Summary
В центре внимания настоящего исследования заключается в демонстрации целом гора иммуноокрашивания и визуализации метод как метод идеально подходит для 3D визуализация архитектуры и сотовых составляющей жировой ткани.
Abstract
Жировой ткани является важным органом метаболизма с высокой пластичностью и реагировать на экологические стимулы и питательный статус. Таким образом были разработаны различные методы для изучения морфологии и биологии жировой ткани. Однако обычные визуализации методы ограничены к изучению ткани в 2D разрезах, сумев захватить 3D архитектура весь орган. Здесь мы представляем в целом гора окрашивание, иммуногистохимия метод, который сохраняет нетронутыми жировой ткани морфология с минимальной обработки шагов. Следовательно без искажений, достижение наиболее представительных 3D визуализации тканей поддерживаются структуры адипоциты и других клеточных компонентов. Кроме того всего гора пятнать может сочетаться с линии методы трассировки для определения решения судьбы клетки. Однако этот метод имеет некоторые ограничения для предоставления точной информации в отношении более глубоких частях жировой ткани. Чтобы преодолеть это ограничение, окрашивание всей гора далее комбинируется с ткани, очистка методов для удаления непрозрачность ткани и полная визуализация анатомии всей жировой ткани с помощью флуоресцентной микроскопии свет лист. Таким образом более высокое разрешение и более точное представление о жировой ткани структуры могут быть захвачены с сочетанием этих методов.
Introduction
Жировой ткани является важным органом для хранения энергии и характеризуется динамической перепланировка и практически неограниченного расширения1. Помимо энергетического гомеостаза жировой ткани также играет важную роль в секреции гормона из более чем 50 адипокинов чтобы модулировать всего тела метаболические функции2. Жировая ткань имеет различные архитектуры, состоящий из различных типов клеток, включая пожилые адипоциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, иммунные клетки и Адипоцит прогениторных клеток3. Недавние исследования показали, что ожирение и другие метаболические дисфункции может значительно изменить функции жировой ткани и ее микроокружения, которая включает, но не ограничивается расширения адипоциты, инфильтрация воспалительных клеток (например, макрофагов) и сосудистые дисфункции3.
Обычные Морфологические методы, такие как cryosectioning и гистологии продемонстрировать некоторые ограничения в изучении жировой биология таких продолжительных химической обработки шагов, которые могут привести к ткани усадки и структура искажения3, 4. Кроме того эти 2D методы недостаточны соблюдать межклеточных взаимодействий, оказываемое различных типов клеток, так как полученные разделы ограничены для небольших участков всей ткани3. По сравнению с обычными методами флуоресцентных изображений, окрашивание всей гора не требуют дополнительных инвазивных шаги, такие как встраивание, секционирование и обезвоживания; Таким образом это позволяет избежать проблемы уменьшения специфичность антитела. Таким образом это простой и эффективный метод для визуализации жировой ткани, с лучшей сохранности Адипоцит морфологии и структуре общей жировой ткани5. Таким образом всего гора окрашивание как метод быстрый и недорогой immunolabeling был создан для сохранения жировой ткани 3D архитектура1,6,,78.
Однако несмотря на сохранение жировой ткани морфологии с использованием всего гора окрашивание, этот метод все еще не удается визуализировать внутренней структуры под поверхностью липидов в ткани. Несколько недавних исследований9,10 установили очистка методов в сочетании с целом гора immunolabeling1,6 для всеобъемлющей 3D визуализации в жировой ткани. В частности плотной сети нервных и сосудистую были подробно освещены в последние исследования9,10,11,12 с визуализации 3D-объем. Действительно изучая пластичности нервной и сосудистой жировой ткани в различных физиологических условиях имеет важное значение для изучения его биологии. Immunolabeling с поддержкой трехмерных изображений очистки ткани растворителя очищены органов (iDISCO +) представляет собой процесс состоит из метанола предварительной обработки, immunolabeling и очистка непрозрачность ткани с органические химические реагенты Дихлорметан (DCM ) и dibenzyl эфира (DBE)13,14. Делая жировой ткани полностью прозрачным,9,10можно получить более точное представление об анатомии в ткани, такие как кровеносных сосудов и нервных волокон. IDISCO + имеет преимущества в том, что он совместим с различными антител и флуоресцентные журналистам11,14, и он продемонстрировал успех в различных органах и даже embryoes14. Однако его основным ограничением является длительный инкубационный время, в котором 18-20 дней, необходимых для завершения всего эксперимента.
Другое важное применение всего гора окрашивания является визуализация судьбы клеток в сочетании с системой трассировки линии. Родословная трассировки является маркировка конкретных генов/маркера в ячейке, может быть передан все клетки дочи и сохраняется в течение времени15. Таким образом он является мощным инструментом, который может использоваться для определения судьбы клетки потомства15. Начиная с 90-х годов, КРР-LoxP Рекомбинатные системы стало мощный подход для трассировки линии в живых организмов15. Когда мышь линию, которая выражает Cre, рекомбиназа фермента ДНК, пересекается с другой мыши линии, выражая репортером, которая примыкает к loxP стоп loxP последовательность, репортер белок является выраженным15.
Для окрашивания целом гора, использование флуоресцентных многоцветной Репортеры подходит для изображений из жировой ткани, потому что она позволяет для минимального вмешательства с внутриклеточной деятельности Адипоцит16. Однако традиционные репортерам обычно пятно цитоплазме, что делает его трудно проследить родословную белых адипоциты, которые имеют ограниченный цитоплазматических содержание17. Для преодоления этой проблемы, использование мембранных привязкой флуоресцентный tdTomato/мембраны eGFP (mT/мг) репортер маркер является идеальным инструментом. Ориентированные на мембране tdTomato выражается в Cre отрицательные клетки18. После иссечения Cre происходит переключение на выражение мембраны целевой eGFP, что делает этот репортер подходит для отслеживания lineage Адипоцит прародителями17,18 (Дополнительный рис . 1).
Цель этого документа должна предоставить подробный протокол для окрашивания целом гора и показать, каким образом оно может сочетаться с другими методами для изучения развития и физиологии жировой ткани. Двумя примерами приложений, описанных в настоящем Протоколе являются его использования с 1) многоцветная репортер мыши линий для выявления различного происхождения адипоциты и 2) ткани, очистка далее визуализировать нейронные арборизация в белой жировой ткани (Ват).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальных животных протоколы были утверждены Комитетом животное уход центр для Phenogenomics (TCP), соответствует стандартам Канадского совета по лечению животных. Мыши были на 12-h свет/темно циклов и обеспечен свободный доступ к воде и пище. 7 месяцев старых самцов мышей C57BL/6J были использованы в целом гора окрашивание эксперимент.
Примечание: Разделы 1-2 находятся в хронологическом порядке, с разделом 3 является необязательный шаг сразу после раздела 1. Раздел 4 может выполняться для анализа плотности Адипоцит размер и кровеносных сосудов после завершения раздела 2.
1. Подготовка материалов и тканей изоляции
- Подготовьте свежие 1% параформальдегида (PFA) разводят в 1 x фосфатный буфер (PBS) для фиксации ткани. Подготовить 0,3% Неионогенное ПАВ, разбавленных в однократном ПБС (далее именуемые как PBS-0.3T) для последующего мытья шаги ткани.
Примечание: Для каждой ткани, подготовить примерно 1,5 мл 1% PFA для обеспечения полного погружения. Фиксация объема может быть увеличивается или уменьшается в зависимости от размера ткани.
Предупреждение: Этот шаг является опасной, как PFA коррозионные и токсичных. Износ личного защитного оборудования (например, перчатки нитриловые, лаборатории пальто, обувь, очки) и ручкой в зонта. - Усыпить животных согласно утвержденной процедуре (например, вывих шейного или удушья двуокиси углерода). Без промедления вскрыть желаемого жировой ткани депо (например, паховые белой жировой ткани или perigonadal белой жировой ткани)18.
- Рассечение ножницами, нарезать кусочки примерно 0,5 – 1 см размер ткани на 100 x 15 мм2 Петри и погрузить их в microcentrifuge трубы заполнены с 1% PFA. Держите на льду.
2. всего гора пятнать белой жировой ткани
- После завершения рассечение переместить образцы тканей в 1% PFA от льда комнатной температуре (RT) за 1 ч, а затем перевести тканей к пластине культуры клеток 12 - или 24-также для мытья быстрее.
- Вымойте тканей с PBS-0.3T, 3 раза по 5 минут каждый в РТ на шейкер наклонена на 22 °, с 20 – 25 наклоняется в минуту как скорость.
Примечание: Используйте этот наклон и скорость для всех последующих шагов, связанных с использованием шейкер.
Примечание: При использовании мыши линии многоцветной репортер как mT/мг и дополнительные Пятнать антитела не требуется, ткани готова для микроскопии после шага 2.2. - Добавить 0,5 – 1 мл блокирующий буфер (5% животных сыворотку разводят в PBS-0.3T). Положите пластину на шейкер и инкубировать 1 час в рт.
- Аспирационная блокировки решение и добавить первичных антител, разбавленных в PBS-0.3T с 1% животных сыворотки.
- Место пластину на шейкер на 4 ° C на ночь.
- Следующий день, стирать ткани с PBS-0.3T 3 раза по 5 минут каждый в рт.
- Использовать соответствующие вторичные антитела, разбавленных в PBS-0.3T. Добавить 0,5 – 1 мл вторичное антитело решения для каждой скважины. Оберните пластину в алюминиевой фольги и инкубировать на шейкер за 1 час на RT.
Примечание: Разбавленных вторичных антител в темноте, чтобы предотвратить Фотообесцвечивание. - После вторичное антитело инкубации, мыть с PBS-0.3T дважды за 5 мин, каждый в RT. изображения образцов Если пятно липидный нейтральными нежелательно. Если визуализация липидного капель необходимо с помощью нейтральных липидные пятна, мыть с ПБС (без неионных ПАВ) дважды, за 5 мин.
- После стирки шагов инкубации с нейтральной липидов пятно, разбавляют коэффициент разбавления 1: 1500 в PBS 1 x 30 мин в рт. Тканях теперь готовы для микроскопии. Для будущих изображений, тканях может храниться в этом растворе в 4 ° C.
Примечание: Качественное изображение уменьшается с течением времени; Следовательно лучшее время для изображений — в течение 1 или 2 дней. - С помощью щипцов, заложить плашмя на 24 x 60 мм² стекла coverslip ткани и поместите его на системе Перевернутый конфокальный лазерный микроскоп.
- По желанию окрашивания ядер с DAPI, добавьте 1-2 капли средства монтажа, содержащие DAPI полностью погрузиться ткань и предотвратить его от высыхания.
- Для получения изображения всего гора окрашенных тканей на нескольких фокальной плоскости, выполняют Z-штабеля 100-150 мкм в глубину с 4 – 6 мкм-размер шага на желаемый масштаб.
3. ткань клиринга и Immunolabeling с помощью iDISCO +
Примечание: Этот протокол основан на ранее опубликованных процедур9,10,19.
- Фиксация и метанола предварительной обработки
- Инкубируйте ткани в 4%, что ПФА разводят в 1 x PBS на 4 ° C на ночь в 2 мл microcentrifuge трубы.
Примечание: Оставьте ткани в 2 мл трубки для всех следующих процедур до изображений. - Следующий день, стирать ткани в однократном ПБС три раза, за 1 час на шейкер на RT.
Примечание: Этот шаг может быть точкой приостановка оставить образец ночь в РТ или 4 ° C. - Впоследствии, обезвоживания тканей в РТ в 20%, 40%, 60% и 80% метанола, за 1 ч. Обезвоживает в 100% метанола в РТ за 1 час, затем передать свежие 100% метанола тканей и инкубировать в отеле 4 C 1 h.
Примечание: Разбавляют метанола в дистиллированной воде. Во время инкубации метанола нет необходимости поставить образцы на шейкер, до тех пор, как образцы тканей погружены.
Предупреждение: Этот шаг является опасной, как метанол является токсичным. Это очень горюч после открытого пламени. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта. Храните метанола от зажигания и легковоспламеняющиеся безопасности кабинета. - Отбеливание тканей с 5% пероксида водорода (H2O2; 1 объем 30% H2O2 разводят в 5 томах 100% метанола) на ночь при 4 ° C.
Предупреждение: 30% перекись водорода является весьма опасные на кожу и в глаза. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта. - Впоследствии, увлажняет тканей в РТ в 80%, 60%, 40% и 20% метанола и ПБС, за 1 час.
- Вымойте с 0,2% Неионогенное ПАВ, разводят в 1 x PBS дважды, за 1 ч на шейкер на RT.
- Инкубируйте ткани в 4%, что ПФА разводят в 1 x PBS на 4 ° C на ночь в 2 мл microcentrifuge трубы.
- Immunolabeling
Примечание: Заполните вверх 2 мл пробирки, содержащие ткани в верхней части трубки с решения, используемые в каждом шаге для предотвращения окисления тканей, как только начинается immunolabeling, до завершения очистки.- Разрушения тканей путем инкубации их в раствор ПБС, неионогенные ПАВ 0,2%, 20% диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,3 М глицин при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер на 2 дня.
Примечание: Максимальный инкубационный время 37 ° C permeabilization шаг-2 дня. - Блокировать тканей в растворе 1 x PBS, неионогенные ПАВ 0,2%, 10% ДМСО, осел 5% сыворотки и блок ФК 1% при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер на 2 дня.
Примечание: Максимальный инкубационный время блокировки шаг-2 дня. - Инкубировать ткани в первичных антител интерес в раствор ПБС, 0,2% Полисорбат 20, 10 мкг/мл гепарина, 5% ДМСО и 5% осла сыворотки при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер для 4 дней.
- Вымойте с 1 x PBS, 0,2% Полисорбат 20 и 10 мкг/мл гепарина на шейкер на RT пять раз, каждый 1 час.
Примечание: Этот шаг может быть точкой паузы на ночь оставить образцы в рт. - Инкубировать тканей с вторичное антитело в раствор ПБС, 0,2% Полисорбат 20, 10 мкг/мл гепарина и 5% осла сыворотки при 37 ° C на настольные орбитальный шейкер для 4 дней.
Примечание: От шага 3.2.5, все образцы должны быть обернуты алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить Фотообесцвечивание вторичное антитело. - Вымойте тканей в растворе 1 x PBS, 0,2% Полисорбат 20 и 10 мкг/мл гепарина на шейкер в РТ пять раз, за 2 ч.
Примечание: Этот шаг может быть приостановка точку на ночь оставить образцы на RT.
- Разрушения тканей путем инкубации их в раствор ПБС, неионогенные ПАВ 0,2%, 20% диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,3 М глицин при 37 ° C на инкубирован настольная орбитальный шейкер на 2 дня.
- Ткани, очистка белой жировой ткани и объема изображения
- Обезвоживания тканей, содержащиеся в 2 мл пробирок инкубации в 20%, 40%, 60% и 80% метанола, впоследствии, каждый 1 час на RT. Затем обезвоживает образцы в 100% метанола дважды на RT.
Примечание: Этот шаг может быть точкой приостановка оставить ваши образцы в 100% метанола на ночь на RT. - Инкубируйте тканей смесью 2 тома 1 объем метанола для 3 h на RT на шейкер ДКМ.
Примечание: Система DCM является неустойчивым. Убедитесь, что трубки плотно закрытыми для предотвращения испарения.
Предупреждение: Этот шаг является опасной. ДКМ токсичен при вдыхании. Длительное воздействие может вызвать химические ожоги. Носите средства индивидуальной защиты (например, перчатки нитриловые, лаборатории пальто, обувь, защитные очки). Использование вытяжного шкафа. - Инкубировать ткани 100% DCM дважды, за 15 мин на шейкер на RT.
- Инкубировать в 100% DBE в РТ до визуализации и хранения проб. До обработки изображений, Инвертируйте трубы несколько раз перемешать решения.
Примечание: Полностью заполните трубы с DBE для предотвращения окисления, которое может привести к неудачной очистки ткани. Не трясите трубы во время инкубации DBE.
Предупреждение: Этот шаг является опасной. DBE является токсичным. Это может вызвать раздражение глаз и кожи. Носить средства индивидуальной защиты (например, нитриловые перчатки, лабораторный халат, защитные очки) и обрабатывать в зонта. - Изображения образца всей ткани с световой микроскоп, который соответствует преломления органических растворителей DBE. Выполните Z-укладки на желаемый масштаб и размер шага для всей ткани.
- Обезвоживания тканей, содержащиеся в 2 мл пробирок инкубации в 20%, 40%, 60% и 80% метанола, впоследствии, каждый 1 час на RT. Затем обезвоживает образцы в 100% метанола дважды на RT.
4. примеры анализа данных из состава Гора окрашенные ткани изображения с помощью ImageJ
Примечание: Смотрите https://imageJ.nih.gov/ij/download.html для загрузки и инструкции по установке.
- Количественная оценка плотности кровеносных сосудов ( Рисунок 2дополнительных )
- Импортируйте сохраненные изображения только канал с иммуноокрашивания кровеносных сосудов на ImageJ.
Примечание: Изображения для количественной оценки должны согласовываться с точки зрения пятная процедуру и условия приобретения изображений. Должны использоваться идентичные реагентов. Время экспозиции, интенсивности и увеличение также должны быть эквивалентными в визуализации процесса20. - Преобразуйте цвета изображения в черно-белой для количественного определения плотности кровеносного сосуда. Для этого на вкладке «Изображение» выберите команду «Настройка» , затем параметр «порог цвета» . В «порог цвета» окно, выберите «Темный фон»20 и «B & W» под «порог цвета».
- Чтобы измерить процент области кровеносный сосуд сигнала фоне, выберите вкладку «Анализировать» , затем команду «анализ частиц» . В разделе Отображение «анализ частиц»выберите параметры «Очистить результаты» и «Суммировать» . Нажмите кнопку «ОК».
- Скопируйте и вставьте значение области процент на вкладке резюме в электронную таблицу для анализа. Процент от области будет указывать плотность кровеносного сосуда. Повторите шаги 4.3.1–4.3.4 для каждого индивидуального образа.
- Импортируйте сохраненные изображения только канал с иммуноокрашивания кровеносных сосудов на ImageJ.
- Количественная оценка Адипоцит размер21 ( рис. 3дополнительных )
- Импортируйте сохраненные изображения адипоцитов на ImageJ.
- Чтобы задать масштаб изображения, Измерьте длину шкалы в пикселях трассировки линии к шкале с известным расстоянием на изображении с помощью инструмента выделения прямой линии. На вкладке «Анализировать» выберите команду «Задать шкалу» . Расстояние от линии, которая была прослежена до будет автоматически рассчитывается в пикселях.
- Появится поле «Задать шкалу» . Введите известные расстояние и единицы длины. Выберите «Глобальные» применять шкалу для всех импортированных изображений и нажмите кнопку «ОК».
- Чтобы выбрать область как метод измерения, во вкладке «Анализировать» выберите команду «задать измерения» . Появится список различных вариантов для измерений. Выберите параметр «Область» и нажмите «OK».
- Используя инструмент выделения произвольной, проследить по периметру каждого Адипоцит интерес. На вкладке «Анализировать» выберите команду «Мера (Ctrl + M)» , и появится область Адипоцит. Повторите эту процедуру для других адипоцитов в изображении.
Примечание: Для обеспечения точных измерений, используйте несколько изображений для количественной оценки. - Скопируйте и вставьте область измерений в электронную таблицу для дальнейшего анализа данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Из-за хрупкости жировой ткани методы с участием нескольких шагов обработки и секционирование может привести к disfigurement жировой ткани морфология3 (рис. 1A). Однако всего гора пятнать может сохранить морфология адипоциты, обеспечение точной интерпретации результатов (рис. 1B).
Чрезмерной фиксации жировой ткани приводит к фиксатором индуцированной аутофлюоресценция. Как показано на рисунке 2А, красный и зеленый каналы, окрашивание тирозин гидроксилазы (TH) и сигналы PECAM-1, соответственно, пересекаются в идентичных регионах ткани, означающее что аутофлюоресценция возможно, произошло из-за чрезмерной фиксации в PFA для 3 дней. В отличие от этого, Рисунок 2B показывает образ представителя всего гора окрашивания при правильной фиксации выполняется, как сигнал для TH окрашивание происходит в различных областях по отношению к PECAM-1 сигнал, демонстрируя, что этот сигнал не является аутофлюоресценция и на самом деле является позитивным сигналом.
Целом гора окрашивание является важным визуализации инструментом для трассировки на основе Cre-loxP линии адипоцитов15, с mT/мг, будучи идеальным репортер системы18. Ng2, маркер для Адипоцит прогениторных клеток населения, является протеогликана плазматической мембраны. В этой системе Cre-Ng2-положительных клеток Экспресс м-GFP, тогда как m томатный выражается в Ng2-Cre отрицательные клетки (рис. 3).
Жировой ткани является невероятно динамичный орган, способный расширение и сжатие под различные физиологические условия и требования20. Imaging состава Гора окрашенных жировой ткани позволяет для количественной оценки изменений imorphological в различных экспериментальных условиях. В частности жировой ткани, высоко васкуляризированной, который имеет важное значение в посредничестве метаболических гомеостаза на быстрые изменения в энергетическом уровне1. К примеру мышей C57BL/6J, которые проходят 24 h поста отображения значительно меньший размер Адипоцит (рис. 4), указывающее липолиз, и тенденция в повышенных кровеносный сосуд плотности по сравнению с постоянно кормили мышей (рис. 5). ImageJ программного обеспечения был использован для количественного определения размера адипоциты и плотностью кровеносных сосудов, как описано выше.
Очистка ткани-это относительно новая методика, разработанная для удаления непрозрачность жировой ткани, чтобы позволить визуализации глубоко в ткани объем9,10 (рис. 6). Целом гора окрашивания на необезвреженных IWAT с помощью конфокальной микроскопии показали только разреженным симпатической иннервации, так как волокна нерва под поверхности ткани не могут быть визуализированы (рис. 7A). Однако плотной нейронные арборизация можно было наблюдать после очистки ткани и immunolabeling с использованием iDISCO +, а также использование света лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) (рис. 7B).
Рисунок 1: сравнение морфологии жировой ткани с обычными морфологических методов и целом гора окрашивание технику. Витражи (.A) H & E жировой ткани на парафин врезанных секции (слева), с черной стрелки, указанием искаженные регионов адипоцитов. Лектин (углеводов связывания белка, белые стрелки) Люминесцентная краска инъекции, immunofluorescent окрашивание F4/80 (маркер макрофагов, Желтые стрелки) и DAPI ядер пятнать жировой ткани на cryosection (справа). (B) белой жировой ткани Визуализация с использованием всего гора окрашивание с размером шаг 5 мкм. Общая глубина Z-стека захватили составляет около 100 мкм. Адипоцит липидного капель окрашивали нейтральных липидные пятна (серый), и кровеносных сосудов окрашивали PECAM-1. Образ был захвачен с помощью микроскопии с размером шаг 5 мкм для Z-штабелеры (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Визуализация нервных волокон и кровеносных сосудов, используя целое гора окрашенных жировой. (A) представитель микроскопических изображений нежелательных результатов от окрашенных PWAT целом горе из-за чрезмерной фиксации в PFA для 3 дней. Перекрывающиеся сигналы обозначаются белые стрелки. (B) представитель микроскопических изображений положительный результат от всего гора витражи IWAT от управления мышью. Изображения были захвачены на 100 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Lineage трассировки с помощью системы mT/мг в жировой ткани. Представитель фото Cre позитивные (мг) и Cre отрицательной (mT) клетки в IWAT Ng2-Cre; mT/мг мышь. Изображения были захвачены на 200 крат. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Визуализация и количественная оценка размера Адипоцит. (A) представитель образы адипоцитов в PWAT кормили и 24-часовой постились мышей C57BL/6J, с использованием нейтральных липидов пятнать. Изображения были захвачены на 200 крат. Адипоцит (B) размер сравнение между ФРС и 24-h постились мышей C57BL/6J использованием ImageJ программного обеспечения. Значения выражаются как означает ± SEM; 2-хвост непарные студента t-теста; p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Визуализация и количественная оценка плотности кровеносный сосуд. (A) представитель изображения кровеносных сосудов в ФРС и 24-часовой постились мышей C57BL/6J с использованием антител PECAM-1. (B) сравнение кровеносный сосуд плотности между кормили и 24-часовой постились мышей C57BL/6J использованием ImageJ программного обеспечения. Значения выражаются как означает ± SEM; 2-хвост непарные студента t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Очистка жировой ткани с помощью метода iDISCO +. До очистки, ткани непрозрачные. Ткань становится полностью прозрачным, в конце ткани, очистка шаги.
Рисунок 7: Целом гора окрашенных по сравнению с IWAT ткани очищается с помощью метода iDISCO + IWAT. (A) визуализация нервных волокон, использовать TH антитела (1: 500) в целом гора окрашенных IWAT на 100 крат с конфокальная микроскопия с размером шаг 5 мкм. Общая глубина Z-стека в плен — около 100 мкм. (B) визуализации нервных волокон, использовать TH антитела (1: 200) в целом гора окрашенных IWAT с iDISCO + протокол на 1.6 X увеличение с помощью LSFM с размером шаг 4 мкм. Общая глубина Z-стека захватил это около 8 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 1: схема системы трассировки линии mT/мг. Двойной флуоресцентные система, которая использует eGFP, ориентированные на мембраны и мембраны целевой tdTomato. До Cre рекомбинации mT глобально выражается. Когда ячейка выражает Cre, вырезан mT кассету, и мг выражается навсегда. ПА представляет сплайсингу последовательности после стоп-кодон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный рисунок 2: применение ImageJ программное обеспечение для количественного определения области процент кровеносный сосуд плотности. (A) «Образ» вкладку команды и параметры для преобразования изображения в черно-белом порог цвета. (B) резюме измерение процент площади судна плотности, используя команду «Анализ частиц». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительная цифра 3: применение ImageJ программное обеспечение для количественного определения области Адипоцит. Вкладка «Анализировать»: «Задайте шкала» и «Измерение» команды, чтобы измерить площадь adipocyte(s). Отображение результатов показывает область каждого Адипоцит измеряется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя обычные методы, такие как cryosection и гистологии предлагают преимущества для наблюдения за внутриклеточные структуры, окрашивание всей гора предоставляет различные перспективы в исследованиях жировой ткани, что позволяет 3D визуализация сотовой связи Архитектура минимально обработанные ткани.
Для того, чтобы успешно выполнить всего гора окрашивание, следует учитывать следующие рекомендации. Различные жировой ткани складов может принести различные иммуноокрашивания результаты; Таким образом следует сначала определить тип жировой ткани депо используется. Например по отношению к белой жировой ткани (Ват) из-за меньших, многокамерный адипоцитов21плотнее коричневая жировая ткань (BAT). Это увеличение плотности BAT делает его трудным для антитела проникают через ткани. Кроме того размер жировой ткани необходимо также для надлежащего антитело пятная, так как слишком большой/толстых тканей также может привести к недостаточной антитела проникновения. Таким образом при получении жировой ткани во время животных рассечение, Дистальная часть жировой ткани perigonadal должны использоваться, поскольку это тонкий региона и может позволить достаточных проникновения антитела и последовательных данных. Кроме того для более плотной ткани, использование флуоресцентных репортер мыши линии, такие как mT/мг, может позволить для лучшей визуализации маркера интерес, поскольку это позволяет избежать проблемы недостаточной антитела проникновения. Впоследствии, 1% ПФА используется для фиксации ткани для сохранения естественное распределение белков и обеспечения тканей permeabilization и антитела проникновения22,23. Однако, чрезмерной фиксации может уменьшить антигены и производят аутофлюоресценция24. Это происходит благодаря реакции между альдегидными группами по PFA и другие альдегид содержащих фиксатором и компоненты тканей, который создает24Флюоресцентная соединений. Чтобы избежать необходимости антиген извлечения шага, рекомендуется оставить тканей в фиксатор только на час при комнатной температуре и начать следующие шаги, как только фиксация завершено7. Как и многие другие методы immunolabeling титрования концентрации антитела является важным шагом устранения неполадок для обеспечения желаемого сигнала.
Действительно существует несколько ограничений всего-Маунт пятнать несмотря на вышеупомянутые значение и преимущества. Целом гора окрашивание имеет строгие требования в отношении ткани типа и размера, потому что недостаточно антитела проникновения и неравномерным пятнать может произойти в толще ткани, такие как мышц и печени. Кроме того всего гора окрашивание не является наиболее точное представление о некоторых антител например тирозин гидроксилазы (TH), маркер для симпатической нервной системы, как его сигнал часто маскируются содержание плотной липидов в жировых тканях (рис. 7). Кроме того неровную поверхность жировой ткани также создает проблему для конфокальный изображений, так как сигналы, расположенный в различные слои жировой ткани нельзя легко захватили на одно изображение. Таким образом количественная оценка интенсивности сигнала на изображениях, полученных от всего гора окрашивание доходность противоречивые результаты для арборизация целом нервных волокон. Дистальная часть PWAT, обычно наименее липидов плотные; Следовательно лучше изображения могут быть получены из этой области. Однако ли эта область является представителем всей ткани для иммуноокрашивания во всех типах антитела потребует дальнейшего расследования.
Делая ткани оптически прозрачным, метод очистки уменьшает рассеивание света, позволяя визуализации глубинная структура25. iDISCO + является недорогой протокол недавно разработали что сочетает целом гора immunolabeling с тома изображений различных крупных очищенных тканей9. Изменение iDISCO + методы с свидетельствуют недавние исследования9,10 LSFM наблюдается плотная дендритных арборизация на Ват, который нельзя увидеть с обычными immunolabeling и confocal микроскопии. Обычные конфокальная томография использует тепловизионные системы ШГН и отверстие для лазерного сканирования. Скорость сканирования и проникающего глубина являются ограничения микроскопа; Таким образом динамика 3D ткани часто упускаются из виду. В противоположность этому свет лист микроскопии имеет явного преимущества в том, что он использует сканирование листа и только освещает один оптический секции одновременно, захватив все молекулы флуоресценции в рамках этого раздела. Кроме того флуорофоров в других разделах не взволнован, предотвращая эффекты фото отбеливания и фототоксических26. Таким образом можно более точно оценить количество нервных иннервации в жировой ткани с iDISCO + и LSFM. Несмотря на это существуют некоторые ограничения на использование iDISCO + и LSFM. Например пользователям следует отметить, что только каналы в канале красного и far-red совместимы с iDISCO +, потому что больше длин волн света лучше способны проникать образца27. Кроме того аутофлюоресценция в спектре сине зеленый является довольно высоким в образцах тканей большой, поэтому изображения в красный и far-red спектры поможет уменьшить любые аутофлюоресценция, которое происходит14. Отношении трансгенной флуоресцентные репортер мышей iDISCO + может использоваться для визуализации репортер белков. Однако должны проводиться immunolabeling флуоресцентные репортера с вторичное антитело, как эндогенных сигнал может исчезать в ткани, очистка процесса14. Тем не менее этот метод является чрезвычайно ценным для изучения взаимодействия симпатической нервной системы жировой ткани, а также для изучения жировой пластичности при различных физиологических и метаболических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет грантов от естественных наук и инженерных исследований Совета (СЕНТИ) Канада, пилот и осуществимости исследования Грант Бантинг и лучший диабет центр (BBDC), Фонда SickKids Start-up H-K. S., медицинский исследовательский центр программы (2015R1A5A2009124) через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования для J-р.к.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
