Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Funksjonell overflaten-immobilisering av gener bruker må Strand forskyvning Litografi

Published: October 25, 2018 doi: 10.3791/58634
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Physics Department, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en enkel litografisk prosedyre for immobilisering av genet lengde DNA molekyler på en overflate, som kan brukes til å utføre celle-fri gene expression eksperimenter på biochips.

Abstract

Immobilisering av gener på lithographically strukturerte overflater kan studere compartmentalized genet uttrykk prosesser i en åpen microfluidic bioreactor system. I motsetning til andre tilnærminger til kunstig cellulær systemer tillater slikt oppsett en kontinuerlig tilførsel med gene expression reagenser og samtidige drenering av avfallsstoffer. Dette forenkler implementering av celle-fri gene expression prosesser over lengre perioder, som er viktig for realisering av dynamisk genet regulatoriske tilbakemeldingssystemer. Her gir vi en detaljert protokoll for fabrikasjon av genetiske biochips med en enkel-å-bruk litografisk teknikk basert på DNA strand forskyvning reaksjoner, som utelukkende bruker kommersielt tilgjengelige komponenter. Vi tilbyr også en protokoll på integrering av compartmentalized gener med en polydimethylsiloxane (PDMS)-basert microfluidic system. Videre vise vi at systemet er kompatibel med total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi, som kan brukes til direkte observasjon av molekylære interaksjoner mellom DNA og molekyler i uttrykk blanding.

Introduction

Cellen gratis genuttrykk reaksjoner er av stor interesse for ulike applikasjoner i biokjemi, bioteknologi og syntetisk biologi. Celle-frie uttrykk for proteiner var for utarbeidelse av ren protein prøver, som var grunnlaget for flere studier i strukturell biologi. For eksempel ble celle-frie systemer brukt for uttrykket av protein komplekser1 eller membran proteiner2, som er vanskelige å produsere bruker cellebasert uttrykk. Spesielt, celle-gratis genuttrykk reaksjoner ble også brukt til å belyse strukturen i den genetiske koden, starter med den banebrytende eksperimentet ved Nirenberg og Matthaei i 19613.

Nylig har det vært en fornyet interesse i celle-fri metoder i bioteknologi og syntetisk biologi4,5,6. Celle-frie systemer kan utvides med ikke-biologisk forbindelser, og komponentene i ulike biologiske opphavet kombineres lettere7. Selv om celle-frie systemer har den åpenbare ulempen at de ikke "vokse og dele", er det tenkelig å forberede åpen celle-fri bioreaktorer med grunnleggende metabolske funksjoner og la dem syntetisere metabolitter når enkle karbon og energi innganger8. I det nye feltet på syntetisk biologi lover celle-frie systemer å være en mer forutsigbar "chassis" for implementering av syntetiske biologiske funksjoner.

Foreløpig celle-fri gene expression reaksjoner utføres enten ved hjelp av cellen ekstrakter (fra ulike kilder som bakterier, gjær, insekter), eller transkripsjon/oversettelse systemer som var optimalisert for ulike programmer (f.eks Prokaryotic og eukaryotic genuttrykk, produksjon av membran proteiner, etc.). En populær protokoll for utarbeidelse av bakteriell celle ekstrakt (ofte kalt TXTL) ble levert nylig av V. Noireaux og kolleger9. Egenskapene Biofysiske har vært grundig preget10, og TXTL systemet har allerede brukt klarer å utføre en rekke komplekse biokjemiske oppgaver: f.eks montering av funksjonelle bacteriophages via celle-frie uttrykk phage genomet11, syntese av bakteriell protein filamenter12eller gjennomføringen av celle-fri genet kretser13,14.

Et annet system populært i celle-fri syntetisk biologi er ren systemet, som er rekonstruert fra renset komponenter15,16. Sammenlignet med TXTL systemet, inneholder den ikke nucleases eller protein fornedrelse maskiner. Mens nedbrytning av lineær DNA, RNA molekyler eller proteiner er mindre av et problem i ren systemet, forfall veier er faktisk viktige for gjennomføring av dynamiske funksjoner. For å redusere effekten av exonuclease nedbrytning av lineær genet maler i systemet TXTL (gjennom RecBCD), har end-beskytte GamS protein å bli addert. Både i TXTL og ren systemet er kommersielt tilgjengelig.

Et tema knyttet nært til celle-fri biologi bekymringer studier av effekten av compartmentalization på biokjemiske reaksjoner og ytterligere etableringen av kunstige celle-lignende strukturer eller protocells17,18,19 ,20. Forskning på kunstig celler innebærer vanligvis innkapsling av en biokjemiske reaksjonssystemet i vesicula rom laget av fosfolipider eller andre amphiphiles. Mens slike systemer hjelpe for å utforske grunnleggende aspekter av compartmentalization eller fremveksten av cellularity og selvreproduserende strukturer, de står overfor de typiske problemene på lukkede systemer: i fravær av en fungerende metabolisme og riktig membran transportmekanismer, er det vanskelig å holde compartmentalized reaksjoner kjører for lengre perioder - drivstoff molekyler er oppbrukt og avfallsprodukter akkumulere.

Et interessant alternativ til compartmentalization i slike celle-mimicking rom er romlig organisering av genetisk materiale ved hjelp photolithographic metoder. Immobilisering av "gener på en chip" ble utviklet av Bar-Ziv group ved Weizmann Institute mer enn ti år siden21. Blant de store problemene som måtte løses var uspesifisert opptak av DNA og den potensielle denaturering av proteiner på chip overflaten. Bar-Ziv et al. utviklet en dedikert klima og jordsmonn motstå kalt "Daisy", som besto av en reaktiv terminal silane for immobilisering av motstå molekyler på silisium dioksid overflater, en lang polyetylenglykol (PEG) spacer som sikret biocompatibility, og en photocleavable headgroup, som ble omgjort til en reaktiv Amin ved bestråling med ultrafiolett (UV) lys. Det har vist at Daisy kan brukes til nakkens genet lengde DNA molekyler (med lengder av flere kilo base-parene (kbp)) på chip underlag. Fra en polymer fysikk synspunkt representerte systemene polymer børster podet på et solid substrat. På grunn av polyelectrolyte natur DNA, er konformasjon av disse børster sterkt påvirket av osmotisk og andre ion-spesifikke effekter22,23.

Viktigst, har det vært vist at substrat-immobilisert gener funksjonelle og kan være transkribert og oversatt til RNA og protein. Gene børster er tilgjengelig for RNA polymerases fra løsning24komplekse macromolecular blanding av transkripsjon/oversettelsen er ikke denaturert på overflaten. En av fordelene ved immobilisering av genetisk komponentene på et substrat er at de kan brukes i et åpent microfluidic reaktoren system som kontinuerlig leveres med små forløper molekyler og fra hvilke avfallsprodukter kan fjernet25 , 26.

Vi har nylig utviklet en variant av denne metoden kalles Bephore (for biokompatible elektronstråle og photoresist)27, som var basert på kommersielt tilgjengelige komponentene og utnyttet sekvens-spesifikke DNA strand invasjonen reaksjoner for realisering av en enkel å implementere må litografi prosedyre for etableringen av chip-baserte kunstig celler. En skjematisk oversikt over prosedyren er vist i figur 1. Den er basert på DNA hårnål molekyler som inneholder en photocleavable-gruppen som er blokkert på et biokompatible PEG-lag. Photocleavage av hårnål viser en enkelt-strandet toehold sekvens, gjennom hvilke DNA molekyler av interesse (inneholder "fortrenger" DIS sekvensen) kan være tilkoblet via toehold-mediert strand invasjon.

Mens Bephore er potensielt enklere å implementere, Daisy gjør at realisering av svært tett og rent "gene børster", som har fordeler i enkelte programmer. I prinsippet, men kan Daisy og Bephore litografi lett kombineres. En relaterte litografi metoden bruker DNA strand forskyvning for strukturering DNA børster på gull ble utviklet av Huang et al., men ble ikke benyttet i sammenheng med celle-fri gene expression28,29.

I følgende protokollen gir vi en detaljert beskrivelse av produksjonen av DNA børster for celle-fri genuttrykk med metoden Bephore. Beskriver vi hvordan genet chips fremstille og demonstrere bruk av flere trinn Foto-litografi for romlig strukturert immobilisering av gener på en brikke. Vi diskuterer også fabrikasjon av reaksjon kamre og anvendelse av microfluidics for ytelsen på prosessoren gene expression reaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: En timeplan for trinnene i de ulike delene er gitt i den utfyllende informasjonen (del 1).

1. chip fabrikasjon

Merk: som underlag, bruk silisiumskiver (100 mm diameter, 0.525 mm tykkelse) med en 50 nm tykt lag av silisium dioksid eller glass lysbilder (24 mm x 24 mm, nr 1.5, 22 mm x 50 mm, nummer 4). Avhengig av applikasjonen, kan andre størrelser og tykkelser være bedre egnet.

  1. Rengjøring av underlag via en RCA ren prosedyre (vann, ammoniakk løsning NH3(aq) 30% og hydrogenperoksid H2O2 30%, i forholdet 5:1:1)
    1. Bland vann og ammoniakk løsning i et beaker glass og varm blandingen til 70 ° C på en varm plate under omrøring.
    2. Legge til hydrogen peroxide og underlaget. For høyere gjennomstrømming, plassere flere underlag (spesielt lite glass lysbildene) i en polytetrafluoroethylene (PTFE) holder.
    3. Etter 30 min, ta ut underlaget, skyll den grundig med vann fra en og tørke den med en nitrogen pistol. Gå rett med PEGylation av underlaget.
      FORSIKTIG: Bruk hud og øyne beskyttelse og innarbeide avtrekksvifte. Ikke Lukk avfallsbeholderen tett for å tillate gass utgivelse fra blandingen.
  2. PEGylation av underlaget
    Merk: Gjentatt frysing og tining av Biotin-PEG-Silane aksjer reduserer reaktivitet av silane på grunn av fukt fuktig luft. Derfor forberede 5 mL-rør med passende mengder Biotin-PEG-Silane (f.eks 10-20 mg) og fylle dem med tørr argon før frysing dem før bruk.
    1. Løses Biotin-PEG-Silane i tørr toluen av vortexing (5 mg/mL).
    2. Plass underlaget i et glass Petriskål (120 cm diameter, 2 cm høyde) i avtrekksvifte.
    3. Pipetter løsningen (≈200 µL for en enkelt glass cover slip, noen mL for en stor silisium wafer) på underlaget, som dekker hele overflaten, men unngå løsningen flyter over kanten av underlaget.
    4. Lukk Petriskål. For å redusere tørking av underlaget, legger du til en ekstra dekk med våtserviett.
    5. Etter 30 min, legger du til ca 40 ml av isopropyl alkohol, så ta ut underlaget, skyll det igjen grundig med isopropyl alkohol og tørke den med en nitrogen pistol (glass lysbilder, husk pegylert siden). Lagre underlaget i mørket før bruk.
      FORSIKTIG: Bruk hud og øyne beskyttelse og innarbeide avtrekksvifte.

2. utarbeidelse av gener for immobilisering

Merk: Primer sekvenser, DNA modifikasjoner og en eksemplarisk PCR-protokoll er gitt i den utfyllende informasjonen (seksjoner 2-4).

  1. Bruk endrede primere for å forsterke genet av interesse ved polymerasekjedereaksjons (PCR). En primer bærer en fluorophore for visualisering i fluorescens mikroskopi, og andre primer er atskilt fra DIS sekvensen med en triethylene glycol avstand for å holde DIS sekvensen single-strandet i hele PCR.
  2. Rense bruker en spinn kolonnen rensing kit og måle sin konsentrasjon bruke en absorpsjon fotometer. Konsentrasjonen bør ikke være mye lavere enn 100 nM.
  3. Justere konsentrasjonen av NaCl til 1 M bruker en konsentrert 5 M NaCl løsning. Den høye salt konsentrasjonen forenkler DNA penselen forsamlingen prosessen22.

3. klima og jordsmonn

Merk: Photocleavable DNA (PC) skal håndteres i et gult lys miljø. Gul folie for renrom kan brukes til å filtrere lys av konvensjonelle hvitt lys lamper.

  1. Utarbeidelse av underlaget
    1. Klargjør Bephore-blandingen (1 µM streptavidin, 1,5 µM PC DNA, 7,5 µM PH DNA i 1 x PBS (fosfat-bufret saltvann)) og passivation blande (10 µM umerkede DIS DNA, 1 mg/mL BSA (bovine serum albumin), i 1 x PBS). Begge kan lagres i mørket i kjøleskapet i flere uker.
    2. Skjær underlaget i mindre biter (noen cm2) ved å bruke en glass kutter eller ved å bryte en silicon wafer langs en krystall linje ved å trykke på en kant med skalpell. Som en enkel justering merke, opprette en kort ripe fra center mot en kant av underlaget med glass kutteren. Blåse små partikler av chip med en nitrogen pistol.
    3. Bland to dråper av to-komponent silikon lim, rører f.eks med Pipetter tips, og bruke limet på overflaten av chip, forlater området rundt spissen av scratch tom (figur 2A). Limet gir en hydrofobe barriere som forenkler vask trinnene og reduserer DNA kreves for incubations. I senere kan limet lett bli skrellet av.
    4. Inkuber 10 µL (eller så mye som nødvendig for å dekke chip) av Bephore-miksen ved romtemperatur (RT) på chip. Under incubation, stedet chip i en boks, f.eks en pipette tips for delvis fylt med vann å redusere fordampning.
    5. Etter 1 h, vaske chip ubundet flere ganger (5 x med 50 µL) av pipettering med 1 x PBS fjerne Bephore-mix.
    6. Ta av buffer så mye som mulig uten å tørke chip og Inkuber 10 µL av passivation-miksen på chip på RT.
    7. 2 h, vaskes chip flere ganger (10 x med 50 µL) av pipettering med 1 x PBS fjerne ubundet passivation agenter.
  2. Projeksjon Litografi
    Merk: For litografi, en oppreist mikroskop med en 60 x vann nedsenking målet kan brukes. Belysning ganger er avhengig av målet, lyskilden, maske, underlaget (silicon chip eller glass lysbilde) og ønsket DNA overflaten tetthet. Med en 60 x mål, typisk eksponeringstider varierte fra under ett minutt for en to-trinns Litografi med overlappende områder (15 s silisium brikker, 45 s glass lysbilder) til 2-3 minutter for en full eksponering. Ikke bruk en cover slip (unntatt smeltet kvarts) på underlaget, siden den blokkerer UV-lys.
    1. Kutte en trykt photomask (se utfyllende fil med eksemplarisk litografi masker og supplerende seksjon 5) til en passende størrelse til å passe en egnet maske holder, som kan settes på plasseringen av feltet Stopp (figur 2B). For nøyaktig flertrinns litografi, justere masken med justering merker på holderen.
    2. Plasser underlaget på et mikroskopi lysbilde og flytte den til mikroskopet scenen. Sette inn svart folie (f.eks ekstra rundt den utskrevne photomasks) mellom mikroskopi lysbildet og Bephore lysbilde for å gi en mørk bakgrunn for litografi mønstre av Bephore glass lysbilder.
    3. Sette inn et rødt filter i belysning banen, fokus på underlaget overflaten og naviger til regionen underlaget, som vises, f.eks regionen på spissen av scratch.
    4. Sette inn maske innehaveren, blokkere belysning og endre til UV-filter (figur 2C). Med lav lav intensitet, åpne skodde og bruke kameraet raskt fokusere masken på underlaget.
    5. Blokkerer lyset banen til kameraet og lyser underlaget med høy lav intensitet for ønsket eksponeringstid.
    6. Ta prøven fra mikroskopet og fjern forsiktig så mye buffer som mulig fra underlaget uten å tørke den.
    7. Legge 10-20 µL av DNA dis sekvens. Plass underlaget i en våt boksen å holde det tørker. Inkuber DNA på underlaget for 2t (oligonucleotides i en micromolar konsentrasjon) eller flere timer/overnatting (kbp lange DNA på ca 100 nM konsentrasjon) på RT.
    8. Fjerne DNA fra brikken og vask det flere ganger med 1 x PBS. For å redusere avfall av DNA (spesielt for lengre fragmenter), lagre DNA tatt fra underlaget og gjenbruke.
  3. Flere trinn Litografi
    Merk: For nøyaktig justering av to eller flere eksponeringer i ett område, holde prøven på scenen for å unngå kantete vinkelavvik. Kontroller at brikken ikke tørke. For plassering av flere DNA pensler i forskjellige regioner på et substrat, bruk en motorisert scene å kjøre til det angitte området eller et med riktig justering merker.
    1. Etter første eksponering (kapittel 3.2), ruge DNA dis sekvens på underlaget. Det er viktig at alle bindende områder fra første eksponering er opptatt. Derfor ruge oligonucleotides (10 µM) for ca 3 timer på RT.
    2. For å nakkens dis merket gener, plasseres på underlaget i flere timer eller over natten på RT, så vask prøven og legge passivation blandingen for en annen 2 timer på RT. Fortsett med neste eksponering.
    3. For flere eksponeringer, gjentar du trinnene (3.2.3 - 3.3.2).

4. PDMS-enheter

Merk: Helst fungere i en ren-rom. Fabrikasjon av en PDMS enhet følger en standardprotokoll som beskrevet av McDonald et al. 30

  1. Fabrikasjon av muggsopp via klima og jordsmonn
    1. Rengjør en silicon wafer (76.2 mm diameter, 525 µm tykkelse) ved sonication i aceton i 5 min på høy effekt, og skyll med isopropyl alkohol og de-ionisert vann. Etterpå stedet kjeks på en varm plate på 150 ° C i 15 min.
    2. Eventuelt for å forbedre vedheft av motstå til wafer, legge til 2-3 mL vedheft arrangøren og spinne på 3000 rpm for 30 s. varme wafer til 120 ° C i 2 minutter.
    3. Legge til ca 2-3 mL photoresist (se Tabell for materiale). Spin kjeks 15 s på 500 rpm, så på 3000 rpm for 30 s. Dette burde medføre et 20 µm tykt lag av photoresist. La photoresist laget slappe av ved romtemperatur for 10 min.
    4. For pre-eksponering bake, plassere kjeks på en varm plate på 50 ° C i 2 minutter, deretter på 85 ° C i 5 minutter.
    5. Plass kjeks under photomask med blåkopi av seksjonene. Bruk gjerne maske aligner. Photomask bør ha en oppløsning på 64 000 dpi (se utfyllende fil med litografi masker og supplerende seksjon 5).
    6. Utsett kjeks for 1 min med UV-lys (-line 5-10 mW/cm2) gjennom photomask.
    7. For post-eksponering bake, plassere kjeks på 50 ° C i 2 minutter og deretter på 85 ° C i 5 minutter. La kjeks kjøle ned og slappe av i 1 time ved romtemperatur.
    8. Plass kjeks i en tallerken med utvikleren for 3 min mens forsiktig agitating begeret. Skyll kjeks med isopropyl alkohol og tørke den med en nitrogen pistol. Plass kjeks på en varm plate på 130 ° C i 45 min.
  2. Utarbeidelse av PDMS enheten
    1. Blanding PDMS base og PDMS herding agent i en 10:1-forhold og hell den bort på kjeks i en lukket beholder til et lag på cirka 5 mm har dannet over kjeks. For å få en PDMS enhet for bare 1 mm tykkelse, i stedet spinne pels kjeks med PDMS på 100 rpm i 2 minutter.
    2. Plasser beholderen i en desiccator og bruke et vakuum (om lag 85 kPa) i ca 30 min. Deretter varme PDMS til ca 70° C for 1-2 h i en ovn.
    3. Skille PDMS enheten fra kjeks. Kutt i PDMS i plater slik at hver brikke inneholder en rekke avdelinger. I tilfelle av PDMS skal kobles til en microfluidic oppsett, hull (1 mm diameter) som en innløp og utløp i endene av forsyning kanalen.
    4. Rengjør PDMS med isopropyl alkohol og de-ionisert vann og tørk den med en nitrogen pistol. Lagre PDMS støv-fritt.

5. compartmentalized genuttrykk

Merk: Følgende fremgangsmåte beskriver montering av en prøve holder (Figur 3) for observasjon av compartmentalized genuttrykk på en invertert mikroskop med en bur inkubator for temperaturkontroll. Abonnenten ble bygget med tilgjengelige materialer og verktøy (3,5-5 mm tykk polyvinylklorid (PVC) plast, skruer og muttere, drill) og kan tilpasses for å passe ulike typer mikroskop. Fremgangsmåten beskrevet i 5.1 og 5.2 skal utføres slik at begge deler av holderen er klare samtidig.

  1. Bunnen holderen montering
    1. Forberede en Bephore chip med justering merke (f.eks en ripe) og lim den på chip abonnenten bruke dobbeltsidig teip (figur 3B). Chip bør være større enn PDMS enheten som vil dekke det.
    2. Nakkens ett eller flere gener på chip (se pkt. 2 og 3).
    3. Legg noen vakuum fett rundt den sentrale hullet av bunnen holderen, så kobler chip abonnenten.
      Merk: Innehaveren av chip nå overholder innehaveren av bunnen med fett, samtidig som muligheten for å plassering av chip i x-y-flyet.
  2. Topp holder montering
    1. Forberede en tynn PDMS chip med avdelinger å spinne belegg fremgangsmåten i trinn 4.2.1. Skjær PDMS så liten som mulig, forlater en kanal åpen til side å tillate utveksling av avfall og forløper molekyler av spredningen.
    2. En glass cover slip (24 mm x 24 mm, nr 1,5) og baksiden av PDMS chip (side uten rom) med oksygen plasma til 42 s (drives på 200 W og 0,8 mbar med prøven i Faraday bur).
    3. Plass PDMS der i midten av av objektglass med seksjonene pekende oppover. Bake glasset med PDMS 1t på 70 ° C.
    4. Legg noen vakuum fett rundt det store hullet av topp holderen.
    5. Før du starter eksperimentet, ren av objektglass og PDMS chip med oksygen plasma til 42 s å gjengi PDMS hydrofile.
    6. Plasser av objektglass med PDMS på topp holderen ( Figur 3 c) og trykk forsiktig glasset på fett (Figur 3 c).
  3. Holderen montering
    1. Forberede 100 µL av en celle-frie uttrykk og holde det på is.
    2. Nøye fjerne bufferen fra chip og vaske det en gang med 10 µL av celle-frie uttrykk. Deretter legge til 60 µL av celle-frie uttrykk på brikken og fjerne to-komponent silikon limet fra kantene av chip (allerede fjernet i figuren 3B).
    3. Legge til 20 µL av uttrykk på PDMS. Etter å ha slippverktøyet til PDMS, raskt sjekke i stereoskopisk mikroskopet at seksjonene er godt våte og uten luftbobler. Hvis det er luftbobler, prøve å vask dem med resten av celle-frie uttrykk.
    4. Å montere to stykker av holderen og å justere kamre og DNA børster, arbeide under stereoskopisk mikroskop og nakkens bunnen holderen med en gripper arm, så de to skruene og wingnuts er lett tilgjengelig med begge hender (figur 3D-F ).
    5. Sett topp holderen inn i holderen nederst, og senk det til celle-frie uttrykk systemet dråpene sikring (figur 3D). Se gjennom stereoskopisk mikroskopet om seksjonene og justering merket er i en lignende region i x-y-flyet, ellers trekke opp topp holderen og re posisjon glass skyve topp abonnenten.
    6. Fra bunnen, skruen opp wingnuts til de berører undersiden av holderen. Nøye stram wingnuts, mens justere seksjonene og chip i den x-y-plane via håndtaket nederst på chip holderen (figur 3E). En gang i kontakt stram wingnuts bare svært forsiktig (figur 3F).
      Merk: Dette trinnet krever litt erfaring og avhenger eksperimentelle. Under mikroskopet, kan forstyrrelser mønstre som oppstår fra væske mellom PDMS og glass indikere at anvendt er for liten, mens en lavere fluorescens intensitet (fra DNA pensel eller uttrykte proteiner) i midten av en kupé hint på et for høyt Trykk (se også tilleggsinformasjon, del 6).
    7. Spray svamp i anti-fordampning kabinettet med vann og holderen inn i boksen. Fyll en 5 mL sprøyte med to-komponent silikon lim og bruke den til å forsegle esken (Figur 3 g).
    8. Overføre boksen til et temperaturkontrollert mikroskop og DNA penselen og reaksjonen i fluorescens mikroskopi. Selv uten lys tones fluorescens av DNA penselen en celle-frie uttrykk system. Likevel beholder penselen sin aktivitet, som kan vises ved gjentatte genuttrykk fra samme pensel.
      Merk: Når du bruker et Bephore glass lysbilde i stedet for en silicon chip, PDMS og Bephore chip posisjon (topp/bunn) kan byttes, tillater bruk av mål med mindre arbeide avstander.

6. vedvarende uttrykk i Microfluidic enheter

Merk: Eksperimentell oppsettet er satt sammen av delene som vises i figur 4A. Detaljer om montering av temperaturkontrollert scenen er gitt i den utfyllende informasjonen (del 7).

  1. Celle-frie uttrykk system og rør
    1. Forberede celle-frie uttrykk systemet i et eksempel rør (ca 200 µL). Polystyren perler merket med fluorescerende fargestoffer kan legges til senere skjerm infusjonshastigheten gjennom en forsyning kanal.
    2. Koble røret til en trykk-kontroller. Sett røret i et stort is reservoar som holder kulden i ca 12 timer. Fylle is om nødvendig.
      Merk: Som et alternativ til en trykk-kontroller, en sprøytepumpe gir en konstant flow rate av celle-frie uttrykk systemet selv om flyt motstand endringene, f.eks på grunn av luftbobler, som kan hjelpe med langsiktige eksperimenter.
    3. Koble røret som inneholder cellen-frie uttrykk systemet PTFE rør (indre diameter på 0,8 mm), som når til oppvarmet scenen. Bryte en sprøyte nål (diameter 0,9 mm) i 1-2 cm biter med Butte endene og ett stykke inn PTFE slangen. Det vil senere tjene som koblingen til PDMS. Prøv å redusere lengden på slangen mellom scenen og røret (figur 4C).
    4. For å kjøle PTFE slangen, vikle den rundt større gummi rør som er koblet til en isen vann reservoaret og en peristaltiske pumpe. Tape dem sammen med teip (figur 4C).
  2. Topp holder montering
    1. Rengjør den flate siden av PDMS chip med oksygen plasma (42 s) og plasser den på et mikroskopi lysbilde med hull passende innløp og utløp av PDMS (figur 4B). Hull i glasset kan bores på forhånd med et glass boring hodet. Kontroller at mikro-kamrene ikke står overfor av objektglass.
    2. Bruke dobbeltsidig teip på den flate siden av PDMS holderen. Stick med svart aluminiumsfolie (f.eks fra en litografi maske) i området mellom de to hullene av innehaveren å unngå bakgrunn fluorescens fra teip.
    3. Stikke av objektglass med PDMS chip til abonnenten.
    4. Behandle PDMS og PDMS holder med vedlagte glass lysbilde med oksygen plasma i en plasma renere (42 s).
    5. Bruke vakuum fett rundt det store hullet i toppen holderen og sett PDMS abonnenten (figur 4B). PDMS innehaver nå overholder topp innehaveren, samtidig som muligheten for nytt plassering i xy retninger.
    6. Koble PTFE slangen med sprøyte nål koblingen i innløpet til PDMS chip. For å lette tilgangen til PDMS igjennom topp holder, kan øvre plast plate kort fjernes for denne og følgende trinn.
    7. Sette inn et andre PTFE rør (ca 5 cm) med en sprøyte nål kontakt på utsalgsstedet (Figur 4 d).
    8. Plasser PDMS abonnenten i topp holderen slik det er gratis å bevege seg i alle retninger. Sted topp abonnenten løst på oppvarmet scenen som i figur 4E uten å stramme noen wingnuts.
    9. Med mikroskopet, Naviger til plasseringen av PDMS rom og Midtstiller dem i kameraets synsfelt. Ikke Flytt scenen fra dette punktet.
    10. Fjerne topp holderen med PDMS fra scenen.
  3. Oppvarmet scenen og Bephore glass lysbilde
    1. Still inn temperaturen av oppvarmet scenen 37 ° c
    2. Fest en Bephore glass lysbilde (nr. 4) med gene børster på temperaturkontrollert scenen av invertert fluorescens mikroskopet dobbeltsidig selvklebende tape, med justering merket omtrent på midten av visningskroppen synsfelt. Plasseringen av merket justering sikrer at seksjonene bli senket omtrent til samme område.
    3. Ta et bilde i tilsvarende fluorescens kanalen av genet penselen og merke sin posisjon i kamerabildet.
    4. Fjerne bufferen fra gene pensel, men ikke la det gå tørr. Legge til 20 µL av celle - ytringsfrihet systemet genet penselen og bruke pinsett for å fjerne silikon lim rammen.
  4. Montering av microfluidic
    1. Legge til press utvalg røret til celle-frie uttrykk systemet har fylt PTFE slangen og vises nederst på PDMS enheten. I tillegg Pipetter 10 µL av celle-frie uttrykk på mikro-chambers på PDMS. Kontroller at seksjonene er fri for luftbobler.
    2. Nøye lavere topp holderen på av objektglass og justere mikro-kamrene med gene pensel. Før både PDMS og justering merke når samme fokalplanet, bruke små skruer på baksiden PDMS abonnenten til nøyaktig justering av x-y-posisjonen og orientering av PDMS enheten med gene pensel (figur 4E).
    3. Holde og trykke PDMS inn i glass lysbildet ved stramme wingnuts langs skruene som kobler toppen abonnenten til mikroskopet scenen (figur 4E).
    4. Øke presset i røret som inneholder cellen-frie uttrykk systemet og overvåke flyten av fluorescerende perlene gjennom forsyning kanalen (flyt anbefales hastigheter mellom 0,5 til 5 µl per time) (figur 4F). Om nødvendig øke presset av PDMS på glass ved å stramme wingnuts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Totrinns litografi: figur 5 viser resultatet av en litografisk prosess på et glass lysbilde med overlappende mønstre av fluorescently merket DIS tråder.

Uttrykk for et lysstoffrør protein fra gene pensel: figur 6 viser uttrykk for fluorescerende protein YPet fra immobilisert DNA. På flere punkter i tid vi vurdert gene expression frekvensen av delvis bleking fluorescerende protein og observere utvinning av fluorescens signalet, ser bort fra den umiddelbare utvinningen, som ikke skyldes protein uttrykk. Etter den første bleking på to timer uttrykksformer, fluorescens intensiteten gjenopprettet raskt og steg over sin verdi før bleking. Etter fire og seks timer, fluorescensen ikke komme til sin tidligere intensitet, indikerer at uten tilførsel av friske uttrykk blanding, reaksjonen avsluttet etter ca 3-4 h.

Koble til microfluidics: genuttrykk kan opprettholdes over lengre perioder ved å forsyne uttrykk seksjonene med ekstra forløper molekyler via microfluidics. Figur 7 viser et slikt system, muliggjør uttrykk for YPet over 10 h.

TIRF observasjon: Bephore kan også brukes til å studere samspillet av fluorescently merket proteiner med DNA pensel på ett molekyl nivå. Spesielt i støyende omgivelser bidrar litografi til å skille mellom bestemte og uspesifikke samhandling med pensel eller overflaten, henholdsvis. Figur 8 gir slikt eksempel, med fluorescently merket T7 RNA polymerase bindingen eller følge fortrinnsvis DNA penselen sammenlignet med omkringliggende overflaten.

Figure 1
Figur 1 : Bephore klima og jordsmonn. A. et substrat med en overflate av silisium dioksid (SiO2) er dekket med et lag av biotinylated polyethylene glycol (PEG-bt), som er biokompatible og gir feste en photocleavable DNA hårnål via biotin-streptavidin vekselsvirkningene. Her PC inneholder sekvens domener abcb * og en photocleavable endring (lilla stjerne) og er hybridiserte til stranden PH med domenet en *. B. ultrafiolett (UV) lys kløyver PC, slippe et DNA-fragment (cb *) løsning. C-D. Resulterende single-strandet regionen på PC (b) aids som en toehold for forskyvning av PH av en fluorescently merket (grønn stjerne) DIS strand. E. lengre, double-strandet DNA ("mal") kan også knyttes til mønstrede overflaten. Slike DNA er utarbeidet av PCR med en innføring bærer en DIS sekvens 5' affæren der primer og DIS er atskilt med en triethylene glycol avstand å holde DIS single-strandet under PCR (se også tilleggsinformasjon, seksjoner 2-4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 2
Figur 2 : Prøve forberedelse til klima og jordsmonn. A. Plasser en Bephore der med en justering merke et mikroskopi-lysbilde eller en annen chip holderen (f.eks innehaveren på figur 3B). Bruke to-komponent silikon lim som en hydrofobe barriere langs kantene av chip (trinn 3.1.2-3). B. plasser masken på en maske holder. Her vi fjernet iris av feltet Stopp og endret eieren så masken kan holdes av små magneter. For nøyaktig (kantete) justering i flere trinn litografi, sørge for at justeringen merker på holderen og maske kampen (trinn 3.2.1). C. navigere på chip og justere masken justering merkene på chip, skyve i den røde filteret. Sette inn UV-filter (trinn 3.2.2-5) for UV-stråling. Figur gjengitt fra støtte informasjonen tidligere arbeid27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Montering av en holder for observasjon av compartmentalized genuttrykk. A. deler av holderen (måleenhet på linjal: cm). B-C. Øverste og nederste del av holderen er samlet separat, med bunnen innehaveren bære en mønstret Bephore chip (pkt. 5.1) og topp holder bærer en PDMS chip med avdelinger (inndelingen 5.2). D-F. Chip og PDMS er nøye ført i tett kontakt, mens samtidig observere og justere rom og DNA børster stereoskopisk mikroskop (trinn 5.3.1-6). G. før du overfører abonnenten til en invertert, temperatur-kontrollert mikroskop, hele systemet er innkapslet i en anti-fordampning boks (trinn 5.3.7-8). Figur gjengitt fra støtte informasjonen tidligere arbeid27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Microfluidic oppsett og prøve holderen for den compartmentalized genuttrykk. A. deler av prøven innehaveren, PDMS enheten, temperaturkontrollert mikroskop scenen og Bephore glass lysbilde (måleenhet på linjal: cm). B. et mikroskopi lysbilde bærer PDMS med pakkerom er limt til PDMS abonnenten og utsatt for oksygen plasma sammen med PDMS i en plasma renere. PDMS settes deretter inn i topp holderen (trinn 6.2.2-5). C. de celle-frie uttrykk rør er koblet til en trykk-kontrolleren og plassert på is. Slangen (rød stiplet linje i rammemargen) for celle-frie uttrykk systemet er avkjølt av gummi slangen (blå stiplet linje) gjennom isen vann pumpes av en peristaltiske pumpe (inndelingen 6.1). D. Slangen er koblet til innløp posisjon på PDMS enheten. En annen del av slangen er koblet til uttaket (trinn 6.2.6-7). E. topp holderen er plassert på mikroskopet scenen og nøye senket mot Bephore lysbildet. PDMS innehaver kan fortsatt flyttes i x-y-planet justere seksjonene i PDMS med gene pensel på Bephore chip. Wingnuts brukes trykke PDMS på Bephore chip og fikse topp abonnenten til mikroskopet scenen (trinn 6.4.1-3). F. Cell-free uttrykk systemet blir pumpet gjennom mikro-kanalene i PDMS og genuttrykk fra DNA børster overvåkes i epifluorescence mikroskopi (trinn 6.4.4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Totrinns klima og jordsmonn. AB. Fluorescently merket oligonucleotides (grønn: ATTO 532; red: Alexa Fluor 647) var fortløpende immobilisert på en Bephore glass lysbilde via maske projeksjon Litografi med eksponeringstider 45 s. C. Overlapping av subfigures A og B, demonstrere nøyaktig justering av de enkelt eksponeringene. Skalere barer: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Compartmentalized genuttrykk. A. A DNA pensel på et Bephore glass lysbilde (UV eksponeringstid: 2 min), koding for fluorescerende protein YPet ble stilt et rom på en PDMS chip (se seksjon 5 og Figur 3). B. genuttrykk i kammeret med DNA gitt en sterk fluorescens signal med en protein konsentrasjon gradient danner langs en kanal, som koblet kammeret til uttrykk blanding utenfor PDMS enheten. Kontroll kammeret uten immobilisert gener forble relativt mørke. C. fluorescens intensitet profil over tid for begge kamre. Annenhver time fluorescerende protein ble delvis bleket (svart piler) til å kontrollere om uttrykket var fortsatt aktiv. Etter 4 h, gjorde fluorescensen ikke gjenopprette til sin tidligere intensitet, indikerer at uttrykket hadde avsluttet. Skalere barer: 300 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Vedvarende compartmentalized genuttrykk. A. A DNA pensel på et Bephore glass lysbilde (UV eksponeringstid: 2 min), koding for YPet ble stilt et rom på en PDMS chip. Kupeene er koblet til en strømforsyning kanal (hvit pil) som cellen-frie uttrykk systemet pumpes (se §6 og Figur 4). B. rommet inneholder genet penselen viser et fluorescens signal fra YPet uttrykk (i grønt) av celle-fri gene expression systemet. Nærliggende rommet uten genet pensel fortsatt relativt mørke. Frisk komponenter av celle-frie uttrykk strømme gjennom forsyning kanalen og diffus inn rom, mens avfallsprodukter transporteres bort. C. fluorescens intensitet profil over tid for begge kamre. Fluorescerende proteiner var delvis bleket på ulike tidspunkter i gang (svart piler) for å kontrollere om uttrykk var fortsatt aktiv. På grunn av flyt i supply kanalen, ble genuttrykk opprettholdt for minst 10 h. (toppen i rød spor preget av den røde pilen var forårsaket av en luftboble som midlertidig drenert løsningen fra seksjonene). Skalere barer: 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Single-molekylet studier på Bephore glass lysbilder i total intern refleksjon fluorescens mikroskopi (TIRFM). A. mål-type TIRFM kan enkelt-molekylet imaging nær glass-vann-grensesnittet. Vi immobilisert fluorescently merket gener (grønn, ATTO 532, UV eksponeringstid: 2 min) med en T7 selskapet sammen lithographically definert striper og observert atferden til T7 RNA polymerase (oransje, merket med Alexa Fluor 647) samarbeidsstil overflaten. B. fluorescens bildet viser to striper av immobilisert gener. C. T7 RNA polymerases feste spesielt og nonspecifically til overflaten (enkeltbilde, 50 ms eksponeringstid). D. Et gjennomsnittlig bilde fra alle rammene av en fluorescens video (5000 rammer som i subfigure C) viser bestemte samspillet mellom RNA polymerase med DNA pensel. Skalere barer: 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bephore litografi er en robust og allsidig teknikk for den mønstrede immobilisering av DNA eller RNA. Likevel, prosedyren inneholder flere tiltak, som - hvis endret - kan være en kilde for manglende eller redusert ytelse av systemet.

Et viktig skritt i produksjon av Bephore chips er PEGylation av underlaget, som gir biokompatibilitet av overflaten. Her er rengjøringsprosessen med en RCA-prosedyre viktig, siden den også aktiveres overflaten for den påfølgende silanization. Under den faktiske PEGylation, må underlaget ikke tørke ut. Videre lagres Silane-PEG-Biotin riktig å bevare sin reaktivitet (paragraf 1.2) og unngå crosslinking. For å vurdere utfallet av PEGylation, kan underlag inkubert med fluorescently merket streptavidin og sammenlignet med ikke-pegylert kontroller. Vellykket skal pegylert underlag binde betydelig mer streptavidin enn kontrollene.

Også i senere stadier av litografiske prosessen har tørking av chip bivirkninger, som f.eks i fjerning av allerede bundet DNA eller i en høyere adsorpsjon av DNA på ueksponerte områder på underlaget.

Som nevnt ovenfor (kapittel 3.2), oppløsningen av litografiske prosessen og de nødvendige eksponeringstider avhenger eksperimentelle (mål, lyskilden, osv.). Derfor, i et første skritt, en rekke eksponeringstider bør testes.

For gen uttrykk eksperimenter, skal eksperimentelle oppsettet tilpasses tilpasses den tilgjengelige maskinvaren (mikroskop, temperaturkontroll, osv.). Vi viste to slike implementeringer, én for kort eksperimenter (4 h, seksjon 5) hvor systemet var innkapslet i en boks for å redusere fordampning av uttrykk blanding og en for lang observasjon (inndelingen 6), hvor en microfluidic enhet aktivert en kontinuerlig tilførsel av forløperen molekyler. I begge tilfeller justeringen av DNA børster på underlaget og rom i PDMS representert det kinkigste trinnet. Vi anbefaler derfor å prøve dette trinnet flere ganger med en dummy underlaget før du bruker en mønstret (se også tilleggsinformasjon, del 6). Montering av store systemer av forskjellige genet kan børster, lang incubation ganger, nøyaktig kantete justering av kamre og børster over lange avstander, og forurensning av adsorpsjon av DNA til ikke-mønstret regioner avhengig av passivation, utgjøre begrensninger på størrelsen av praktisk mulig.

Et alternativ til denne teknikken ble demonstrert av Karzbrun et al. 25, som skapte rom i en chip av Induktivt kombinert plasma reaktive-ion etsing (Bosch prosess), etterfulgt av plasma forbedret damp avsetning (PECVD) et silisiumdioksid lag. Etter overflate functionalization, mønstre og plassering av nanoliter DNA dråper av en pipettering robot ble seksjonene stengt med en PDMS-dekket objektglass. Denne prosedyren har fordelen at DNA kan bli direkte immobilisert i seksjonene uten fare for å kontaminere i nærheten kamre, men det krever ytterligere fabrikasjon trinn og laboratorieutstyr.

Protokollen presenteres her gjør at forskerne arbeider i celle-fri syntetisk biologi overføre systemene studie fra solution-baserte oppsett til chip-baserte reaksjon beholdere. Utnytte DNA strand forskyvning som sentrale trinn under utviklingen av resist muliggjør merking av utsatte områder med unike DNA-sekvenser, som gir en lettvinte tilnærming til biokompatible må litografi. Sammen med microfluidics kan observasjon av gene expression prosesser over lengre tid. Bortsett fra etterforskningen av celle-fri genet uttrykk prosesser under åpne strømmen reaktoren forhold, kan av samme metode brukes nakkens og romlig andre biomolecules på en chip overflate. Dette bør være nyttig for en rekke funksjonelle og Biofysiske studier, som fluorescens-baserte single-molekylet eksperimenter demonstrert her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi erkjenner takknemlig støtte for dette prosjektet av Volkswagen Stiftung (grant nr 89 883) og europeiske forskningsråd (grant avtalen nummer 694410 - AEDNA). MASTERGRAD-S. erkjenner støtter DFG gjennom GRK 2062.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer with 50 nm silicon dioxide (Bephore substrate) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 100
Silicon wafer (for PDMS master mold) Siegert Wafer Thickness (µm): 525 ±25, Diameter (mm): 76.2 (3”)
Glass slides no. 4 Menzel 22 mm x 50 mm
Glass slides no. 1.5 Assistent 24 mm x 24 mm
Biotin-PEG-Silane Laysan Bio MW 5,000
Anhydrous toluene Sigma Aldrich (Merck) 244511
Streptavidin Thermo-Fisher Scientific S888
DNA Integrated DNA Technologies (IDT)
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531S PCR kit
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281 Spin-column PCR clean-up kit
PURExpress New England Biolabs E6800S Cell-free expression system
PDMS  Dow Corning Slygard 184
FluoSpheres Thermo-Fisher Scientific F8771
PTFE tubing (ID: 0.8mm, OD: 1.6 mm) Bola S 1810-10
EpoCore 20 micro resist technology GmbH Photoresist
mr-Dev 600 micro resist technology GmbH Photoresist developer
Ti-Prime MicroChemicals Adhesion promoter
Two-component silicon glue Picodent Twinsil 
UV-protection yellow foil Lithoprotect (via MicroChemicals) Y520E212
Equipment
Masks for photolithography Zitzmann GmbH 64.000 dpi, 180x240 mm
Upright microscope Olympus BX51 Photolithography and fluorescence imaging
60x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.9
20x water immersion objective Olympus LumPlanFl Used with Olympus BX51, NA 0.5
Camera Photometrics Coolsnap HQ Used with Olympus BX51
Ligtht source EXFO X-Cite 120Q Used with Olympus BX51
Inverted microscope Nikon Ti2-E Fluorescence imaging of gene expression
4x objective Nikon CFI P-Apo 4x Lambda Used with Nikon Ti2-E
Camera Andor Neo5.5 Used with Nikon Ti2-E
Light source Lumencor SOLA SM II Used with Nikon Ti2-E
Cage incubator Okolab bold line Used with Nikon Ti2-E
Pressure Controller Elveflow OB1 MK3
NanoPhotometer Implen DNA concentration measurement
Plasma cleaner Diener Femto 200 W, operated at 0.8 mbar with the sample in a Faraday cage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heyman, Y., Buxboim, A., Wolf, S. G., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Cell-free protein synthesis and assembly on a biochip. Nature Nanotechnology. 7 (6), 374-378 (2012).
  2. Jaehme, M., Michel, H. Evaluation of cell-free protein synthesis for the crystallization of membrane proteins - a case study on a member of the glutamate transporter family from Staphylothermus marinus. The FEBS Journal. 280 (4), 1112-1125 (2013).
  3. Nirenberg, M. W., Matthaei, J. H. The dependence of cell-free protein synthesis in E. coli upon naturally occurring or synthetic polyribonucleotides. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 47, 1588-1602 (1961).
  4. Harris, D. C., Jewett, M. C. Cell-free biology: exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry. Current Opinion in Biotechnology. 23 (5), 672-678 (2012).
  5. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14 (3), 261-269 (2012).
  6. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  7. Estévez-Torres, A., et al. Sequence-independent and reversible photocontrol of transcription/expression systems using a photosensitive nucleic acid binder. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (30), 12219-12223 (2009).
  8. Opgenorth, P. H., Korman, T. P., Bowie, J. U. A synthetic biochemistry molecular purge valve module that maintains redox balance. Nature Communications. 5 (1), 4113 (2014).
  9. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  10. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-Grained Dynamics of Protein Synthesis in a Cell-Free System. Physical Review Letters. 106 (4), 048104 (2011).
  11. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome replication, synthesis, and assembly of the bacteriophage T7 in a single cell-free reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
  12. Maeda, Y. T., et al. Assembly of MreB filaments on liposome membranes: a synthetic biology approach. ACS Synthetic Biology. 1 (2), 53-59 (2012).
  13. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synthetic Biology. 1 (1), 29-41 (2012).
  14. Niederholtmeyer, H., et al. Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife. 4, e09771 (2015).
  15. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
  16. Shimizu, Y., Kanamori, T., Ueda, T. Protein synthesis by pure translation systems. Methods. 36 (3), 299-304 (2005).
  17. Pohorille, A., Deamer, D. Artificial cells: prospects for biotechnology. Trends In Biotechnology. 20 (3), 123-128 (2002).
  18. Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A., Guthrie-Honea, K. R., Boyden, E. S. Engineering genetic circuit interactions within and between synthetic minimal cells. Nature Chemistry. 9 (5), 431-439 (2017).
  19. Tan, C., Saurabh, S., Bruchez, M. P., Schwartz, R., Leduc, P. Molecular crowding shapes gene expression in synthetic cellular nanosystems. Nature Nanotechnology. 8 (8), 602-608 (2013).
  20. van Nies, P., et al. Self-replication of DNA by its encoded proteins in liposome-based synthetic cells. Nature Communications. 9 (1), 1583 (2018).
  21. Buxboim, A., et al. A single-step photolithographic interface for cell-free gene expression and active biochips. Small. 3 (3), 500-510 (2007).
  22. Bracha, D., Karzbrun, E., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H. Emergent properties of dense DNA phases toward artificial biosystems on a surface. Accounts Of Chemical Research. 47 (6), 1912-1921 (2014).
  23. Bracha, D., Bar-Ziv, R. H. Dendritic and nanowire assemblies of condensed DNA polymer brushes. Journal of the American Chemical Society. 136 (13), 4945-4953 (2014).
  24. Daube, S. S., Bracha, D., Buxboim, A., Bar-Ziv, R. H. Compartmentalization by directional gene expression. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America. 107 (7), 2836-2841 (2010).
  25. Karzbrun, E., Tayar, A. M., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science. 345 (6198), 829-832 (2014).
  26. Tayar, A. M., Karzbrun, E., Noireaux, V., Bar-Ziv, R. H. Propagating gene expression fronts in a one-dimensional coupled system of artificial cells. Nature Physics. 11 (12), 1037-1041 (2015).
  27. Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Daube, S. S., Bar-Ziv, R. H., Simmel, F. C. Gene Expression on DNA Biochips Patterned with Strand-Displacement Lithography. Angewandte Chemie-International Edition In English. 57 (17), 4783-4786 (2018).
  28. Huang, F., Xu, H., Tan, W., Liang, H. Multicolor and Erasable DNA Photolithography. ACS Nano. 8 (7), 6849-6855 (2014).
  29. Huang, F., Zhou, X., Yao, D., Xiao, S., Liang, H. DNA Polymer Brush Patterning through Photocontrollable Surface-Initiated DNA Hybridization Chain Reaction. Small. 11 (43), 5800-5806 (2015).
  30. McDonald, J. C., et al. Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Electrophoresis. 21 (1), 27-40 (2000).

Tags

Bioteknologi problemet 140 Cell-free genekspresjon syntetisk biologi biochips litografi microfluidics DNA strand forskyvning
Funksjonell overflaten-immobilisering av gener bruker må Strand forskyvning Litografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling,… More

Pardatscher, G., Schwarz-Schilling, M., Sagredo, S., Simmel, F. C. Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography. J. Vis. Exp. (140), e58634, doi:10.3791/58634 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter