была продемонстрирована Karzbrun и др. 25, который создал отделения в чип, индуктивно сочетании плазмы реактивного ионного травления (Bosch процесс), следуют плазмы расширение парофазное осаждение (PECVD) слоя диоксида кремния. После поверхности функционализации, кучность и размещение nanoliter ДНК капельки дозирования робот отсеках были закрыты с покрытой PDMS стеклянное скольжение. Эта процедура имеет то преимущество, что ДНК может быть непосредственно иммобилизованным внутри отсеков без опасности заражения поблизости камеры, но она требует дополнительных изготовление шаги и лабораторного оборудования.

Здесь представлены протокол позволяет исследователей, работающих в свободной ячейке синтетической биологии, передать их систем обучения от установок на основе решения на основе чипа реакция контейнеров. Использование ДНК пряди перемещения центральной шага во время разработки противостоять позволяет маркировки воздействию регионов с уникальных последовательностей ДНК, которая обеспечивает снисходительный подход к биосовместимых многоступенчатое литографии. Комбинации с микрофлюидика позволяет наблюдать ген выражение процессы более продолжительных периодов времени. Помимо расследования свободных клеток ген выражение процессов в условиях открытого потока реактора та же методология может использоваться для иммобилизации и пространственно организовать другие биомолекулы на поверхности чипа. Это должно оказаться полезным для широкого ряда функциональных и биофизических исследований, такие, как на основе флуоресценции сингл молекула эксперименты показали здесь.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они имеют не конкурирующие интересы.

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем финансовую поддержку для этого проекта Volkswagen Stiftung (Грант № 89 883) и Советом европейских исследований (Грант соглашение № 694410 - AEDNA). М.С. S. признает поддержки DFG через ГРК 2062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Tags

Биоинженерия выпуск 140 свободных клеток экспрессии генов синтетической биологии биочипы литографии микрофлюидика перемещение нити ДНК
Функциональные поверхности иммобилизация генов с использованием многоэтапных Strand перемещения литография
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling,… More

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter