Summary
L’objectif de la présente étude est de montrer la technique d’immunohistochimie et visualisation entier-montent comme une méthode idéale pour l’imagerie 3D du composant d’architecture et cellulaires du tissu adipeux.
Abstract
Le tissu adipeux est un organe métabolique avec grande plasticité et est sensible aux stimuli de l’environnement et l’état nutritionnel. Par conséquent, différentes techniques ont été développées pour étudier la morphologie et la biologie du tissu adipeux. Cependant, les méthodes de visualisation conventionnels sont limitées à l’étude du tissu dans des sections 2D, de la capture de l’architecture 3D de la totalité de l’organe. Nous présentons ensemble monture coloration, une méthode immunohistochimique qui conserve intact le tissu adipeux morphologie avec des étapes de traitement minimal. Par conséquent, les structures des adipocytes et autres constituants cellulaires sont maintenues sans distorsion, atteindre la visualisation 3D plus représentative du tissu. En outre, entier-Montez la souillure est cumulable avec les méthodes de traçage de lignée afin de déterminer les décisions de destin cellulaire. Cependant, cette technique a quelques limitations à fournir des renseignements exacts au sujet des parties plus profondes du tissu adipeux. Pour contourner cette limitation, entier-Montez la souillure peut être combinée avec des tissus techniques pour supprimer l’opacité des tissus et permettre une visualisation complète d’anatomie de tout le tissu adipeux en microscopie fluorescente lumière-feuille de compensation. Par conséquent, une résolution plus élevée et la plus fidèle des structures de tissu adipeux peuvent être capturés avec la combinaison de ces techniques.
Introduction
Le tissu adipeux est un organe essentiel pour le stockage de l’énergie et se caractérise par la dynamique de rénovation et expansion presque illimitée1. En plus de l’homéostasie énergétique, tissu adipeux joue également un rôle essentiel dans la sécrétion de l’hormone de plus de 50 adipokines pour moduler la fonction métabolique corps entier2. Le tissu adipeux a une architecture diversifiée composée de divers types de cellules, y compris les adipocytes matures, fibroblastes, cellules endothéliales, les cellules immunitaires et de cellules progéniteurs adipocytaires3. Des études récentes ont montré que l’obésité et autres dysfonctions métaboliques peuvent modifier considérablement fonction du tissu adipeux et son microenvironnement, qui inclut, mais n’est pas limité à l’élargissement des adipocytes, infiltration de cellules inflammatoires (par exemple, macrophages) et la dysfonction vasculaire3.
Techniques morphologiques classiques comme l’histologie et cryosectioning démontrent plusieurs limitations dans l’étude de la biologie adipeuse comme étapes longues de traitement chimique, qui peut conduire au tissu structure et rétrécissement distorsion3, 4. En outre, ces techniques 2D ne suffisent pas à observer les interactions intercellulaires exercées par différents types de cellules, comme les sections obtenues sont limitées à des régions plus petites du tissu entier3. Par rapport aux classiques des méthodes d’imagerie fluorescente, entier-Montez la souillure n’exige pas des étapes supplémentaires d’envahissantes, telles que l’incorporation, le sectionnement et la déshydratation ; ainsi, cela évite le problème de diminuer la spécificité de l’anticorps. Par conséquent, c’est une méthode simple et efficace pour l’imagerie du tissu adipeux, avec une meilleure conservation de la morphologie de l’adipocyte et globale du tissu adipeux structure5. Par conséquent, entier-Montez souillure comme une technique rapide et peu coûteux immunomarquage a été créée pour préserver le tissu adipeux architecture 3D1,6,7,8.
Cependant, malgré la conservation de la morphologie du tissu adipeux avec utilisation d’entier-Montez la souillure, cette technique est toujours pas en mesure de visualiser les structures intérieures sous la surface des lipides du tissu. Plusieurs récentes études9,10 ont mis en place les tissus techniques combinées avec ensemble monture immunomarquage1,6 , permettant la visualisation 3D complète dans le tissu adipeux de compensation. En particulier, denses réseaux neurones et système vasculaire ont été visualisées dans les récentes études9,10,11,12 avec l’imagerie 3D volume. En effet, il est essentiel d’étudier la biologie d’étudier la plasticité neuronale et vasculaire du tissu adipeux dans différentes conditions physiologiques. Imagerie en trois dimensions compatibles immunomarquage de compensation des tissus organes cote de solvant (iDISCO +) est un processus composé de prétraitement de méthanol, immunomarquage et dégagement d’opacité des tissus avec des réactifs chimiques organiques dichlorométhane (DCM ) et de dibenzyle éther (DBE)13,14. En rendant le tissu adipeux entièrement transparente, une représentation plus précise de l’anatomie dans les tissus tels que les vaisseaux sanguins et fibres neurales peut être obtenue à9,10. IDISCO + a des avantages car il est compatible avec divers anticorps et reporters fluorescent11,14, et il a démontré le succès dans plusieurs organes et même embryonnés14. Cependant, sa principale limitation est un temps d’incubation longue, dont 18 à 20 jours sont nécessaires pour compléter l’expérience entière.
Une autre application importante d’entier-Montez la souillure est la visualisation du sort de la cellule en combinaison avec un système de traçage de lignage. Suivi de lignée est l’étiquetage d’un gène spécifique/marqueur dans une cellule qui peut être transmis à toutes les cellules de fille et est conservée au fil du temps15. Par conséquent, il est un outil puissant qui peut être utilisé pour déterminer le sort de progéniture15 une cellule. Depuis les années 1990, le système de recombinaison Cre-LoxP est devenu une approche puissante pour le traçage de la lignée dans la vie des organismes15. Quand une lignée de souris qui exprime la Cre, une enzyme de recombinase ADN, est croisée avec une autre lignée de souris exprimant un journaliste qui est adjacent à une séquence de STOP-loxP-loxP, la protéine de journaliste est exprimée15.
Entier-Montez la souillure, l’utilisation de reporters multicolores fluorescents est adaptée pour l’imagerie du tissu adipeux, parce qu’il permet une interférence minimale avec activités intracellulaires de l' adipocyte16. Cependant, les journalistes traditionnels tachent généralement le cytoplasme, rendant difficile de remonter la lignée des adipocytes blancs, qui ont peu de contenu cytoplasmique17. Pour contourner ce problème, l’utilisation du marqueur de journaliste membranaires fluorescents tdTomato/membrane eGFP (mT/mG) est un outil idéal. Axés sur la membrane tdTomato est exprimée en Cre-négatif cellules18. À l’excision, le Cre un interrupteur pour l’expression de membrane ciblées eGFP survient, ce qui rend ce journaliste appropriés pour le suivi de la lignée des adipocytes progéniteurs17,18 (Complémentaire de la Figure 1).
Le but de cet article est de fournir un protocole détaillé pour entier-Montez la souillure et de montrer comment elle peut être combinée avec d’autres techniques pour étudier le développement et la physiologie du tissu adipeux. Son utilisation avec des lignées de souris journaliste 1) multicolore pour identifier les origines diverses des adipocytes et 2) tissus de compensation pour visualiser davantage l’arborisation neurale dans le tissu adipeux blanc (WAT) en sont deux exemples d’applications décrites dans le présent protocole.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tous les protocoles animaux expérimentaux ont été approuvées par le Comité de protection des animaux du Centre pour Phenogenomics (TCP) sont conformes aux normes du Conseil canadien de protection des animaux. Souris ont été maintenus sur les cycles de lumière/obscurité de 12 h et fournis avec libre accès à l’eau et de nourriture. expérience de 7 mois vieux C57BL/6J souris mâles ont été utilisés dans l’entier-Montez la souillure.
Remarque : Les Sections 1 à 2 sont dans l’ordre chronologique, à l’article 3 est une étape facultative dès l’article 1. L’article 4 peut être effectuée pour analyser la densité de taille et des vaisseaux sanguins des adipocytes à l’issue de l’article 2.
1. préparation matériaux et tissus Isolation
- Préparer les frais paraformaldéhyde à 1 % (PFA) dilué dans 1 x tamponné phosphate salin (PBS) pour la fixation du tissu. Préparer les 0,3 % tensioactif nonionique dilué dans du PBS 1 x (ci-après dénommé PBS-0.3T) pour tissus ultérieures étapes de lavage.
Remarque : Pour chacun des tissus, préparer environ 1,5 mL de 1 % PFA afin d’assurer une immersion complète. Volume de fixation peut être augmenté ou diminué selon la taille du tissu.
ATTENTION : Cette étape est dangereuse, comme PFA est corrosif et toxique. Porter un équipement protecteur personnel (p. ex., des gants en nitrile, blouse, chaussures, lunettes de protection) et la poignée sous une hotte. - Euthanasier les animaux selon une méthode approuvée (p. ex., dislocation cervicale ou asphyxie de dioxyde de carbone). Sans tarder, disséquer la désirée du tissu adipeux dépôts (par exemple, le tissu adipeux blanc inguinal ou le tissu adipeux blanc perigonadal)18.
- Avec des ciseaux de dissection, découper le tissu, un 100 x 15 mm2 boîte de Pétri en morceaux environ 0,5 à 1 cm de taille et immerge-les dans des tubes de microcentrifuge remplis 1 % PFA. Rester sur la glace.
2. entier-Montez la souillure du tissu adipeux blanc
- Après dissection est terminée, déplacez les échantillons de tissus chez 1 % PFA de la glace à la température (RT) pendant 1 h de la salle et ensuite transférer les tissus à une plaque de culture de cellules de 12 ou 24 puits pour un lavage plus rapide.
- Laver les tissus avec du PBS-0.3T, 3 fois pendant 5 min chacun dans RT sur un agitateur incliné à 22 °, avec des inclinaisons de 20 à 25 par minute comme la vitesse.
Remarque : Utilisez cette inclinaison et la vitesse pour toutes les étapes ultérieures impliquant l’utilisation d’un shaker.
Remarque : Si vous utilisez une lignée de souris journaliste multicolore comme mT/mG et autres anticorps n’est pas nécessaire, le tissu est prêt pour la microscopie après l’étape 2.2. - Ajouter 0,5 à 1 mL de tampon de blocage (5 % de sérum animal dilué dans du PBS-0.3T). Mettre la plaque sur l’agitateur et incuber pendant 1 heure en RT
- Aspirer la solution de blocage et d’ajouter des anticorps primaires dilués dans du PBS-0.3T avec 1 % sérum animal.
- Place la plaque sur un agitateur à 4 ° C la nuit.
- Le lendemain, laver les tissus avec du PBS-0.3T 3 fois pendant 5 minutes chacune en RT
- Utiliser des anticorps secondaires appropriés dilués dans du PBS-0.3T. Ajouter 0,5 – 1 solutions d’anticorps secondaire mL dans chaque puits. Enrouler la plaque dans du papier d’aluminium et laisser incuber sur un agitateur 1 heure à température ambiante.
NOTE : Diluer l’anticorps secondaire dans l’obscurité pour empêcher le photoblanchiment. - Après incubation de l’anticorps secondaire, laver avec du PBS-0.3T deux fois pendant 5 min, chacun en RT. les échantillons d’images si une tache de lipides neutres n’est pas souhaitée. Si la visualisation de gouttelettes lipidiques est nécessaire en utilisant les lipides neutres tacher, laver avec du PBS 1 x (sans surfactant non ionique) deux fois, de 5 min chacun.
- Après les étapes de lavage, incuber avec la tache de lipides neutres diluée avec le facteur de dilution de 1:1500 dans du PBS 1 x pendant 30 min en RT Les tissus sont maintenant prêts pour la microscopie. Pour l’imagerie futur, les tissus peuvent être stockés dans cette solution à 4 ° C.
Nota : Qualité d’image diminue avec le temps ; le meilleur moment pour l’imagerie est donc, dans 1 ou 2 jours. - À l’aide de pinces, poser le tissu à plat sur une lamelle de verre 24 x 60 mm² et placez-le sur un système de microscope inversé laser confocale.
- Si une coloration des noyaux au DAPI est souhaitée, ajouter 1 à 2 gouttes de milieu de montage contenant DAPI pour complètement submerger le tissu et empêchez-le de séchage.
- Pour obtenir des images d’entier-montent, coloré des tissus aux multiples plans focaux, effectuer Z-piles de 100 – 150 μm en profondeur avec 4 à 6 μm étape-taille au grossissement désiré.
3. tissu compensation et à l’aide de l’immunomarquage iDISCO +
Remarque : Ce protocole est basé sur les procédures précédemment publiées9,10,19.
- Fixation et prétraitement de méthanol
- Incuber les tissus en PFA dilué dans du PBS 1 x à 4° C durant la nuit dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL, 4 %.
NOTE : Laisser les tissus dans les tubes de 2 mL pour tous les traitements suivants jusqu'à l’imagerie. - Le lendemain, laver les tissus dans du PBS 1 x trois fois, pendant 1 heure chacune sur un agitateur à température ambiante.
Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser l’échantillon pendant une nuit à RT ou 4 ° C. - Déshydrater les tissus à ta dans 20 %, 40 %, 60 % et 80 % de méthanol, par la suite, pendant 1 h chaque. Déshydrater dans le méthanol 100 % à la droite pendant 1 heure, puis transférer les tissus frais 100 % de méthanol et incuber à 4 C pendant 1 h.
Remarque : Le méthanol dilué dans l’eau distillée. Durant l’incubation de méthanol, il est inutile de mettre des échantillons sur un agitateur, tant que les échantillons de tissus sont immergés.
ATTENTION : Cette étape n’est dangereuse, tel que le méthanol est toxique. Il est hautement inflammable sur une flamme nue. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte. Stocker le méthanol loin d’allumage et dans une armoire de sécurité inflammable. - Blanchir les tissus avec 5 % de peroxyde d’hydrogène (H2O2; 1 volume de 30 % H2O2 dilué dans 5 volumes de méthanol 100 %) pendant la nuit à 4 ° C.
ATTENTION : le peroxyde d’hydrogène 30 % est très dangereux sur la peau et contact avec les yeux. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte. - Réhydrater les tissus à RT à 80 %, 60 %, 40 % et 20 % de méthanol et 1 x PBS, par la suite, pendant une heure chaque.
- Laver avec 0,2 % surfactif dilué dans du PBS de x 1 deux fois, pendant 1 heures chacun sur un agitateur à température ambiante.
- Incuber les tissus en PFA dilué dans du PBS 1 x à 4° C durant la nuit dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL, 4 %.
- Immunomarquage
Remarque : Remplir les tubes de 2 mL contenant le tissu vers le haut du tube avec la solution utilisée à chaque étape pour éviter l’oxydation de tissu dès qu’immunomarquage commence, jusqu'à ce que la compensation est terminée.- Permeabilize les tissus de leur incubation dans une solution de la solution 1 PBS x 0,2 % tensioactifs non ioniques, 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et glycine de 0,3 M à 37 ° C dans un agitateur orbital table incubé durant 2 jours.
NOTE : Le temps d’incubation maximale pour l’étape de perméabilisation de 37 ° C est de 2 jours. - Bloquer les tissus dans une solution de 1 x PBS, 0,2 % tensioactifs non ioniques, 10 % DMSO, sérum âne 5 % et 1 % Fc bloc à 37 ° C dans un agitateur orbital table couvé pendant 2 jours.
Remarque : La durée maximale d’incubation pour l’étape de blocage est de 2 jours. - Incuber les tissus en anticorps primaires d’intérêt dans une solution de PBS 1 x, 0,2 %, polysorbate 20, 10 µg/mL héparine, DMSO 5 % et 5 % de sérum d’âne à 37 ° C dans un agitateur orbital table incubé pendant 4 jours.
- Laver avec 1 x PBS, 0,2 %, polysorbate 20 et 10 µg/mL héparine sur un agitateur à ta cinq fois, chacune pendant 1 h.
Remarque : Cette étape peut être un point de pause pour laisser des échantillons du jour au lendemain en RT - Incuber les tissus avec un anticorps secondaire dans une solution de PBS 1 x, 0,2 %, polysorbate 20, 10 µg/mL héparine et 5 % de sérum d’âne à 37 ° C dans un agitateur orbital sur table pendant 4 jours.
NOTE : Étape 3.2.5, tous les échantillons doivent être recouverts de papier aluminium pour éviter le photoblanchiment de l’anticorps secondaire. - Laver les tissus dans une solution de 1 x PBS, 0,2 %, polysorbate 20 et 10 µg/mL héparine sur un agitateur dans RT cinq fois, pendant 2 heures chacun.
Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser les échantillons une nuit à température ambiante.
- Permeabilize les tissus de leur incubation dans une solution de la solution 1 PBS x 0,2 % tensioactifs non ioniques, 20 % de diméthyl sulfoxide (DMSO) et glycine de 0,3 M à 37 ° C dans un agitateur orbital table incubé durant 2 jours.
- Tissu de nettoyage du tissu adipeux blanc et l’imagerie de volume
- Déshydrater les tissus contenus dans des tubes de 2 mL par incubation à 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol, par la suite, chacune pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, mettre en attente les échantillons dans le méthanol 100 % deux fois à température ambiante.
Remarque : Cette étape peut être un point de suspension pour laisser vos échantillons dans 100 % de méthanol pendant une nuit à température ambiante. - Incuber les tissus avec un mélange de 2 volumes de DCM pour 1 volume de méthanol pendant 3 h à ta sur un agitateur.
Remarque : Le DCM est volatile. Assurez-vous que les tubes sont bien scellées pour empêcher l’évaporation.
ATTENTION : Cette étape est dangereuse. DCM est toxique à l’inhalation. Une exposition prolongée peut causer des brûlures chimiques. Porter des équipements de protection individuelle (par exemple, des gants en nitrile, blouse, chaussures, lunettes de protection). Utiliser une hotte aspirante. - Incuber les tissus en 100 % DCM deux fois, pendant 15 min chacun sur un agitateur à température ambiante.
- Incuber à 100 % DBE en RT jusqu’en imagerie et pour la conservation de l’échantillon. Avant l’imagerie, inverser les tubes plusieurs fois pour mélanger les solutions.
Remarque : Remplir complètement les tubes avec DBE pour éviter l’oxydation, ce qui peut entraîner dans le tissu infructueux de compensation. Ne pas secouer les tubes durant l’incubation DBE.
ATTENTION : Cette étape est dangereuse. DBE est toxique. Il peut causer une irritation des yeux et des muqueuses. Porter des équipements de protection individuelle (p. ex. gants en nitrile, blouse de laboratoire, des lunettes de sécurité) et manipuler sous une hotte. - L’image de l’échantillon de tissu ensemble avec un microscope optique qui correspond à l’indice de réfraction de la deb solvant organique. Effectuer un empilement Z à un grossissement désiré et étape-taille pour le tissu tout.
- Déshydrater les tissus contenus dans des tubes de 2 mL par incubation à 20 %, 40 %, 60 % et 80 % méthanol, par la suite, chacune pendant 1 heure à température ambiante. Ensuite, mettre en attente les échantillons dans le méthanol 100 % deux fois à température ambiante.
4. exemples d’analyse de données d’entier-Montez teint tissu Images à l’aide de ImageJ
Remarque : Consultez https://imageJ.nih.gov/ij/download.html pour obtenir des instructions de téléchargement et d’installation.
- Quantification de la densité des vaisseaux sanguins (supplémentaire Figure 2)
- Importer les images enregistrées de seul le canal avec des vaisseaux sanguins immunomarquage sur ImageJ.
Remarque : Les images de quantification doivent être cohérentes en ce qui concerne la procédure de marquage et de la condition d’acquisition image. Réactifs identiques doivent être utilisés. Le temps d’exposition, l’intensité et grossissement devraient également être équivalentes dans l' imagerie du processus20. - Convertir l’image couleur en noir et blanc pour la quantification de la densité des vaisseaux sanguins. Pour ce faire, sous l’onglet « Image » , sélectionnez la commande « Adjust » , puis l’option « seuil de couleur » . Dans la « couleur de seuil » présentoir, choisissez « Fond sombre »20 et sélectionnez « B & W » sous le « seuil de couleur ».
- Pour mesurer le pourcentage de la surface du vaisseau sanguin signal sur toile de fond, sélectionnez l’onglet « Analyse » , puis la commande « analyser les particules » . Sous l’affichage de « particules analysées », sélectionnez les options « des résultats clairs » et « Résumer » . Cliquez sur « OK ».
- Copiez et collez la valeur de la zone de pourcentage sous l’onglet Résumé dans une feuille de calcul pour l’analyse. Le pourcentage de surface indique la densité des vaisseaux sanguins. Répétez les étapes 4.3.1–4.3.4 pour chaque image.
- Importer les images enregistrées de seul le canal avec des vaisseaux sanguins immunomarquage sur ImageJ.
- Quantification des adipocytes taille21 (supplémentaire Figure 3)
- Importer les images enregistrées des adipocytes sur ImageJ.
- Pour définir l’échelle de l’image, mesurez la longueur de l’échelle en pixels en traçant une ligne à l’échelle avec une distance connue sur l’image à l’aide de l’outil de sélection linéaire. Sous l’onglet « Analyse » , sélectionnez la commande « Définir échelle » . La distance de la ligne qui a été tracée avant sera automatiquement calculée en pixels.
- La boîte d’affichage de « Set Echelle » apparaîtra. Entrez la distance connue et l’unité de longueur. Sélectionnez « Global » à appliquer le barème fixant pour toutes les images importées, puis cliquez sur « OK ».
- Pour choisir la zone comme la méthode de mesure, sous l’onglet « Analyse » sélectionnez la commande « définir des mesures » . Une liste des différentes options pour les mesures apparaîtra. Sélectionnez l’option « Domaine » et cliquez sur « OK ».
- À l’aide de l’outil de sélection à main levée, trace le périmètre de chaque adipocyte d’intérêt. Sous l’onglet « Analyse » , sélectionnez la commande « Mesure (Ctrl + M) » , et la zone de l’adipocyte apparaîtra. Répétez cette procédure pour les autres adipocytes dans l’image.
Remarque : Pour assurer des mesures exactes, utilisez plusieurs images pour la quantification. - Copiez et collez les mesures de surface dans une feuille de calcul pour une analyse ultérieure des données.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En raison de la fragilité du tissu adipeux, méthodes impliquant plusieurs étapes de traitement et de sectionnement peuvent conduire à la défiguration de tissu adipeux morphologie3 (Figure 1 a). Cependant, l’entier-Montez la souillure peut préserver la morphologie des adipocytes, assurer une interprétation précise des résultats (Figure 1 b).
La fixation excessive du tissu adipeux mène à autofluorescence induite par le fixateur. Tel qu’illustré dans la Figure 2 a, les canaux rouges et vertes coloration pour la tyrosine hydroxylase (TH) et les signaux PECAM-1, se chevauchent respectivement, dans les régions identiques du tissu, ce qui indique qu’autofluorescence a pu se produire en raison de la fixation excessive en PFA pendant 3 jours. En revanche, la Figure 2 b montre une image représentative de la monture toute souillure en effectuant une fixation adéquate, comme le signal pour la coloration de TH se produit dans différents domaines par rapport au signal PECAM-1, ce qui démontre que ce signal n’est pas autofluorescence et est en fait un signal positif.
Entier-Montez la souillure est un outil de visualisation important pour le traçage de la base de Cre-loxP lignée des adipocytes15, avec mT/mG étant le journaliste idéal système18. NG2, un marqueur pour la population de cellules progéniteurs adipocytaires, est un protéoglycane de la membrane plasmique. Dans ce système, Ng2-Cre positive cellules m express-GFP, tandis que m-tomate est exprimé dans les cellules Ng2-Cre-négatif (Figure 3).
Le tissu adipeux est un organe incroyablement dynamique, capable d’élargir et rétrécir sous différentes conditions et les exigences physiologiques20. Imaging entier-Montez teinté tissu adipeux permet pour quantifier les changements imorphological dans des conditions expérimentales différentes. En particulier, le tissu adipeux est très vascularisé, qui est important dans la médiation de l’homéostasie métabolique lors des changements rapides au niveau de l’énergie1. Par exemple, les souris C57BL/6J que subissent les 24h de jeûne affichent beaucoup plus petite taille adipocytaire (Figure 4), indiquant la lipolyse, et une tendance à la densité des vaisseaux sanguins élevés comparée à continuellement nourri des souris (Figure 5). ImageJ logiciel a été utilisé pour quantifier la taille des adipocytes et la densité des vaisseaux sanguins, comme décrit ci-dessus.
Compensation des tissus sont une technique relativement nouvelle, développée pour supprimer l’opacité du tissu adipeux pour permettre la visualisation profondément dans le tissu volume9,10 (Figure 6). Entier-Montez la coloration sur terre non défrichée IWAT à l’aide de la microscopie confocale ne montrée une innervation sympathique clairsemée, puisque les fibres nerveuses sous la surface du tissu ne pourrait pas être visualisées (Figure 7 a). Cependant, arborisation neuronale dense pourrait être observée après compensation des tissus et immunomarquage avec l’utilisation du iDISCO + ainsi que l’utilisation de la microscopie fluorescente lumière-feuille (LSFM) (Figure 7 b).
Figure 1 : Comparaison de la morphologie de tissu adipeux avec des techniques conventionnelles de morphologiques et technique de coloration entier-montent. (A) H & E teint le tissu adipeux sur une section de paraffine (à gauche), avec des pointes de flèches noires indiquant les régions déformées des adipocytes. Fluorescent de lectine (flèches de glucides liaison protéique, blanc) dye injection, immunofluorescence de F4/80 (marqueur de macrophage, pointes de flèche jaunes) et la coloration DAPI noyaux du tissu adipeux sur cryosection (à droite). (B) le tissu adipeux blanc visualisation à l’aide d’entier-Montez la souillure avec une taille de palier de 5 μm. La profondeur totale de Z-pile capturée est environ 100 μm. Gouttelettes lipidiques adipocytes ont été colorées avec tache de lipides neutres (gris), et les vaisseaux sanguins ont été colorées avec PECAM-1. Image a été capturée au microscope avec une taille de palier de 5 μm pour le Z-gerbage (rouge). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : visualisation des fibres neuronales et des vaisseaux sanguins à l’aide d’entiers tachée du tissu adipeux. (A) les images microscopiques représentatives des résultats indésirables de PWAT teinté entier-montent en raison de la fixation excessive en PFA pendant 3 jours. Les signaux qui se chevauchent sont indiquées par des flèches blanches. (B) des images microscopiques représentatives d’un résultat positif de son ensemble monture colorent IWAT de contrôle de la souris. Les images ont été saisies à un grossissement de 100 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Suivi de lignée System.* mT/mG dans le tissu adipeux. Représentant les images positives Cre (mG) et Cre-négatif (mT) des cellules dans IWAT d’un Ng2-Cre ; souris de mT/mG. Les images ont été saisies à un grossissement de 200 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : visualisation et quantification de la taille de l’adipocyte. (A) les images représentatives des adipocytes dans PWAT de souris C57BL/6J à jeun à l’aide de lipides neutres coloration nourris et 24 heures. Les images ont été saisies à un grossissement de 200 x. (B) Adipocyte taille comparaison entre souris C57BL/6J à jeun à l’aide de logiciels ImageJ nourris et 24 h. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM ; 2-queue non appariées de Student t-test ; p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : visualisation et quantification de la masse volumique des vaisseaux sanguins. (A) les images représentatives des vaisseaux sanguins chez les souris C57BL/6J à jeun à l’aide d’anticorps PECAM-1 nourris et 24 heures. (B) Comparaison de la densité des vaisseaux sanguins entre nourris et 24 heures à jeun souris C57BL/6J à l’aide de logiciels ImageJ. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM ; 2-queue non appariées de Student t-test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : compensation du tissu adipeux à l’aide de la méthode iDISCO +. Avant la compensation, le tissu est opaque. Le tissu devient complètement transparent à l’extrémité du tissu des mesures de compensation.
Figure 7 : Ensemble-Mont teinté IWAT comparée à IWAT affranchis des tissus à l’aide de la méthode iDISCO +. (A) visualisation des fibres neuronales utilisant des anticorps de TH (1/500) en entier-Montez IWAT tachée au grossissement x 100 avec la microscopie confocale avec une taille d’étape de 5 μm. La profondeur totale de Z-pile capturée est environ 100 μm. (B) visualisation des fibres neuronales utilisant des anticorps de TH (1 : 200) dans son ensemble monture colorées IWAT avec iDISCO + protocole à 1,6 X grossissement utilisant LSFM et une étape-une taille de 4 μm. La profondeur totale de Z-pile capturée est environ 8 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 1 : schéma de principe pour le système de traçage de lignée mT/mG. Un double système fluorescent qui emploie eGFP membrane ciblés et axés sur la membrane tdTomato. Avant recombinaison Cre, le mT est globalement exprimé. Lorsque la cellule exprime la Cre, la cassette de mT est excisée et mG s’exprime en permanence. pA représente des séquences de polyadénylation après le codon stop. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 2 : logiciel d’Application d’ImageJ pour quantifier le pourcentage de la superficie de la densité des vaisseaux sanguins. (A), « Image » onglet commandes et options pour convertir une image en une couleur en noir et blanc de seuil. (B) Sommaire mesure du pourcentage de la superficie de la densité de navire à l’aide de la commande « Analyser les particules ». S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Supplémentaire Figure 3 : logiciel d’Application d’ImageJ pour quantifier la zone adipocytaire. Onglet « Analyze » : les commandes « Set Scale » et « Mesure » pour mesurer l’aire de l’adipocyte(s). Affichage des résultats montre la zone de chaque adipocyte mesurée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bien que les techniques classiques telles que l’histologie et cryosection offrent des avantages pour l’observation de la structure intracellulaire, entier-Montez la souillure offre une perspective différente dans la recherche de tissu adipeux, qui permet de visualiser en 3D des cellulaires architecture du tissu minimalement transformé.
Afin de réaliser avec succès entier-Montez la souillure, les suggestions suivantes devraient prendre en considération. Dépôts adipeux différents peuvent donner des résultats d’immunostaining divers ; ainsi, le type de tissu adipeux dépôt utilisé doit être déterminé d’abord. Par exemple, le tissu adipeux brun (TAB) est plus dense par rapport au tissu adipeux blanc (WAT) en raison de la plus petite, multiloculaire adipocytes21. Cette densité accrue de chauve-souris, il est difficile pour les anticorps de pénétrer à travers le tissu. En outre, la taille du tissu adipeux est également impérative que les anticorps bonne coloration, car trop grand/épaisseur tissus peuvent également entraîner la pénétration insuffisante d’anticorps. Ainsi, lors de l’obtention du tissu adipeux au cours de la dissection animale, la partie distale du tissu gras perigonadal doit être utilisée, puisque c’est la région la plus mince et peut permettre une pénétration suffisante anticorps et de cohérence des données. Par ailleurs, pour des tissus plus denses, utilisation d’une lignée de souris journaliste fluorescent, tels que mT/mG, peut permettre meilleure visualisation du marqueur d’intérêt, puisque cela permet d’éviter la question de la pénétration insuffisante d’anticorps. Par la suite, 1 % PFA est utilisé pour la fixation du tissu pour préserver la répartition naturelle des protéines et s’assurer que le tissu perméabilisation et anticorps pénétration22,23. Cependant, fixation excessive peut diminuer la reconnaissance de l’antigène et produire l’autofluorescence24. Cela est dû à la réaction entre groupes aldéhyde sur PFA, fixateur contenant des aldéhydes et autres composants tissulaires, qui crée des composés fluorescents24. Pour éviter le recours à une étape de recherche d’antigène, il est recommandé de laisser des tissus dans un fixatif pour seulement une heure à température ambiante et de commencer les étapes suivantes dès que la fixation est terminé7. Comme plusieurs autres techniques d’immunomarquage, titration de la concentration en anticorps est une étape essentielle de dépannage pour s’assurer que le signal désiré.
En effet, il y a plusieurs limitations d’entier-Montez la coloration malgré la signification susmentionnée et les avantages. Entier-Montez la souillure a des exigences strictes concernant le type de tissu et de la taille, parce que la pénétration insuffisante d’anticorps et coloration inégale peuvent se produire dans les tissus plus épais tels que les muscles et le foie. En outre, l’entier-Montez la souillure n’est pas la représentation plus précise de certains anticorps comme la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur pour le système nerveux sympathique, son signal est souvent masquée par la teneur en lipides dense dans le tissu adipeux (Figure 7). En outre, la surface inégale du tissu adipeux représente aussi un défi d’imagerie confocale, puisque les signaux situés au niveau des différentes couches du tissu adipeux ne peuvent pas être facilement capturés sur une seule image. Par conséquent, la quantification de l’intensité du signal dans les images obtenues ensemble monture coloration rendement des résultats incohérents pour ces fibres nerveuses-ensemble. La partie distale du PWAT est généralement le moins de lipides-dense ; donc, les meilleures images peuvent provenir de ce domaine. Toutefois, si cette zone est représentatif du tissu entier pour immunostaining dans tous les types d’anticorps devront être enquête.
En rendant les tissus optiquement transparente, une méthode de compensation réduit la diffusion de la lumière, permettant la visualisation de la structure profonde de25. iDISCO + est qu'un protocole peu coûteux a récemment développé que combine ensemble monture immunomarquage avec imagerie volume de divers tissus défrichées grand9. Mis à jour l’iDISCO + méthodes avec LSFM attestent de récentes études9,10 a observé une arborisation dendritique dense sur WAT qui ne peut pas être vu avec immunomarquage classique et microscopie confocale. Imagerie confocale classique utilise un système d’imagerie de faisceau et le trou d’épingle pour numérisation laser. La vitesse de balayage et la profondeur de pénétration sont limites du microscope ; ainsi, le tissu 3D dynamique est souvent manquée. En revanche, microscopie de lumière-feuille a avantages apparents qu’il utilise l’analyse de feuille et éclaire seulement une coupe optique à la fois, capturant toutes les molécules de fluorescence dans cet article. En outre, fluorophores dans d’autres sections ne sont pas excités, prévention des effets phototoxiques et blanchiment photo26. Ainsi, le montant de l’innervation du nerf dans le tissu adipeux pouvant être mieux évalué par iDISCO + et LSFM. Malgré cela, il y a quelques limitations à l’utilisation d’iDISCO + et LSFM. Par exemple, les utilisateurs doivent noter que seulement les couches dans le canal rouge et rouge sombre sont compatibles avec iDISCO +, parce que les longueurs d’onde de la lumière sont mieux à même pénétrer l' échantillon27. En outre, autofluorescence dans le spectre bleu-vert est assez élevé dans des échantillons de tissus grand, donc l’imagerie dans le spectre rouge et rouge sombre contribueront à réduire toute autofluorescence qui survient14. En ce qui concerne les souris transgéniques fluorescents journaliste, iDISCO + peut être utilisé pour visualiser les protéines de journaliste. Cependant, immunomarquage du reporter fluorescent avec un anticorps secondaire devrait être effectuée, car le signal endogène peut-être disparaître pendant le tissu processus14de compensation. Néanmoins, cette technique est très utile pour étudier les interactions du système nerveux sympathique-adipocytaires et pour enquêter sur la plasticité adipeuse dans différentes conditions physiologiques et métaboliques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des dons des Sciences naturelles et du Conseil de recherche génie (CRSNG) du Canada, pilote et faisabilité étude Grant de Banting et Best diabète Centre (BBDC), le Fonds de démarrage de SickKids à H-K. S., Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et Future planification à J-R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
