Summary
המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.
Abstract
רקמת שומן הוא איבר חשוב מטבולית עם פלסטיות גבוה, והוא מגיב לגירויים סביבתיים, מזין מעמד. ככזה, טכניקות שונות פותחו כדי ללמוד על מורפולוגיה וביולוגיה של רקמת שומן. עם זאת, שיטות הדמיה קונבנציונאלי מוגבלות ללמוד את הרקמה בסעיפים 2D, נכשל ללכוד את הארכיטקטורה תלת-ממד של האיבר כולו. כאן אנו מציגים כולה-הר מכתים, שיטה אימונוהיסטוכימיה ששומרת מורפולוגיה רקמת שומן ללא פגע עם שלבי עיבוד מינימלי. לפיכך, המבנים של adipocytes ורכיבים אחרים התאית נשמרים ללא עיוות, השגת את קנאס לוויזואליזציה תלת-ממדית של הרקמה. בנוסף, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם שושלת היוחסין שיטות מעקב כדי לקבוע החלטות גורל התא. עם זאת, טכניקה זו יש כמה מגבלות לספק מידע מדויק לגבי בחלק העמוק של רקמת שומן. כדי להתגבר על מגבלה זו, כולה-הר מכתים יכול להיות משולב עם עוד רקמות ניקוי טכניקות כדי להסיר את opaqueness של רקמת ולאפשר הדמיה מלאה של אנטומיה כולה רקמת שומן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור גיליונות. לכן, רזולוציה גבוהה יותר וייצוג מדויקת יותר של רקמת שומן מבנים ניתן ללכוד עם השילוב של טכניקות אלה.
Introduction
רקמת שומן הוא איבר חיוני עבור אחסון אנרגיה, מאופיין על-ידי נערכו דינמי והרחבת כמעט ללא הגבלה1. בנוסף אנרגיה הומאוסטזיס, רקמת שומן גם ממלא תפקיד חיוני הפרשת הורמון adipokines מעל 50 לווסת פונקציה מטבולית לכל הגוף2. רקמת שומן יש של ארכיטקטורה מגוונת הכוללת של סוגי תאים שונים לרבות adipocytes בוגר, fibroblasts, תאי אנדותל, תאים חיסוניים adipocyte קדמון תאים3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי השמנת יתר, תפקוד מטבולי אחר יכול לשנות משמעותית את תפקוד רקמת שומן ואת microenvironment שלו, אשר כולל אך אינו מוגבל להגדלה של adipocytes, חדירה של תאים דלקתיים (למשל, macrophages), ותפקוד כלי הדם3.
טכניקות מורפולוגי שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosectioning להדגים מספר מגבלות ללמוד ביולוגיה אדיפוז כגון שלבי עיבוד כימי ממושך, אשר יכול להוביל רקמות הצטמקות ומבנה עיוות3, 4. יתר על כן, טכניקות 2D אלה אינם מספיקים לקיים אינטראקציות המערכת שהופעל על ידי סוגי תאים שונים, כמו הסעיפים שהושגו מוגבלת לאזורים קטנים יותר של רקמת כולה3. בהשוואה לקונבנציונלי שיטות הדמיה פלורסנט, כולה-הר מכתים אינה דורשת שלבים פולשניים נוספים, כגון הטבעה, חלוקתה, התייבשות; לכן, זה מונע את הבעיה של צמצום נוגדן ירידה לפרטים. ככזו, היא שיטה פשוטה ויעילה עבור הדמיה רקמת שומן, עם שימור טוב יותר של רקמת שומן הכולל מבנה5ומורפולוגיה adipocyte. לכן, כל הר מכתים כל טכניקה מהירה וזולה immunolabeling הוקם כדי לשמר את רקמת שומן ארכיטקטורה תלת-ממד1,6,7,8.
עם זאת, למרות שימור רקמת שומן מורפולוגיה עם השימוש כולה-הר מכתים, טכניקה זו היא עדיין מסוגלים לדמיין את המבנים הפנימיים מתחת לפני השטח השומנים של הרקמה. מספר האחרונות מחקרים9,10 הקימו רקמות ניקוי טכניקות בשילוב עם1,כולה-הר immunolabeling6 כדי לאפשר לוויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה בתוך רקמת שומן. בפרט, רשתות עצביות, להערכת צפופה היו דמיינו האחרונות מחקרים9,10,11,12 עם הדמיה תלת-ממדי. אכן, לומד את פלסטיות עצבית ואת כלי הדם של רקמת שומן בתנאים פיזיולוגיים שונים חיוני ללמוד ביולוגיה שלה. מאופשר Immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של ניקוי רקמות איברים הממס-והפנים (iDISCO +) הוא תהליך מורכב של מתנול קדם טיפול, immunolabeling, וניקוי של רקמת opaqueness עם ריאקטיבים כימיים אורגניים דיכלורומתאן (DCM ) ו dibenzyl (אנגלית) אתר13,14. על ידי ביצוע של רקמת שומן שקוף לחלוטין, ייצוג מדויק יותר של האנטומיה בתוך רקמת הדם ו סיבים עצביים ניתן להשיג9,10. IDISCO + יש יתרונות בכך שהוא תואם נוגדנים שונים,11,כתבים פלורסנט14, זה הוכיח הצלחה איברים מרובים, אפילו embryoes14. עם זאת, מגבלה הראשי שלה הוא זמן דגירה ארוך, שבו 18-20 ימים יש צורך להשלים את הניסוי כולו.
יישום חשוב נוסף של צביעת כולה-הר הוא הפריט החזותי של גורל בשילוב עם מערכת מעקב אחר שושלת היוחסין. מעקב אחר שושלת היוחסין היא תוויות של הגן/סמן ספציפי בתא ניתן להעביר כל התאים הבת, כולו מעל הזמן15. ככזה, הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לקבוע את גורלו של רומא התא15. מאז שנות ה-90, המערכת רקומביננטי Cre-LoxP הפכה בגישה רב-עוצמה עבור מעקב אחר שושלת היוחסין חי אורגניזמים15. כאשר קו העכבר המבטאת Cre, אנזים recombinase ה-DNA, הוא חצה עם קו אחר העכבר לבטא כתב הסמוכה לרצף loxP-עצור-loxP, החלבון הכתב הוא ביטוי15.
עבור כל-הר מכתים, השימוש של כתבים ססגוניות פלורסנט מתאים הדמיה של רקמת שומן, כי זה מאפשר התערבות מינימלית עם פעילויות תאיים של adipocyte ה-16. עם זאת, כתבים מסורתיים בדרך כלל כתם הציטופלסמה, ולכן קשה לאתר את שושלת היוחסין של לבן adipocytes, אשר מוגבלת תוכן cytoplasmic17. כדי להתגבר על בעיה זו, השימוש של קרום מכורך פלורסנט tdTomato/ממברנה eGFP (mT/מ ג) כתב סמן הוא כלי אידיאלי. TdTomato, ממוקדות ממברנה מתבטא Cre-שלילי תאים18. על כריתה Cre, לעבור הביטוי של eGFP, ממוקדות ממברנה מתרחש, שהופך את הכתב מתאים לאתר את שושלת היוחסין של adipocyte אבות17,18 (איור משלים 1).
מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט עבור כל-הר מכתים ולהראות איך זה יכול להיות משולב עם טכניקות אחרות ללמוד פיתוח, הפיזיולוגיה של רקמת שומן. שתי דוגמאות של יישומים שמתואר פרוטוקול זה הם השימוש עם הכתב 1) ססגוניות קווים העכבר כדי לזהות את המקורות השונים של adipocytes ו- 2) רקמת ניקוי להמחיש עוד יותר את arborization עצבית של שומן לבן (וואט).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים בעלי חיים ניסיוני אושרו על-ידי הוועדה אכפת לי חיה של המרכז עבור Phenogenomics (TCP) תאמו את הסטנדרטים של המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים. עכברים היו ביום 12-h/כהה מחזורים, מספק גישה חופשית אל מים ומזון. חודש 7 עכברים זכר הישן של C57BL/6J שימשו בניסוי מכתימים כולה-הר.
הערה: סעיפים 1-2 הם לפי סדר כרונולוגי, עם סעיף 3 להיות שלב אופציונלי מיד אחרי סעיף 1. סעיף 4 יכול להתבצע כדי לנתח צפיפות הגודל של כלי דם adipocyte לאחר השלמתו של סעיף 2.
1. חומרי הכנה ובידוד רקמות
- להכין טרי paraformaldehyde 1% (PFA) מדולל 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עבור קיבוע הרקמה. להכין 0.3% nonionic חומרים פעילי שטח מדולל ב- PBS 1 x (ןלהל PBS-0.3T) עבור רקמות שלאחר מכן שטיפת מדרגות.
הערה: עבור כל רקמות, להכין כ- 1.5 מ ל 1% מחברים כדי להבטיח טבילה מלאה. אמצעי קיבוע עלול להיות גדל או קטן בהתאם לגודל רקמות.
התראה: השלב זה מסוכנים, כמו כדורגלן הוא מאכל ולא רעילים. ללבוש ציוד מגן אישי (למשל, nitrile כפפות, חלוק המעבדה, נעליים, משקפי בטיחות) וידית בשכונה fume. - המתת חסד חיות על פי שגרת שאושרו (למשל, נקע בצוואר הרחם ו/או חנק פחמן דו חמצני). ללא דיחוי, לנתח את רקמת שומן הרצוי מחסני (למשל, שומן לבן המפשעתית או רקמת שומן perigonadal לבן)18.
- עם חיתוך מספריים, חותכים את הרקמה על 100 x 15 מ מ2 פטרי חתיכות כ 0.5-1 ס מ גודל, לטבול אותם microcentrifuge צינורות מלאים 1% מחברים. לשמור על הקרח.
2. כולה-הר כתמים שומן לבן
- בתום ניתוח, להזיז את דגימות רקמה 1% כדורגלן מן הקרח אל חדר טמפרטורה (RT) עבור 1 h, ולאחר מכן להעביר את הרקמות על צלחת תרבות 12 או 24-ובכן תא כביסה מהירה יותר.
- לשטוף את הרקמות עם PBS-0.3T, 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב- RT-מטרף מוטה-22 °, עם 20 – 25 מטה לכל מין כמו המהירות.
הערה: השתמש זו הטיה ומהירות עבור כל השלבים הבאים הכרוכות של מטרף.
הערה: אם באמצעות קו העכבר כתב ססגוניות כגון mT/mG ו נוספים נוגדנים מכתים לא נחוצה, הרקמה. והיא מוכנה מיקרוסקופ לאחר שלב 2.2. - להוסיף 0.5-1 mL מאגר חסימה (5% בעלי חיים סרום מדולל ב- PBS-0.3T). לשים את הצלחת ניעור, תקופת דגירה של 1 h ב- RT.
- האחות הפתרון חסימה ולהוסיף נוגדנים העיקרי מדולל ב- PBS-0.3T עם סרום בעל חיים 1%.
- המקום הלוחית מטרף ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, לשטוף את הרקמות עם PBS-0.3T 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד RT.
- להשתמש המתאים נוגדנים משניים מדולל ב- PBS-0.3T. להוסיף 1-0.5 מ"ל נוגדן משני פתרונות מכל קידוח. לעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום, דגירה זה על מטרף למשך שעה-RT.
הערה: לדלל הנוגדן משני בחושך כדי למנוע photobleaching. - לאחר דגירה נוגדנים משניים, לשטוף עם PBS-0.3T פעמיים במשך 5 דקות, כל אחד RT. תמונה הדגימות אם כתם השומנים נייטרלי אינו רצוי. אם ויזואליזציה של טיפות השומנים הדרושים באמצעות את השומנים נייטרלי כתם, לשטוף עם PBS 1 x (ללא חומרים פעילי שטח ללא יונית) פעמיים, למשך 5 דקות.
- אחרי הצעדים כביסה, דגירה עם הכתם השומנים נייטרלי מדולל עם גורם לדילול 1:1500 1 x PBS למשך 30 דקות ב- RT. הרקמות מוכנים עכשיו מיקרוסקופ. עבור הדמיה בעתיד, הרקמות ניתן לאחסן בפתרון זה ב- 4 מעלות צלזיוס.
הערה: הדמיה איכות יורד לאורך זמן; ומכאן, הוא הזמן הטוב ביותר עבור הדמיה תוך 1-2 ימים. - באמצעות מלקחיים, להניח את הרקמה מונחות על coverslip זכוכית 24 x 60 mm ² ומניחים אותו על מערכת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי הפוכה.
- אם מכתים של הגרעינים עם דאפי היא הרצויה, מוסיפים 1-2 טיפות של הרכבה בינונית המכיל דאפי לגמרי להטביע את הרקמות ולמנוע התייבשות.
- כדי לקבל תמונות של כל-הר צבעונית רקמות על מספר מישורים מוקד, לבצע Z-ערימות של 100 – 150 μm לעומק עם 4-6 μm שלב-גודל ההגדלה הרצויה.
3. רקמות סליקה ושימוש Immunolabeling iDISCO +
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על הנהלים שפורסמו בעבר9,10,19.
- קיבוע וטיפול טרום מתנול
- דגירה הרקמות ב 4% PFA מדולל ב- 1 x PBS ב 4° C לילה ב- 2 mL microcentrifuge צינורות.
הערה: השאירו את הרקמות הצינורות 2 mL עבור כל הטיפולים הבאים עד הדמיה. - למחרת, לשטוף את הרקמות ב- PBS 1 x שלוש פעמים, במשך שעה כל אחת על מטרף-RT.
הערה: שלב זה יכול להיות נקודת משהה לעזוב את המדגם ללון במלון RT או 4 ° C. - מייבשים את הרקמות-RT ב 20%, 40%, 60% ו- 80% מתנול, לאחר מכן, עבור 1 h. מייבשים ב- 100% מתנול ב RT למשך שעה, ואז להעביר את הרקמות טריים 100% מתנול, דגירה-4c עבור 1 h.
הערה: לדלל מתנול במים מזוקקים. במהלך הדגירה מתנול, שאין צורך לשים דגימות מטרף כל עוד דגימות רקמה שקועים.
התראה: השלב זה מסוכנים, כפי מתנול רעיל. . זה דליק על יריעת. ללבוש ציוד מגן אישי (למשל, nitrile כפפות, המעבדה, בטיחות משקפי מגן) וטפל בשכונה fume. אחסן את מתנול הרחק הצתה, בבטיחות דליק הקבינט. - אקונומיקה הרקמות עם 5% חמצן מימן (H2O2; נפח 1 של 30% H2O2 מדולל 5 כרכים של 100% מתנול) בן לילה ב 4 º C.
התראה: 30% חמצן. הוא דבר מסוכן מאוד על העור ועל קשר עין ללבוש ציוד מגן אישי (למשל, nitrile כפפות, המעבדה, בטיחות משקפי מגן) וטפל בשכונה fume. - נוזלים ברקמות ב RT 80%, 60%, 40%, ו- 20% מתנול, 1 x PBS, לאחר מכן, במשך שעה כל אחת.
- לשטוף עם 0.2% nonionic חומרים פעילי שטח מדולל פעמיים, ב- 1 x PBS על 1 h כל ב מטרף-RT.
- דגירה הרקמות ב 4% PFA מדולל ב- 1 x PBS ב 4° C לילה ב- 2 mL microcentrifuge צינורות.
- Immunolabeling
הערה: למלא הצינורות 2 מ"ל המכיל את הרקמה לחלק העליון של הצינור עם הפתרון משמש כל צעד כדי למנוע חמצון הרקמות ברגע immunolabeling מתחיל, עד להשלמת ניקוי.- Permeabilize הרקמות מאת המקננת בהם בפתרון של 1 x PBS, חומרים פעילי שטח nonionic 0.2%, 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) 0.3 M גליצין-37 מעלות צלזיוס על שאכר מסלולית שולחן incubated 2 ימים.
הערה: זמן הדגירה המרבי עבור שלב permeabilization 37 ° C הוא יומיים. - לחסום את רקמות בריכוז של 1 x PBS, 0.2% nonionic חומרים פעילי שטח, דימתיל סולפוקסיד 10%, 5% חמור סרום ו 1% בלוק Fc-37 מעלות צלזיוס על שאכר מסלולית שולחן incubated 2 ימים.
הערה: זמן הדגירה המרבי עבור השלב חסימה הוא יומיים. - דגירה של רקמות נוגדנים הראשי עניין בפתרון של 1 x PBS, 0.2% polysorbate 20, 10 µg/mL הפארין, דימתיל סולפוקסיד 5% ו- 5% סרום חמור ב- 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית שולחן incubated ארבעה ימים.
- לשטוף עם 1 x PBS 0.2% polysorbate 20, הפארין µg/mL 10 על מטרף-RT חמש פעמים, כל אחת לשעה.
הערה: שלב זה יכול להיות נקודת השהה לעזוב את דגימות ללון ב- RT. - דגירה רקמות עם נוגדנים משניים בריכוז של 1 x PBS, 0.2% polysorbate 20, 10 הפארין µg/mL, ו 5% סרום חמור ב 37 ° C-תפקודי לב / שולחן ארבעה ימים.
הערה: מהשלב 3.2.5, כל דוגמאות צריך להיות עטוף ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של נוגדנים משניים. - רחץ רקמות בריכוז של 1 x PBS 0.2% polysorbate 20, הפארין µg/mL 10 על מטרף ב RT חמש פעמים, כבר שעתיים כל אחד.
הערה: שלב זה יכול להיות נקודת משהה לעזוב את הדגימות ללון ב- RT.
- Permeabilize הרקמות מאת המקננת בהם בפתרון של 1 x PBS, חומרים פעילי שטח nonionic 0.2%, 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) 0.3 M גליצין-37 מעלות צלזיוס על שאכר מסלולית שולחן incubated 2 ימים.
- ניקוי של שומן לבן והדמיה נפח הרקמה
- מייבשים הרקמות הכלול 2 mL צינורות מאת המקננת ב 20%, 40%, 60% ו- 80% מתנול, לאחר מכן, כל אחד למשך שעה-RT. לאחר מכן, מייבשים את הדגימות ב- 100% מתנול פעמיים על RT.
הערה: שלב זה יכול להיות נקודת משהה לעזוב את הדגימות שלך ב- 100% מתנול ללון ב- RT. - דגירה הרקמות בתערובת של 2 כרכים של DCM לנפח 1 של מתנול עבור 3 h ב- RT-מטרף.
הערה: DCM הוא הפכפך. ודא שהצינורות חתומות בחוזקה כדי למנוע התאיידות.
התראה: השלב זה מסוכנים. DCM רעיל בעת שאיפה. חשיפה ממושכת עלולה לגרום כוויות כימיות. ללבוש ציוד מגן אישי (למשל, nitrile כפפות, חלוק המעבדה, נעליים, משקפי בטיחות). השתמש ברדס fume. - תקופת דגירה של הרקמות ב- 100% DCM פעמיים, של 15 דקות כל אחד על מטרף-RT.
- דגירה ב-100% יהיה ב- RT עד הדמיה, עבור אחסון מדגם. לפני הדמיה, היפוך הצינורות מספר פעמים כדי לערבב את הפתרונות.
הערה: למלא לגמרי צינורות אנגלית כדי למנוע חמצון, אשר עלולה לגרום ניקוי רקמות לא מוצלח. אל תלחץ הצינורות במהלך הדגירה אנגלית.
התראה: השלב זה מסוכנים. יהיה רעיל. זה יכול לגרום לגירוי בעיניים, בעור. ללבוש ציוד מגן אישי (למשל, nitrile כפפות, המעבדה, בטיחות משקפי מגן) וטפל בשכונה fume. - תמונה כל הרקמות עם מיקרוסקופ אור, התואם את מקדם שבירה של אנגלית בממיסים אורגניים. לבצע Z-לערום ההגדלה הרצויה, שלב-גודל עבור כל הרקמה.
- מייבשים הרקמות הכלול 2 mL צינורות מאת המקננת ב 20%, 40%, 60% ו- 80% מתנול, לאחר מכן, כל אחד למשך שעה-RT. לאחר מכן, מייבשים את הדגימות ב- 100% מתנול פעמיים על RT.
4. דוגמאות של ניתוח נתונים מתוך כל-הר צבעונית תמונות רקמה באמצעות ImageJ
הערה: ראה https://imageJ.nih.gov/ij/download.html לקבלת הוראות ההורדה וההתקנה.
- כימות של צפיפות כלי הדם ( איור 2Supplementary )
- לייבא את התמונות השמורות של הערוץ רק עם כלי דם immunostaining אל ImageJ.
הערה: התמונות על כימות צריך להיות עקבי מבחינת ההליך מכתימים ותנאי רכישה התמונה. ריאגנטים זהה אמור לשמש. זמן חשיפה, בעוצמה, ואת ההגדלה צריך גם להיות שוות ערך תהליך ההדמיה20. - להמיר את צבע התמונה בשחור-לבן על כימות צפיפות כלי דם. לשם כך, תחת לשונית 'תמונה' , בחר בפקודה "התאם" , אז האפשרות "צבע הסף" . בתוך "סף הצבע" להציג תיבת, בחר "רקע כהה"20 ובחר "B & W" תחת "סף צבע".
- כדי למדוד את אחוז שטח של כלי דם אות על רקע, בחר את הכרטיסיה 'נתח' , ואז בפקודה "חלקיקים לנתח" . תחת התצוגה של ' חלקיקים ניתח ', בחר באפשרויות "תוצאות ברורות" ו- "סכם" . לחץ על "אישור".
- העתק והדבק את הערך של האזור אחוז תחת הכרטיסיה תקציר לתוך גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח. האחוז של אזור יציין את צפיפות כלי דם. חזור על צעדים 4.3.1–4.3.4 עבור כל תמונה בנפרד.
- לייבא את התמונות השמורות של הערוץ רק עם כלי דם immunostaining אל ImageJ.
- כימות של adipocyte גודל21 ( איור 3Supplementary )
- ייבוא התמונות השמורות של adipocytes אל ImageJ.
- כדי להגדיר את הגודל של התמונה, למדוד את האורך של הסקאלה בפיקסלים ע י איתור קו הסולם עם מרחק ידוע בתמונה באמצעות הכלי בחירה בקו ישר. תחת לשונית 'נתח' , בחר בפקודה "קבע קנה מידה" . המרחק של הקו שהיתה במעקב לפני יחושבו באופן אוטומטי בפיקסלים.
- תיבת התצוגה "סולם להגדיר" יופיע. הזן את מרחק ידוע ואת יחידת אורך. בחר "גלובל" כדי להחיל את קנה המידה להגדרת כל התמונות המיובאות, לחץ על "אישור".
- כדי לבחור אזור כמו שיטת המדידה, תחת לשונית 'נתח' בחר בפקודה "הגדרת המידות" . תופיע רשימה של אפשרויות שונות למדידות. בחר באפשרות "אזור" ולחץ על "אישור".
- בעזרת כלי הבחירה ביד חופשית, להתחקות אחר ההיקף של adipocyte בכל עניין. תחת לשונית 'נתח' , בחר בפקודה "מדד (Ctrl + M)" , והוא האזור של adipocyte יופיע. חזור על הליך זה עבור אחרים adipocytes בתמונה.
הערה: כדי להבטיח מדידות מדויקות, יש להשתמש בתמונות מרובות על כימות. - העתק והדבק את המידות אזור לתוך גיליון אלקטרוני לצורך ניתוח נתונים נוסף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשל השבריריות של רקמת שומן, שיטות המערבים מספר שלבי עיבוד, חלוקתה יכול להוביל עיוות של רקמת שומן מורפולוגיה3 (איור 1 א'). עם זאת, כולה-הר מכתים ניתן לשמור על המורפולוגיה של adipocytes, הבטחת לפירוש מדויק של תוצאות (איור 1B).
קיבוע יתר של רקמת שומן מוביל מקבע-induced autofluorescence. כפי שמוצג באיור 2A, ערוצי ירוק ואדום צביעת עבור hydroxylase טירוזין (ה) ו- PECAM-1 אותות, בהתאמה, חופפים באזורים זהה של הרקמה, המציין שאת autofluorescence ייתכן שאירעה עקב קיבוע יתר PFA במשך 3 ימים. לעומת זאת, דמות 2B מציגה תמונת הנציגה של כולה-הר מכתים כאשר מבוצע קיבוע נאות, כמו האות TH מכתים מתרחשת באזורים שונים ביחס אות PECAM-1, מפגינים כי האות הזה הוא לא autofluorescence, הוא למעשה סימן חיובי.
מכתים כל-הר הוא כלי חשוב ויזואליזציה לעקיבה Cre-loxP מבוססי שושלת היוחסין של adipocytes15, עם mT/mG להיות מערכת הכתב אידיאלי18. Ng2, סמן לאוכלוסיה תא קדמון adipocyte, הוא פרוטאוגליקן קרום פלזמה. במערכת זו, Ng2-Cre-חיוביות תאי m אקספרס-GFP, ואילו m-עגבניות מתבטא בתאים Ng2-Cre-שלילי (איור 3).
רקמת שומן הוא איבר דינאמי מאוד, מסוגל הרחבה וכיווץ תחת שונות פיזיולוגית התנאים והדרישות20. הדמיה צבעונית רקמת שומן כולה-הר מאפשר כימות של imorphological שינויים בתנאים שונים ניסיוני. בפרט, רקמת שומן זה מאוד vascularized, אשר חשוב תיווכה הומאוסטזיס המטבולית על השינויים המהירים בתחום האנרגיה ברמה1. למשל, עכברים C57BL/6J עוברים 24 שעות של צום להציג גודל adipocyte קטן יותר באופן משמעותי (איור 4), המציין lipolysis, והאכילה מגמה צפיפות כלי דם גבוהות בהשוואה ללא הרף עכברים (איור 5). תוכנה ImageJ היה מנוצל כדי לכמת את הגודל של adipocytes, צפיפות כלי דם, כפי שתואר לעיל.
ניקוי רקמות היא טכניקה חדשה יחסית שפותחו כדי להסיר את opaqueness של רקמת שומן כדי לאפשר ויזואליזציה עמוק בתוך רקמת אחסון9,10 (איור 6). כולה-הר מכתים על IWAT שלא סולק באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית רק הראתה העצבוב סימפטי דליל, שכן לא ניתן היה לאבחן סיבי העצב מתחת לפני השטח של הרקמה (איור 7 א). עם זאת, יכול להיות שנצפו arborization עצבית צפופה לאחר ניקוי רקמות, immunolabeling עם השימוש iDISCO +, כמו גם את השימוש במיקרוסקופ אור גיליונות פלורסנט (LSFM), (איור 7 ב).
איור 1: השוואה של רקמת שומן מורפולוגיה עם טכניקת צביעת כולה-הר וטכניקות מורפולוגי רגיל. (א) H & E צבעונית רקמת שומן על מקטע פרפין-מוטבע (משמאל), עם ראשי חץ שחור המציין מעוותת מחוזות adipocytes. פלורסנט לקטין (פחמימות מחייב חלבון, לבן חצים) לצבוע הזרקת כתמים immunofluorescent F4/80 (סמן macrophage, ראשי חץ צהוב), דאפי גרעינים צביעה של רקמת שומן על cryosection (מימין). באמצעות כולה-הר מכתים עם שלב-בגודל של 5 μm ויזואליזציה של שומן לבן (B). העומק Z-מחסנית הכוללת בשבי הוא בסביבות 100 μm. טיפות השומנים adipocyte היו מוכתמים הכתם השומנים נייטרלי (אפור), כלי הדם, היו מוכתמים PECAM-1. התמונה צולמה עם מיקרוסקופ עם שלב-בגודל של 5 μm עבור Z-לערום (אדום). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ויזואליזציה של סיבי העצבים וכלי הדם באמצעות כולה-הר צבעונית רקמת שומן- (א) נציג תמונות מיקרוסקופיות של תוצאות בלתי רצויות כולה-הר PWAT ויטראז'ים עקב קיבוע יתר PFA במשך 3 ימים. אותות חופפים מסומנים באמצעות חץ לבן. (B) להחליפן בתמונות מיקרוסקופיים של תוצאה חיובית של כולה-הר מוכתם IWAT של שליטה בעכבר. התמונות נלקחו בשבי בהגדלה X 100. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: שושלת היוחסין מעקב באמצעות מערכת mT/mG ברקמות adipose. נציג תמונות Cre-חיוביות (מ ג) ותאים Cre-שלילי (mT) ב- IWAT של Ng2-Cre; עכבר mT/mG. התמונות נלקחו בשבי ב 200 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ויזואליזציה, כימות של גודל adipocyte. (א) תמונות נציג של adipocytes ב PWAT של הפדרציה, 24 שעות ביממה התענה C57BL/6J עכברים באמצעות השומנים נייטרלי מכתים. התמונות נלקחו בשבי ב 200 x הגדלה. Adipocyte (B) גודל השוואה בין מהבולשת, 24 שעות ביממה התענה C57BL/6J עכברים באמצעות תוכנת ImageJ. הערכים מבוטאים אומר ± SEM; 2-זנבי אינטראקצית ' של התלמיד t-מבחן; p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: ויזואליזציה, כימות של צפיפות כלי דם- (א) להחליפן בתמונות של כלי הדם בעכברים נמאס, 24 שעות ביממה התענה C57BL/6J באמצעות נוגדן PECAM-1. (B) השוואה בין צפיפות כלי דם בין האכיל וצם 24 שעות ביממה C57BL/6J עכברים באמצעות תוכנת ImageJ. הערכים מבוטאים אומר ± SEM; 2-זנבי אינטראקצית ' של התלמיד t-מבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: ניקוי של רקמת שומן באמצעות שיטת iDISCO +. לפני ניקוי, הרקמה הוא אטום. הרקמה הופך שקוף לחלוטין בסוף הרקמה ניקוי מדרגות.
איור 7: כולה-הר צבעונית IWAT לעומת IWAT רקמות-והפנים iDISCO + בשיטת. ויזואליזציה (A) של סיבים עצביים באמצעות נוגדן TH (שבערך) בכולה-הר IWAT ויטראז'ים בהגדלה 100 x עם מיקרוסקופיה קונפוקלית עם שלב-גודל של 5 μm. העומק Z-מחסנית הכוללת בשבי הוא בסביבות 100 μm. (B) ויזואליזציה של סיבים עצביים באמצעות נוגדן TH (1:200) בכולה-הר מוכתמים IWAT iDISCO + פרוטוקול ב 1.6 X הגדלה באמצעות LSFM עם שלב-בגודל של 4 μm. העומק Z-מחסנית הכוללת בשבי הוא בסביבות 8 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 1: תרשים סכמטי עבור מערכת עקיבה שושלת היוחסין mT/mG. מערכת פלורסנט כפול מעסיקה ממוקדות ממברנה eGFP ו- tdTomato, ממוקדות ממברנה. לפני Cre רקומבינציה, מתבטא באופן גלובלי mT. כאשר התא מבטא Cre, בקלטת mT הוא טוחנות ו- mG מתבטא באופן קבוע. הרשות הפלסטינית מייצג פוליאדנילציה רצפים לאחר stop codon. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 2: יישום של ImageJ תוכנה לכמת אחוזי שטח של צפיפות כלי דם. (א) "תמונה" הכרטיסייה פקודות ואפשרויות להמרת תמונה בצבע שחור-לבן הסף. (B) סיכום מידת אחוזי שטח של צפיפות כלי באמצעות הפקודה "חלקיקים לנתח". אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים איור 3: יישום של ImageJ תוכנה כדי לכמת את אזור adipocyte. לשונית "לנתח": פקודות "סולם להגדיר" ו- "מדידה" כדי למדוד את השטח של adipocyte(s). תוצאות צג מראה האזור של כל adipocyte נמדד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות טכניקות שגרתיות כגון היסטולוגיה ו- cryosection להציע יתרונות להתבוננות מבנה תאיים, כולה-הר מכתים מספק נקודת מבט שונה במחקר רקמת שומן, המאפשרת הדמיה תלת-ממדית של הסלולרי ארכיטקטורה של רקמות מינימלית מעובד.
על מנת לבצע בהצלחה את כולה-הר מכתים, ההצעות הבאות צריכה להילקח בחשבון. מחסני רקמת שומן שונות יכולות להניב תוצאות שונות immunostaining; לכן, הסוג של רקמת שומן דיפו היה צריך להיות נחוש קודם. למשל, רקמת שומן חום (בת) היא צפופה ביחס שומן לבן (וואט) עקב קטן, multilocular adipocytes21. זו צפיפות מוגברת של עטלף ומקשה על נוגדנים לחדור דרך הרקמה. בנוסף, הגודל של רקמת שומן גם הוא הכרחי עבור נוגדן המתאים מכתים, מאז רקמות גדולה/עבה מדי עלולה לגרום גם חדירה לא מספיק נוגדנים. לפיכך, בעת קבלת את רקמת שומן במהלך ניתוח בעלי חיים, בחלק הדיסטלי של רקמת השומן perigonadal אמור לשמש, שכן זה הוא האזור הדקים מאפשרים חדירה נוגדן מספקת ועל נתונים עקבי. לחלופין, בשביל לרקמות צפופה, השימוש קו העכבר כתב פלורסנט, כגון mT/mG, עשוי לאפשר כאחראית של הסמן של עניין, שכן הדבר מונע את הבעיה של מחסור נוגדן חדירה. לאחר מכן, 1% PFA משמש קיבוע הרקמה כדי לשמר את התפלגות טבעית של חלבונים ולהבטיח רקמת permeabilization, נוגדן חדירה22,23. עם זאת, קיבוע יתר יכול להקטין את זיהוי אנטיגן ומפיקים autofluorescence24. זאת בשל התגובה בין קבוצות אלדהיד כדורגלן ו מקבע המכילות אלדהיד ומרכיבים אחרים רקמות, אשר יוצר תרכובות פלורסנט24. כדי למנוע את הצורך צעד אנטיגן-אחזור, מומלץ להשאיר רקמות לשבועיים רק שעה בטמפרטורת החדר ולהתחיל את הצעדים הבאים ברגע קיבעון הוא השלים7. כמו טכניקות immunolabeling רבות אחרות, titrating את ריכוז נוגדן היא צעד חיוני לפתרון בעיות כדי להבטיח את האות הרצויה.
אכן, יש מספר מגבלות של צביעת למרות המשמעות הנ ל יתרונות כולה-הר. מכתים כל-הר כוללת דרישות מחמירות לגבי סוג הרקמה וגודל, מפני חדירה לא מספיק נוגדנים, צביעת לא אחיד יכול להתרחש ברקמות עבה יותר כגון השריר והכבד. כמו כן, כולה-הר מכתים אינה הייצוג המדויק ביותר של נוגדנים מסוימים כגון hydroxylase טירוזין (ה), סמן מערכת העצבים הסימפתטית, האות מוסווה לעתים קרובות לפי תכולת השומנים צפופה בתוך רקמת שומן (איור 7). בנוסף, השטח לא אחידה של רקמת שומן גם היוותה אתגר עבור הדמיה קונאפוקלית, מאז אותות הממוקמת שכבות שונות של רקמת שומן לא יכול להלכד בקלות על תמונה אחת. לכן, כימות של עוצמת האות בתמונות המתקבל כולה-הר מכתימים התשואה תוצאות לא עקביות עבור כל-עצב סיבים arborization. בחלק הדיסטלי של PWAT הוא בדרך כלל לפחות השומנים-צפוף; לפיכך, ניתן להשיג תמונות יותר מהאזור הזה. עם זאת, אם אזור זה הוא נציג של הרקמה כולה עבור immunostaining בכל סוגי נוגדנים ידרוש בהמשך החקירה.
על-ידי הפיכת רקמה שקופה אופטים, שיטת ניקוי מפחית פיזור אור, המאפשרת הדמיה של מבנה עמוק25. iDISCO + הוא שפרוטוקול זול פותח לאחרונה כי משלב כולה-הר immunolabeling עם אמצעי הדמיה של רקמות שנוקה גדולים שונים9. ששונה iDISCO + שיטות עם LSFM הוכח על-ידי מחקרים אחרונים9,10 נצפתה arborization דנדריטים צפופה על וואט אליו ניתן לראות עם immunolabeling המקובלת, מיקרוסקופיה קונפוקלית. הדמיה קונאפוקלית קונבנציונאלי משתמשת של מערכת קרן הדמיה, חריר סריקת לייזר. מהירות סריקה וחודר עומק הם מגבלות של המיקרוסקופ; לפיכך, דינמיקה רקמות 3D הם החמיצו לעיתים קרובות. לעומת זאת, מיקרוסקופ אור גיליונות יש יתרונות ניכר כי היא משתמשת לסריקת גיליון, רק מאירה מקטע אופטי אחד בכל פעם, לכידת כל המולקולות פלורסצנטיות בתוך המדור הזה. יתר על כן, fluorophores בסעיפים אחרים לא מתרגשים, מניעת הלבנת-צילום ואפקטים פוטוטוקסי26. לכן, כמות העצבוב העצב בתוך רקמת שומן יכול העריכו באופן מדויק יותר עם iDISCO + ו- LSFM. למרות זאת, ישנן כמה מגבלות לשימוש של iDISCO + ו- LSFM. למשל, משתמשים יש לציין כי רק ערוצים בערוץ מרחיקת אדום ואדום עולים בקנה אחד עם iDISCO +, מכיוון אורכי הגל של האור טובים מסוגלים לחדור את הדגימה27. בנוסף, autofluorescence בספקטרום כחול-ירוק הוא די גבוה דגימות רקמה גדול, אז הדמיה ב ספקטרום מרחיקת אדום ואדום תסייע בהפחתת כל autofluorescence המתרחש14. לגבי העכברים הטרנסגניים כתב פלורסנט, iDISCO + ניתן להמחיש לכתב חלבונים. עם זאת, immunolabeling של הכתב פלורסנט עם נוגדנים משניים וצריך להתנהל, כמו האות אנדוגני עשויה לדהות במהלך הרקמה ניקוי תהליך14. למרות זאת, טכניקה זו היא בעלת ערך רב מאוד עבור לימוד אינטראקציות מערכת העצבים הסימפתטית-שומן, חוקרים פלסטיות אדיפוז בתנאים פיזיולוגיים וחילוף שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי מענקים מדעי הטבע, המועצה מחקר הנדסי (NSERC) של קנדה, טייס, מענק מחקר היתכנות של בנטינג & הטוב סוכרת במרכז (BBDC), לקרן סטארט-אפ SickKids H-ק' ס', רפואי מרכז תכנית המחקר (2015R1A5A2009124) דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, תקשוב, העתיד מתכנן J-ר. ק
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
