Summary
تركيز هذه الدراسة لإثبات هذه التقنية إيمونوستينينج والتصور الجامع-جبل كطريقة مثالية لتصوير ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الدهنية البنية والخلوية المكون.
Abstract
الأنسجة الدهنية جهازا هاما ايضية مع اللدونة العالية والاستجابة للمحفزات البيئية والحالة الغذائية. على هذا النحو، تم وضع تقنيات مختلفة لدراسة مورفولوجية وبيولوجيا الأنسجة الدهنية. مع ذلك، تقتصر أساليب التصور التقليدي لدراسة الأنسجة في 2D المقاطع، الفشل في القبض على بنية ثلاثية الأبعاد للجهاز كله. نقدم هنا كل جبل تلطيخ، أسلوب إيمونوهيستوتشيميستري الذي يحافظ على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية سليمة مع خطوات الحد الأدنى من المعالجة. ومن ثم، يتم الاحتفاظ بهياكل adipocytes والمكونات الخلوية الأخرى دون تشويه، تحقيق التصور 3D الأكثر تمثيلاً من الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين الجامع-جبل تلطيخ مع النسب تتبع أساليب لتحديد الخلية مصير القرارات. ومع ذلك، هذه التقنية على بعض القيود لتوفير معلومات دقيقة فيما يتعلق بأجزاء أعمق من الأنسجة الدهنية. للتغلب على هذا التحديد، تلطيخ كل جبل يمكن أن تكون كذلك جنبا إلى جنب مع الأنسجة تبادل تقنيات إزالة التكتم الأنسجة والسماح للتصور الكامل لتشريح الأنسجة الدهنية كاملة باستخدام ورقة الضوء الفلورسنت الفحص المجهري. ولذلك، يمكن التقاط دقة أعلى وتمثيل أكثر دقة لهياكل الأنسجة الدهنية مع المزيج من هذه الأساليب.
Introduction
الأنسجة الدهنية جهازا أساسيا لتخزين الطاقة وتتميز بتجديد حيوية والتوسع غير محدود تقريبا1. بالإضافة إلى التوازن الطاقة، الأنسجة الدهنية أيضا دوراً أساسيا في إفراز هرمون أديبوكينيس ما يزيد على 50 تعدل وظيفة التمثيل الغذائي في الجسم كله2. وقد الأنسجة الدهنية الهندسة المعمارية المتنوعة وتضم مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك adipocytes ناضجة والليفية، وخلايا بطانية، الخلايا المناعية و الخلايا السلف adipocyte3. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن السمنة وغيرها الخلل الأيضي يمكن أن يغير كثيرا من وظيفة الأنسجة الدهنية ولها المكروية، التي تشمل ولكن لا تقتصر على توسيع adipocytes، تسلل الخلايا التحريضية (مثلاً، الضامة)، و3من خلل الأوعية الدموية.
التقنيات المورفولوجية التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيونينج تثبت العديد من القيود في دراسة البيولوجيا الدهنية مثل خطوات المعالجة الكيميائية الطويلة، التي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة انكماش وهيكل التشويه3، 4. وعلاوة على ذلك، هذه التقنيات 2D غير كافية لمراقبة التفاعلات بين الخلايا التي تمارسها أنواع الخلايا المختلفة، حيث أن المقاطع التي تم الحصول عليها محدودة إلى مناطق أصغر من الأنسجة كامل3. أساليب التصوير الفلورسنت مقارنة بالتقليدية، يلطخ كل جبل لا يتطلب خطوات إضافية الغازية، مثل التضمين وتمزيقها والجفاف؛ وهكذا، حتى تتجنب مشكلة تناقص خصوصية جسم. على هذا النحو، وطريقة بسيطة وفعالة لتصوير الأنسجة الدهنية، مع الحفاظ على أفضل مورفولوجيا adipocyte و هيكل الأنسجة الدهنية عموما5. ولذلك، كل جبل تلطيخ كما أنشئت تقنية إيمونولابيلينج سريعة وغير مكلفة للمحافظة على الأنسجة الدهنية البنية ثلاثية الأبعاد1،6،،من78.
ومع ذلك، على الرغم من المحافظة على مورفولوجيا الأنسجة الدهنية مع استخدام تلوين كل جبل، هذا الأسلوب لا يزال غير قادر على تصور الهياكل الداخلية تحت سطح الأنسجة الدهنية. وقد أنشأت مؤخرا عدة دراسات9،10 الأنسجة تبادل التقنيات جنبا إلى جنب مع الجامعة-جبل إيمونولابيلينج1،6 للسماح للتصور 3D شاملة داخل الأنسجة الدهنية. على وجه الخصوص، كانت تصور الشبكات العصبية والمفرج كثيفة في الأخيرة دراسات9،10،،من1112 مع تصوير حجم ثلاثي الأبعاد. في الواقع، دراسة اللدونة العصبية والأوعية الدموية للأنسجة الدهنية تحت ظروف فسيولوجية مختلفة ضروري لدراسة عن علم الأحياء. تمكين إيمونولابيلينج تصوير ثلاثي الأبعاد لإزالة الأنسجة أجهزة مسح مذيب (إيديسكو +) عملية تتألف من الميثانول المعالجة المسبقة، إيمونولابيلينج، وإزالة الأنسجة التكتم مع الكواشف الكيميائية العضوية الميثان (DCM ) وخماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) ديبينزيل13،14. بجعل الأنسجة الدهنية شفافة تماما، تمثيل أكثر دقة للتشريح داخل الأنسجة مثل الأوعية الدموية والألياف العصبية ويمكن الحصول على9،10. إيديسكو + مزايا في هذا ومتوافق مع مختلف الأجسام المضادة والصحفيين الفلورسنت11،14، وقد أثبت نجاحا في العديد من الأجهزة وامبريوس حتى14. غير أن القيد الرئيسي وقت حضانة طويلة، التي تحتاج إلى 18 إلى 20 يوما لإكمال هذه التجربة كاملة.
تطبيق هام آخر لتلطيخ كل جبل هو تصور مصير الخلية في تركيبة مع نظام تتبع نسب. تتبع النسب هو وسم الجينات/علامة معينة في خلية التي يمكن أن تنتقل إلى كافة الخلايا الوليدة، وهو يحافظ على مر الوقت15. على هذا النحو، هو أداة قوية يمكن استخدامها لتحديد مصير أي خلية ذرية15. منذ التسعينات، أصبح النظام المؤتلف Cre-لوكسب نهج قوية لتتبع النسب في معيشة الكائنات الحية15. عندما يتم عبرت خط ماوس تعرب لجنة المساواة العرقية، إنزيم الحمض النووي recombinase، مع آخر سطر الماوس معربا عن مراسل المجاورة لتسلسل لوكسب-توقف-لوكسب، هو بروتين مراسل أعرب15.
لتلوين كل جبل، استخدام الصحفيين متعدد الألوان الفلورية مناسبة للتصوير من الأنسجة الدهنية لأنه يسمح لتدخل الحد الأدنى مع الأنشطة داخل الخلايا من adipocyte16. إلا أن الصحفيين التقليدية عادة وصمة عار السيتوبلازم، مما يجعل من الصعب تتبع نسب adipocytes بيضاء، التي حدت من هيولى المحتوى17. للتغلب على هذه المشكلة، استخدام الغشاء زمنياً الفلورسنت تدتوماتو/غشاء اجفب (mT/mG) مراسل ماركر أداة مثالية. يتم التعبير عن تدتوماتو المستهدفة للغشاء في الخلايا Cre سالب18. عند ختان لجنة المساواة العرقية، ويحدث التحول إلى التعبير عن اجفب المستهدفة للغشاء، مما يجعل هذا المراسل مناسبة لتتبع نسب adipocyte المتكفل17،18 (تكميلية الشكل رقم 1).
والغرض من هذه الورقة هو تقديم بروتوكول مفصل لتلطيخ كل جبل، وإظهار كيف أنه يمكن دمجها مع تقنيات أخرى لدراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء من الأنسجة الدهنية. أمثلة اثنين من الطلبات المبينة في هذا البروتوكول يتم استخدامه مع خطوط الماوس مراسل 1) متعدد الألوان لتحديد أصول مختلفة adipocytes و 2) الأنسجة المقاصة لمزيد تصور أربوريزيشن العصبية في الأنسجة الدهنية البيضاء (وات).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
كافة البروتوكولات الحيوانات التجريبية أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان بمركز" فينوجينوميكس (TCP) تتفق مع معايير "المجلس الكندي للعناية بالحيوان". تم الإبقاء على دورات الضوء/الظلام 12-ح الفئران وتوفير حرية الوصول إلى المياه والغذاء. تجربة شهر 7 الفئران الذكور C57BL/6J قديمة استخدمت في تلطيخ كل جبل.
ملاحظة: الأقسام من 1 إلى 2 بالترتيب الزمني، مع القسم 3 يجري خطوة اختيارية الحق بعد القسم 1. يمكن أن يؤديها القسم 4 لتحليل كثافة adipocyte الحجم والأوعية الدموية بعد انتهاء القسم 2.
1-مواد التحضير وعزل الأنسجة
- إعداد الطازجة 1% بارافورمالدهيد (PFA) المخفف في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتثبيت الأنسجة. تحضير السطح النطاق 0.3% المخفف في برنامج تلفزيوني 1 x (المشار إليها كبرنامج تلفزيوني-0.3T) للأنسجة اللاحقة الغسيل الخطوات.
ملاحظة: لكل الأنسجة، وإعداد ما يقرب من 1.5 مل من 1% منهاج العمل التأكد من الغمر الكامل. قد ازداد حجم التثبيت أو انخفضت تبعاً لحجم الأنسجة.
تنبيه: هذه الخطوة الخطرة، كمنهاج عمل بيجين التآكل والسامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات النتريل، معطف مختبر، الأحذية، ونظارات واقية) والتعامل مع غطاء دخان. - Euthanize الحيوانات وفقا لإجراءات معتمدة (مثلاً، والتفكك عنق الرحم و/أو الخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون). دون تأخير، تشريح مستودعات (مثلاً، والأنسجة الدهنية البيضاء الاربية أو الأنسجة الدهنية بيريجونادال الأبيض) المطلوب من الأنسجة الدهنية18.
- مع مقص التشريح، قطع الأنسجة على 100 × 15 ملم2 طبق بتري إلى قطع حوالي 0.5 – 1 سم في الحجم، وتزج لهم في أنابيب ميكروسينتريفوجي مليئة 1% منهاج عمل بيجين. الحفاظ على الجليد.
2-كل-جبل تلطيخ من الأنسجة الدهنية البيضاء
- بعد الانتهاء من التشريح، نقل عينات الأنسجة في 1% منهاج عمل بيجين من الجليد غرفة درجة الحرارة (RT) ح 1، ومن ثم نقل الأنسجة إلى لوحة ثقافة خلية 12 أو 24 جيدا للغسيل أسرع.
- تغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني-0.3T، 3 مرات لمدة 5 دقائق في RT على شاكر كل إمالة في 22 °، مع 20 – 25 يميل كل دقيقة بالسرعة.
ملاحظة: استخدم هذا الميل والسرعة لجميع الخطوات اللاحقة التي تنطوي على استخدام شاكر.
ملاحظة: في حالة استخدام خط ماوس مراسل متعدد الألوان مثل mT/mG وإضافية تلطيخ جسم ليست هناك حاجة، والأنسجة جاهز للفحص المجهري بعد الخطوة 2، 2. - إضافة 0.5-1 مل حظر المخزن المؤقت (5% مصل الحيوان تضعف في برنامج تلفزيوني-0.3T). وضع اللوحة على شاكر واحتضانها ح 1 في الرايت
- نضح عرقلة الحل وإضافة الأجسام المضادة الأساسي المخفف في برنامج تلفزيوني-0.3T مع 1% مصل الحيوان.
- وضع لوحة على شاكر عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي يغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني-0.3T 3 مرات على 5 دقائق كل في الرايت
- استخدام الأجسام المضادة الثانوي المناسب المخفف في برنامج تلفزيوني-0.3T. إضافة 0.5-1 مل جسم ثانوي حلول لكل بئر. التفاف اللوحة في رقائق الألومنيوم واحتضان على شاكر لمدة 1 ساعة في الرايت
ملاحظة: يؤدي إلى تمييع جسم الثانوية في الظلام لمنع فوتوبليتشينج. - بعد حضانة جسم الثانوية، يغسل مع برنامج تلفزيوني-0.3T مرتين لمدة 5 دقائق، كل منهما في الرايت صورة العينات إذا كان ليس هو المطلوب وصمة دهن محايدة. إذا كان تصور قطرات الدهن يلزم استخدام الدهن محايدة وصمة عار، يغسل مع برنامج تلفزيوني 1 x (دون الفاعل غير أيونى) مرتين، لمدة 5 دقائق في كل.
- وبعد خطوات الغسيل، احتضان مع وصمة عار الدهن محايدة المخفف بعامل إضعاف 1:1500 في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 30 دقيقة في الرايت الأنسجة جاهزة الآن للفحص المجهري. لتصوير المستقبل، يمكن تخزين الأنسجة في هذا الحل في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: التصوير نوعية تتناقص بمرور الوقت؛ ومن ثم فأفضل وقت للتصوير في غضون أيام 1 أو 2. - استخدام الملقط، تكمن في الأنسجة شقة في 24 × 60 ملم ² زجاج ساترة ووضعه على نظام مجهر مقلوب ليزر [كنفوكل].
- إذا كان المطلوب هو تلطيخ من الأنوية مع DAPI، إضافة 1-2 قطرات من تصاعد المتوسطة التي تحتوي على DAPI تماما تغرق الأنسجة ومنعها من التجفيف.
- للحصول على صور للجامعة-جبل الملون الأنسجة في عدة طائرات المحورية، أداء Z-رزمة من 100-150 ميكرومتر في العمق مع 4 – 6 ميكرومتر خطوة الحجم في التكبير المطلوب.
3-الأنسجة المقاصة واستخدام إيمونولابيلينج إيديسكو +
ملاحظة: هذا البروتوكول على أساس الإجراءات المنشورة سابقا9،،من1019.
- التثبيت والميثانول ما قبل المعالجة
- احتضان الأنسجة في 4% المخفف منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل.
ملاحظة: ترك الأنسجة في أنابيب 2 مل لجميع العلاجات التالية حتى التصوير. - في اليوم التالي، تغسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 1 x ثلاث مرات، لمدة ساعة واحدة كل على شاكر في الرايت
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينة بين عشية وضحاها في الرايت أو 4 درجات مئوية. - يذوي الأنسجة في RT في 20% و 40% 60% 80% ميثانول، فيما بعد، لكل 1 ح. يذوي في 100 ٪ الميثانول في RT 1 ساعة، ثم نقل الأنسجة جديدة 100 ٪ الميثانول واحتضان في ج 4 ح 1.
ملاحظة: يؤدي إلى تمييع الميثانول في الماء المقطر. أثناء الاحتضان الميثانول، ليست هناك حاجة لوضع العينات على شاكر طالما عينات الأنسجة مغمورة.
تنبيه: هذه الخطوة غير خطرة، كما الميثانول السامة. أنها شديدة الاشتعال عند فتح النيران. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان. تخزين الميثانول بعيداً عن الاشتعال وفي سلامة القابلة للاشتعال مجلس الوزراء. - بليتش الأنسجة مع 5% فوق أكسيد الهيدروجين (H2O2؛ المجلد 1 من 30 ٪ ح2س2 المخفف في 5 مجلدات من الميثانول 100 ٪) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
تنبيه: 30% بيروكسيد الهيدروجين خطرة جداً على الجلد، والاتصال بالعين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان. - ترطيب الأنسجة في RT في 80%، 60%، 40%، و 20% والميثانول و 1 x PBS، فيما بعد، لكل 1 ساعة.
- يغسل مع السطح النطاق 0.2% المخفف في برنامج تلفزيوني x 1 مرتين، ل 1 ح في شاكر في الرايت
- احتضان الأنسجة في 4% المخفف منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل.
- إيمونولابيلينج
ملاحظة: تعبئة أنابيب 2 مل تحتوي على الأنسجة إلى الجزء العلوي من الأنبوب مع الحل المستخدم في كل خطوة لمنع أكسدة الأنسجة حالما يبدأ إيمونولابيلينج، حتى يتم إكمال تطهير.- بيرميبيليزي الأنسجة التي تفرخ لهم في حل 1 x PBS والفاعل النطاق 0.2%، 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وجليكاين 0.3 متر عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة يومين.
ملاحظة: فترة الحضانة القصوى للخطوة permeabilization 37 درجة مئوية 2 يوما. - كتلة الأنسجة في حل 1 × برنامج تلفزيوني والفاعل النطاق 0.2%، 10% [دمس]، المصل حمار 5% وكتلة Fc 1% عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة يومين.
ملاحظة: فترة الحضانة القصوى لخطوة حظر 2 يوما. - احتضان الأنسجة في أجسام الأولية من مصلحة في التوصل إلى حل لبرنامج تلفزيوني 1 x، 0.2% بوليسوربيت 20، 10 الهيبارين ميكروغرام/مل و [دمس] 5% 5% حمار المصل في 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة 4 أيام.
- يغسل مع 1 × برنامج تلفزيوني و 0.2% بوليسوربيت 20 و 10 ميكروغرام/مل الهيبارين على شاكر في الرايت خمس مرات، كل من ح 1.
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف مؤقت ترك عينات بين عشية وضحاها في الرايت - احتضان الأنسجة بالجسم المضاد الثانوي في إيجاد حل لبرنامج تلفزيوني 1 x، 0.2% بوليسوربيت 20، 10 ميكروغرام/مل الهيبارين، و 5% حمار المصل في 37 درجة مئوية في منضدية شاكر مدارية لمدة 4 أيام.
ملاحظة: من الخطوة 3.2.5، جميع العينات تحتاج إلى أن تكون ملفوفة برقائق الألومنيوم لمنع فوتوبليتشينج جسم الثانوية. - غسل الأنسجة في حل 1 x برنامج تلفزيوني، 0.2% بوليسوربيت 20، و 10 ميكروغرام/مل الهيبارين على شاكر في الرايت خمس مرات، لمدة 2 حاء.
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينات بين عشية وضحاها في الرايت
- بيرميبيليزي الأنسجة التي تفرخ لهم في حل 1 x PBS والفاعل النطاق 0.2%، 20% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وجليكاين 0.3 متر عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري منضدية المحتضنة لمدة يومين.
- إزالة الأنسجة الدهنية البيضاء وتصوير حجم الأنسجة
- يذوي الأنسجة الواردة في أنابيب 2 مل بحضانة في 20%، 40%، 60%، و 80 ٪ الميثانول، فيما بعد، كل منهما لمدة ساعة واحدة في الرايت ثم يذوي العينات في 100 ٪ الميثانول مرتين في الرايت
ملاحظة: يمكن أن تكون هذه الخطوة نقطة الإيقاف المؤقت ترك العينات الخاصة بك في الميثانول 100% بين عشية وضحاها في الرايت - احتضان الأنسجة بمزيج أحجام DCM 2 بحجم 1 من الميثانول ح 3 في RT على شاكر.
ملاحظة: DCM قابلة للاشتعال. تأكد من الأنابيب محكم مختومة لمنع التبخر.
تنبيه: هذه الخطوة الخطرة. • قرار مجلس الوزراء السمية عند استنشاقه. التعرض لفترة طويلة يمكن أن تسبب الحروق الكيميائية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثل القفازات النتريل، معطف مختبر، الأحذية، ونظارات واقية). استخدام غطاء دخان. - احتضان الأنسجة في DCM 100% مرتين، لمدة كل 15 دقيقة على شاكر في الرايت
- احتضان في 100% قسم تعزيز الحدود في الرايت حتى تصوير وتخزين العينة. قبل التصوير، وعكس الأنابيب عدة مرات لخلط الحلول.
ملاحظة: ملء تماما أنابيب مع قسم تعزيز الحدود لمنع الأكسدة، التي يمكن أن تؤدي في الأنسجة غير ناجحة المقاصة. لا تهز الأنابيب خلال الحضانة قسم تعزيز الحدود.
تنبيه: هذه الخطوة الخطرة. قسم تعزيز الحدود السامة. يمكن أن يسبب تهيج العينين والجلد. ارتداء معدات الوقاية الشخصية (مثلاً، النتريل القفازات، معطف مختبر، نظارات واقية) والتعامل معها في غطاء دخان. - صورة عينة الأنسجة كاملة مع مجهر ضوء الذي يطابق الانكسار من قسم تعزيز الحدود المذيبات العضوية. أداء التراص Z في التكبير المطلوب وحجم الخطوة للنسيج كله.
- يذوي الأنسجة الواردة في أنابيب 2 مل بحضانة في 20%، 40%، 60%، و 80 ٪ الميثانول، فيما بعد، كل منهما لمدة ساعة واحدة في الرايت ثم يذوي العينات في 100 ٪ الميثانول مرتين في الرايت
4-أمثلة لتحليل البيانات من كل جبل الملون صور الأنسجة باستخدام إيماجيج
ملاحظة: انظر https://imageJ.nih.gov/ij/download.html للحصول على إرشادات التحميل والتثبيت.
- التحديد الكمي لكثافة الأوعية الدموية (الملحق الرقم 2)
- استيراد الصور المحفوظة فقط القناة مع الأوعية الدموية إيمونوستينينج على إيماجيج.
ملاحظة: يجب أن تكون الصور للقياس الكمي متسقة من حيث الإجراء المصبوغة وشرط الحصول على الصورة. وينبغي استخدام الكواشف متطابقة. زمن التعرض، كثافة، والتكبير كما ينبغي ما يعادل في عملية التصوير20. - تحويل لون الصورة إلى أبيض وأسود للتحديد الكمي كثافة الأوعية الدموية. للقيام بذلك، ضمن علامة التبويب "صورة" ، اختر الأمر "ضبط" ، ثم الخيار "لون عتبة" . في "لون عتبة" عرض مربع واختر "خلفية داكنة"20 وحدد "B & W" تحت "عتبة اللون".
- لقياس النسبة المئوية لمجال الأوعية الدموية الإشارات الخلفية، حدد علامة التبويب "تحليل" , ثم الأمر "تحليل الجزيئات" . ضمن عرض "تحليلالجزيئات"، حدد خيارات "نتائج واضحة" و "تلخيص" . انقر فوق "موافق".
- نسخ ولصق القيمة للمنطقة النسبة المئوية ضمن علامة التبويب ملخص إلى جدول بيانات لتحليل. النسبة المئوية للمساحة سوف تبين كثافة الأوعية الدموية. كرر الخطوات 4.3.1–4.3.4 لكل صورة فردية.
- استيراد الصور المحفوظة فقط القناة مع الأوعية الدموية إيمونوستينينج على إيماجيج.
- التحديد الكمي ل adipocyte حجم21 (التكميلية الرقم 3)
- استيراد الصور المحفوظة في adipocytes على ImageJ.
- لتعيين حجم الصورة، قياس طول الجدول في بكسل عن طريق تتبع خط للمقياس بمسافة معروفة في الصورة باستخدام أداة التحديد الخط المستقيم. ضمن علامة التبويب "تحليل" ، اختر الأمر "تعيين مقياس" . سيتم تلقائياً حساب المسافة بين السطر الذي تم تتبعه قبل بالبكسل.
- سوف يظهر مربع عرض "تعيين مقياس" . أدخل المسافة المعروفة ووحدة الطول. حدد "العالمي" لتطبيق جدول تعيين لكل الصور المستوردة وانقر فوق "موافق".
- اختيار تحديد المنطقة كالأسلوب للقياس، ضمن علامة التبويب "تحليل" الأمر "تعيين قياسات" . سوف تظهر قائمة بخيارات مختلفة للقياسات. حدد الخيار "المنطقة" وانقر فوق "موافق".
- باستخدام أداة التحديد اليدوي، تتبع محيط adipocyte كل الاهتمام. ضمن علامة التبويب "تحليل" ، اختر الأمر "التدبير (Ctrl + M)" ، ومنطقة adipocyte ستظهر. كرر هذا الإجراء لأخرى adipocytes في الصورة.
ملاحظة: لضمان دقة القياسات، استخدام صور متعددة للقياس الكمي. - نسخ ولصق قياسات المجال في جداول بيانات لتحليل البيانات كذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بسبب هشاشة الأنسجة الدهنية، الأساليب التي تنطوي على عدة خطوات المعالجة وتمزيقها يمكن أن تؤدي إلى تشوهات في الأنسجة الدهنية مورفولوجيا3 (الشكل 1A). ومع ذلك، تلطيخ كل جبل يمكن الحفاظ على مورفولوجية adipocytes، ضمان التفسير الدقيق للنتائج (الشكل 1B).
التثبيت الزائد من الأنسجة الدهنية يؤدي إلى أوتوفلوريسسينسي التي يسببها مثبت. كما هو مبين في الشكل 2 ألف، تتداخل مع قنوات الأخضر والأحمر تلطيخ hydroxylase التيروزين (TH) وإشارات بيكم-1، على التوالي، في مناطق مماثلة من الأنسجة، مما يشير إلى أن أوتوفلوريسسينسي قد يكون قد حدث بسبب تثبيت الإفراط في منهاج العمل لمدة 3 أيام. وفي المقابل، يظهر الشكل 2B صورة تمثيلية للجامعة-جبل تلطيخ عند إجراء التثبيت الصحيح، كالإشارة لتلطيخ ال يحدث في مناطق مختلفة بالنسبة لإشارة بيكم-1، مما يدل على أن هذه الإشارة ليست أوتوفلوريسسينسي و في الواقع إشارة إيجابية.
تلطيخ كل جبل أداة هامة تصور لتتبع النسب العرقية-المستندة إلى لوكسب adipocytes15، مع mT/mG يجري النظام المثالي مراسل18. Ng2، علامة للسكان خلية السلف adipocyte، بروتيوغليكان غشاء البلازما. في هذا النظام، الخلايا Ng2-لجنة المساواة العرقية-إيجابي صريح م-التجارة والنقل، بينما أعرب عن m-الطماطم في Ng2-لجنة المساواة العرقية-سلبية الخلايا (الشكل 3).
الأنسجة الدهنية جهاز حيوي بشكل لا يصدق، قادرة على التوسع والانكماش تحت مختلف الظروف والمتطلبات الفسيولوجية20. التصوير الملون الأنسجة الدهنية كل جبل يسمح للتحديد الكمي لتغييرات إيمورفولوجيكال تحت ظروف تجريبية مختلفة. على وجه الخصوص، الأنسجة الدهنية هو الغاية vascularized، هو أمر مهم في الوساطة التوازن الأيضي عند التغيرات السريعة في مستوى الطاقة1. على سبيل المثال، الفئران C57BL/6J التي يخضع لها ح 24 الصيام عرض أصغر بكثير من حجم adipocyte (الشكل 4)، تشير إلى lipolysis، واتجاهاً في كثافة الأوعية الدموية مرتفعة مقارنة باستمرار تغذية الفئران (الشكل 5). استخدمت برنامج إيماجيج لقياس حجم adipocytes وكثافة الأوعية الدموية، كما هو موضح أعلاه.
إزالة الأنسجة تقنية جديدة نسبيا لإزالة التكتم الأنسجة الدهنية للسماح للتصور العميق داخل الأنسجة حجم9،10 (الشكل 6). كل جبل تلطيخ على لغم قد استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] فقط أظهرت تعصيب متعاطفة المتفرقة، إذ لا يمكن تصور الألياف العصبية تحت سطح النسيج (الشكل 7 أ). ومع ذلك، يمكن ملاحظة أربوريزيشن العصبية الكثيفة بعد إزالة الأنسجة وإيمونولابيلينج مع استخدام إيديسكو +، فضلا عن استخدام ورقة الضوء الفلورسنت مجهرية () (الشكل 7).
رقم 1: مقارنة بين مورفولوجيا الأنسجة الدهنية مع التقنيات المورفولوجية التقليدية وتقنية المصبوغة كلياً-جبل- (أ) ح & ه الملون الأنسجة الدهنية في مقطع جزءا لا يتجزأ من البارافين (يسار)، مع رؤوس الأسود يشير إلى مناطق مشوهة في adipocytes. صبغ فلوري يكتين (الكربوهيدرات ملزمة البروتين، الأبيض الأسهم) والحقن وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت F4/80 (علامة بلعم، رؤوس الأسهم الصفراء)، و DAPI نوى تلطيخ الأنسجة الدهنية في كريوسيكتيون (يمين). (ب) الأنسجة الدهنية البيضاء التصور استخدام الجامعة-جبل تلطيخ مع خطوة-حجم 5 ميكرومترات. مجموع عمق المكدس Z القبض على حوالي 100 ميكرومتر. قطرات دهن adipocyte كانت ملطخة بدهن محايد وصمة عار (الرمادي)، والأوعية الدموية كانت ملطخة بيكم-1. صورة تم التقاطها بالفحص المجهري مع خطوة-حجم 5 ميكرومترات التراص Z (أحمر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التصور للألياف العصبية والأوعية الدموية باستخدام كل جبل الملون الأنسجة الدهنية. (أ) الصور المجهرية الممثل لنتائج غير مرغوب فيها من أسرة-جبل بوت ملطخة بسبب تثبيت الإفراط في منهاج العمل لمدة 3 أيام. وترد إشارات متداخلة برؤوس بيضاء. (ب) الصور المجهرية الممثل من تحقيق نتيجة إيجابية من الجامعة-جبل الملون قد من التحكم الماوس. تم القبض على الصور في 100 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تتبع نسب استخدام النظام mT/mG في الأنسجة الدهنية. صور ممثل لجنة المساواة العرقية-إيجابية (mG) وخلايا سالب لجنة المساواة العرقية (mT) في قد Ng2-لجنة المساواة العرقية؛ mT/mG الماوس. تم القبض على الصور في 200 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التصور والتحديد الكمي لحجم adipocyte. (أ) صور الممثل من adipocytes في بوت من تغذية ومدار صام C57BL/6J أجهزة الماوس باستخدام تلطيخ الدهني محايدة. تم القبض على الصور في 200 x التكبير. (ب) Adipocyte حجم مقارنة بين بنك الاحتياطي الفيدرالي و 24-ح صام C57BL/6J أجهزة الماوس باستخدام البرمجيات إيماجيج. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ 2-الذيل مزاوج الطالب t-اختبار؛ ف < 0.001. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: التصور والتقدير الكمي لكثافة الأوعية الدموية- (أ) صور الممثل من الأوعية الدموية في تغذية ومدار صام C57BL/6J أجهزة الماوس باستخدام جسم بيكم-1. (ب) مقارنة بين كثافة الأوعية الدموية بين بنك الاحتياطي الفيدرالي ومدار صامت C57BL/6J الفئران باستخدام البرمجيات إيماجيج. يتم التعبير عن القيم كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ 2-الذيل مزاوج الطالب t-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إزالة الأنسجة الدهنية باستخدام الأسلوب إيديسكو +- قبل إزالة، معتم الأنسجة. الأنسجة يصبح شفافاً تماما في نهاية الأنسجة إزالة الخطوات.
7 الرقم: الجامعة-جبل الملون قد مقارنة مع قد برات الأنسجة باستخدام أسلوب إيديسكو +- (أ) التصور من الألياف العصبية باستخدام ال جسم (1: 500) في الجامعة-جبل قد ملطخة بتكبير 100 x مع الفحص المجهري [كنفوكل] مع خطوة-حجم من 5 ميكرومترات. مجموع عمق المكدس Z القبض على حوالي 100 ميكرو. (ب) التصور من الألياف العصبية باستخدام ال جسم (1: 200) في الجامعة-جبل ملطخة قد إيديسكو + البروتوكول في 1.6 X التكبير باستخدام لسفم مع خطوة-حجم 4 ميكرومتر. مجموع عمق المكدس Z القبض على حوالي 8 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام التتبع النسب mT/mG- نظام فلورسنت مزدوجة التي توظف المستهدفة لغشاء اجفب والمستهدفة لغشاء تدتوماتو. قبل اقترانها لجنة المساواة العرقية، على الصعيد العالمي أعرب عن mT. عند الخلية عن لجنة المساواة العرقية، هو اقتطعت كاسيت طن متري، وهو أعرب عن ملغ بشكل دائم. ويمثل السلطة الفلسطينية متواليات بوليادينيليشن بعد كودون التوقف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 2: برامج "التطبيق إيماجيج" لقياس المجال النسبة المئوية لكثافة الأوعية الدموية. (A) "الصورة" علامة التبويب أوامر وخيارات تحويل صورة إلى لون الأسود وأبيض عتبة. (ب) ملخص قياس المجال النسبة المئوية لكثافة السفينة باستخدام الأمر "تحليل الجزيئات". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التكميلية الرقم 3: برامج "التطبيق إيماجيج" تحديد حجم منطقة adipocyte- علامة التبويب "تحليل": أوامر "ضبط مقياس" و "قياس" لقياس مجال adipocyte(s). عرض النتائج يظهر مجال adipocyte كل قياس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن تعود بفوائد التقنيات التقليدية مثل الأنسجة وكريوسيكتيون لمراقبة الهيكل داخل الخلايا، يلطخ كل-جبل يقدم وجهة نظر مختلفة في الأنسجة الدهنية للبحوث، التي تمكن 3D التصور الخلوي هندسة الأنسجة المجهزة الحد الأدنى.
من أجل نجاح أداء الجامعة-جبل تلطيخ، الاقتراحات التالية ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. مستودعات لمختلف الأنسجة الدهنية يمكن أن تسفر عن نتائج إيمونوستاينينج مختلفة؛ وهكذا، ينبغي أولاً تحديد نوع مستودع الأنسجة الدهنية المستخدمة. على سبيل المثال، البنى الأنسجة الدهنية (BAT) أكثر كثافة مقارنة بالانسجة الدهنية البيضاء (وات) سبب adipocytes أصغر حجماً، مولتيلوكولار21. هذا زيادة الكثافة بات يجعل من الصعب على الأجسام المضادة تتخلل عبر الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، حجم الأنسجة الدهنية أيضا حتمية لتلطيخ جسم سليم، نظراً للأنسجة الكبيرة/سميكة جداً يمكن أن يؤدي أيضا إلى اختراق جسم غير كافية. ومن ثم، عند الحصول على الأنسجة الدهنية أثناء تشريح الحيوان، الجزء القاصي من الأنسجة الدهنية بيريجونادال ينبغي استخدام، حيث أن هذه هي المنطقة أنحف ويمكن السماح لاختراق جسم كافية وبيانات متسقة. بدلاً من ذلك، للأنسجة أكثر كثافة، قد استخدام خط الماوس مراسل الفلورية، مثل mT/ملغ، تسمح للتصور أفضل علامة للفائدة، وبهذا تتجنب مسألة اختراق جسم غير كافية. وفي وقت لاحق، 1% يستخدم لتثبيت الأنسجة منهاج العمل للمحافظة على التوزيع الطبيعي للبروتينات وضمان الأنسجة بيرميبيليزيشن وجسم اختراق22،23. ومع ذلك، يمكن إنقاص الاعتراف مستضد التثبيت الإفراط وتنتج أوتوفلوريسسينسي24. هذا سبب رد فعل بين مثبت يحتوي على ألدهيد ألدهيد المجموعات في منهاج عمل بيجين وغيرها من مكونات الأنسجة، مما يخلق المركبات الفلورية24. للحيلولة دون الحاجة لخطوة استرجاع مستضد، من المستحسن ترك الأنسجة مثبت لساعة واحدة فقط في درجة حرارة الغرفة وتبدأ الخطوات التالية حالما يتم تثبيت المكتملة7. مثل العديد من التقنيات إيمونولابيلينج الأخرى، المعايرة تركيز الأجسام المضادة خطوة استكشاف الأخطاء وإصلاحها ضرورية لضمان الإشارة المطلوبة.
في الواقع، هناك عدة قيود الجامعة-جبل تلطيخ رغم الأهمية المذكورة آنفا ومزايا. تلوين كل جبل قد متطلبات صارمة فيما يتعلق بنوع الأنسجة، والحجم، نظراً لإمكانية حدوث اختراق جسم غير كافية وتلطيخ متفاوتاً في أكثر ثخانة الأنسجة مثل العضلات والكبد. أيضا، يلطخ كل-جبل ليس هو تمثيل أكثر دقة لبعض الأجسام المضادة مثل hydroxylase التيروزين (TH)، علامة للنظام العصبي الودي، غالباً ما هو ملثمين إشارة بمحتوى الدهون الكثيفة في الأنسجة الدهنية (الشكل 7). وباﻹضافة إلى ذلك، تفاوت سطح الأنسجة الدهنية أيضا تحديا للتصوير [كنفوكل]، حيث لا يمكن التقاط الإشارات الموجودة في طبقات مختلفة من الأنسجة الدهنية بسهولة على صورة واحدة. ولذلك، التحديد الكمي لكثافة إشارة في الصور التي تم الحصول عليها من الجامعة-جبل المصبوغة تسفر عن نتائج غير متناسقة للألياف العصب كل أربوريزيشن. الجزء القاصي من بوات هو عادة الأقل الدهن الكثيفة؛ ومن ثم يمكن الحصول على صور أفضل من هذه المنطقة. ومع ذلك، ما إذا كان هذا المجال هو الممثل للأنسجة كاملة إيمونوستينينج في جميع أنواع الأجسام المضادة سوف تتطلب مزيدا من التحقيق.
بجعل الأنسجة شفافة بصريا، أسلوب تطهير يقلل من تشتت الضوء، تمكين التصور العميق هيكل25. إيديسكو + بروتوكولا غير مكلفة وضعت مؤخرا أن يجمع كل جبل إيمونولابيلينج مع حجم التصوير لمختلف الأنسجة تطهير كبيرة9. ولاحظ إيديسكو معدلة + أساليب مع أظهرت الدراسات الأخيرة9،10 أربوريزيشن الجذعية كثيفة على وات التي لا يمكن أن ينظر إليها مع إيمونولابيلينج التقليدية والفحص المجهري [كنفوكل]. يستخدم التصوير [كنفوكل] التقليدية نظام التصوير بالحزمة والثقب للمسح الضوئي الليزر. سرعة المسح الضوئي واختراق العمق قيود المجهر؛ وهكذا، كثيرا ما غاب عن ديناميات أنسجة ثلاثية الأبعاد. وفي المقابل، قد مجهرية الورقة الضوء المزايا الظاهرة حيث أنه يستخدم المسح الضوئي ورقة وإلا ينير القسم بصري واحد في كل مرة، التقاط جميع الجزيئات الأسفار داخل هذا القسم. وعلاوة على ذلك، فلوروفوريس في أقسام أخرى لا متحمسون، منع آثار تبييض الصورة وسمي ضيائي26. وهكذا، يمكن تقييم كمية تعصيب العصب داخل الأنسجة الدهنية أكثر دقة مع إيديسكو + ولسفم. وعلى الرغم من ذلك، هناك بعض القيود المفروضة على استخدام إيديسكو + ولسفم. على سبيل المثال، المستخدمين يجب ملاحظة أن سوى قنوات في القناة الحمراء واستعملنا متوافق مع إيديسكو +، بسبب أطول الأطوال الموجية للضوء بشكل أفضل قادرة على اختراق عينة27. بالإضافة إلى ذلك، أوتوفلوريسسينسي في الطيف الأزرق والأخضر مرتفع جداً في عينات الأنسجة الكبيرة، حيث التصوير في أطياف الأحمر واستعملنا سوف تساعد على تقليل أي أوتوفلوريسسينسي تحدث14. فيما يتعلق بالفئران المعدلة وراثيا مراسل الفلورسنت، إيديسكو + يمكن أن تصور البروتينات مراسل. ومع ذلك، إيمونولابيلينج المراسل الفلورسنت مع جسم ثانوية ينبغي أن تجري، كما الإشارات الذاتية قد تتلاشى خلال الأنسجة تطهير العملية14. ومع ذلك، هذا الأسلوب قيمة للغاية لدراسة التفاعلات بين الأنسجة الدهنية العصبي الودي والتحقيق اللدونة الدهنية تحت مختلف الظروف الفسيولوجية والتمثيل الغذائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية (مقدمة) من كندا، والطيار ومنحة دراسة الجدوى من بانتنغ وأفضل السكري المركز (بدك)، "الصندوق بدء سيككيدس" إلى ح-ك. س.، "برنامج مركز البحوث الطبية" (2015R1A5A2009124) عبر الوطنية البحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تموله وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، وتخطيط المستقبل إلى ي-ر. ك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
