Summary
L'obiettivo del presente studio è di dimostrare la tecnica immunostaining e visualizzazione di intero-monta come un metodo ideale per l'imaging 3D della componente cellulare e architettura del tessuto adiposo.
Abstract
Tessuto adiposo è un organo metabolico importante con alta plasticità ed è sensible a reagire agli stimoli ambientali e stato nutrizionale. Come tale, le varie tecniche sono state sviluppate per studiare la morfologia e la biologia del tessuto adiposo. Tuttavia, metodi di visualizzazione convenzionale sono limitati a studiare il tessuto nelle sezioni 2D, non riuscendo a catturare l'architettura 3D dell'intero organo. Qui presentiamo intero-monta la macchiatura, un metodo di immunohistochemistry che conserva intatto il tessuto adiposo morfologia con passaggi di elaborazione minima. Quindi, le strutture di adipociti e altri componenti cellulari sono mantenute senza distorsione, ottenendo la visualizzazione 3D più rappresentativo del tessuto. Inoltre, intero-monta la macchiatura combinabile con metodi di analisi di lignaggio per determinare le decisioni di destino delle cellule. Tuttavia, questa tecnica ha alcune limitazioni a fornire informazioni accurate per quanto riguarda le parti più profonde del tessuto adiposo. Per ovviare a questa limitazione, intero-monta la macchiatura possa essere ulteriormente combinata con tessuto tecniche per rimuovere l'opacità del tessuto e consentire la visualizzazione completa dell'intero tessuto adiposo anatomia usando microscopia fluorescente luce-foglio di compensazione. Di conseguenza, una maggiore risoluzione e più accurata rappresentazione delle strutture di tessuto adiposo può essere catturati con la combinazione di queste tecniche.
Introduction
Tessuto adiposo è un organo essenziale per la conservazione di energia ed è caratterizzato da dinamiche di rimodellamento e quasi illimitata espansione1. Oltre l'omeostasi energetica, tessuto adiposo inoltre svolge un ruolo essenziale nella secrezione dell'ormone di adipochine oltre 50 di modulare la funzione metabolica del corpo intero2. Tessuto adiposo ha una diversa architettura composta da vari tipi cellulari tra cui adipocytes maturi, fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e di cellule progenitrici del adipocyte3. Recenti studi hanno dimostrato che l'obesità e altre disfunzioni metaboliche possono alterare significativamente funzione del tessuto adiposo e suo microambiente, che include ma non è limitato all'allargamento degli adipociti, infiltrazione di cellule infiammatorie (per esempio, macrofagi) e disfunzione vascolare3.
Tecniche convenzionali morfologiche come l'istologia e cryosectioning dimostrano diverse limitazioni nello studiare biologia adiposo come passaggi di elaborazione chimica di lunga durata, che può portare a tessuto restringimento e struttura distorsione3, 4. Inoltre, queste tecniche 2D sono insufficienti per osservare interazioni intercellulari esercitate da diversi tipi di cellule, come le sezioni ottenute sono limitate a regioni più piccole dell' intero tessuto3. Rispetto ai convenzionali metodi di imaging fluorescente, intero-monta la macchiatura non richiede ulteriori misure invasive, quali l'incorporamento, sezionamento e disidratazione; così, questo evita il problema della specificità dell'anticorpo in diminuzione. Come tale, è un metodo semplice ed efficace per formazione immagine del tessuto adiposo, con migliore conservazione della morfologia degli adipociti e complessiva del tessuto adiposo struttura5. Di conseguenza, intero-monta colorazione come una tecnica di immunolabeling veloce e poco costoso è stata istituita per preservare il tessuto adiposo 3D architettura1,6,7,8.
Tuttavia, nonostante la conservazione della morfologia del tessuto adiposo con uso di intero-monta la macchiatura, questa tecnica è ancora in grado di visualizzare le strutture interne sotto la superficie del lipido del tessuto. Diversi recenti studi9,10 hanno stabilito del tessuto tecniche combinate con intero-monta immunolabeling1,6 per consentire per la completa visualizzazione 3D all'interno del tessuto adiposo di compensazione. In particolare, sono state visualizzate fitte reti neurali e sistema vascolare in recenti studi9,10,11,12 con imaging con volumi 3D. Infatti, studiando la plasticità neurale e vascolare del tessuto adiposo in differenti condizioni fisiologiche è essenziale per studiare la biologia. Imaging tridimensionale abilitati su immunolabeling di schiarimento del tessuto ha eliminato solvente organi (iDISCO +) è un processo composto da pre-trattamento di metanolo, immunolabeling e di compensazione di opacità del tessuto con reagenti chimici organici diclorometano (DCM ) e dibenzyl ether (DBE)13,14. Il tessuto adiposo rendendo completamente trasparente, una rappresentazione più accurata dell'anatomia all'interno del tessuto come vasi sanguigni e fibre nervose possa essere ottenuta9,10. IDISCO + ha vantaggi in quanto è compatibile con vari anticorpi e reporter fluorescenti11,14, ed è dimostrato successo in molteplici organi e ritrovati anche14. Tuttavia, il suo limite principale è un tempo di incubazione lungo, in cui 18 a 20 giorni sono necessari per completare l'intero esperimento.
Un'altra importante applicazione della intero-monta la macchiatura è la visualizzazione di destino delle cellule in combinazione con un sistema di tracciatura di lignaggio. Lignaggio traccia è l'etichettatura di un gene/indicatore specifico in una cella può essere passato a tutte le cellule della figlia, che è conservato nel tempo15. Come tale, è un potente strumento che può essere utilizzato per determinare il destino di progenie15 di una cellula. Dal 1990, il sistema ricombinante di Cre-LoxP è diventato un potente approccio per l'analisi di lignaggio in vita organismi15. Quando una linea di topo che esprime Cre, un enzima recombinase di DNA, è attraversata con un'altra linea di mouse che esprimono un reporter che è adiacente a una sequenza di loxP-STOP-loxP, la proteina reporter è espresso15.
Per intero-monta la colorazione, l'uso di reporter fluorescenti multicolor è adatto per formazione immagine del tessuto adiposo perché permette per la minima interferenza con attività intracellulare del adipocyte16. Tuttavia, reporter tradizionale in genere macchia il citoplasma, rendendo difficile rintracciare la discendenza di adipociti bianchi, che hanno limitato contenuto citoplasmico17. Per ovviare a questo problema, l'uso di marker di membrana-limitano fluorescente tdTomato/membrana eGFP (mT/mG) reporter è uno strumento ideale. Targeting per membrana tdTomato è espresso in Cre-negativo cellule18. Sull'asportazione di Cre, si verifica un interruttore per l'espressione di eGFP membrana-mirati, rendendo questo reporter adatto per rintracciare il lignaggio del adipocyte progenitori17,18 (Complementare figura 1).
Lo scopo di questa carta è quello di fornire un protocollo dettagliato per intero-monta la macchiatura e mostrare come può essere combinato con altre tecniche per studiare lo sviluppo e la fisiologia del tessuto adiposo. Due esempi di applicazioni descritte in questo protocollo sono suo uso con linee del mouse 1) multicolor reporter per identificare origini diverse di adipociti e 2) tessuto di compensazione per visualizzare ulteriormente il arborization neurale nel tessuto adiposo bianco (WAT).
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di cura animale del centro per Phenogenomics (TCP) conformi agli standard del Consiglio canadese su Animal Care. Topi sono stati mantenuti su cicli di luce/buio di 12 h e forniti con libero accesso all'acqua e cibo. 7 mese vecchio topo maschio C57BL/6J sono stati usati nell'esperimento colorazione intero-monta.
Nota: Sezioni 1 e 2 sono in ordine cronologico, con la sezione 3 è un passaggio facoltativo subito dopo la sezione 1. Sezione 4 possono essere eseguite per analizzare la densità di dimensione e dei vasi sanguigni del adipocyte dopo il completamento della sezione 2.
1. i materiali preparazione e l'isolamento del tessuto
- Preparare fresco 1% paraformaldeide (PFA) diluito in 1x tamponato fosfato salino (PBS) per fissaggio del tessuto. Preparare il tensioattivo non ionico 0,3%, diluito in PBS 1X (appresso denominato PBS-0.3T) per il tessuto successivo fasi di lavaggio.
Nota: Per ogni tessuto, preparare circa 1,5 mL di 1% PFA per garantire completa immersione. Volume di fissazione può essere aumentata o diminuita a seconda delle dimensioni del tessuto.
Attenzione: Questo passaggio è pericoloso, come PFA è corrosivo e tossico. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., guanti in nitrile, camice, scarpe, occhiali di sicurezza) e maniglia in una cappa aspirante. - Eutanasia animali secondo una procedura approvata (ad es., la dislocazione cervicale o asfissia di biossido di carbonio). Senza indugio, sezionare il tessuto adiposo desiderato depositi (ad es., tessuto adiposo bianco inguinale o tessuto adiposo bianco perigonadal)18.
- Con le forbici di dissezione, tagliare il tessuto in 100 x 15 mm2 piastra di Petri in pezzi circa 0,5 – 1 cm nel formato e immergerli nella microcentrifuga riempito con 1% PFA. Tenere il ghiaccio.
2. intero-monta la macchiatura del tessuto adiposo bianco
- Dopo la dissezione è completa, è possibile spostare i campioni di tessuto in 1% PFA dal ghiaccio a temperatura ambiente (RT) per 1 h e poi trasferire i tessuti di una piastra di coltura cellulare di 12 o 24 pozzetti lavaggio più comodo.
- Lavare i tessuti con PBS-0.3T, 3 volte per 5 min ciascuno in RT su un agitatore inclinato a 22 °, con inclinazioni di 20 – 25 al minuto come la velocità.
Nota: Utilizzare questa inclinazione e velocità per tutti i passaggi successivi che comportano l'uso di uno shaker.
Nota: Se si utilizza una linea di topo reporter multicolor come mT/mG e ulteriori macchiatura dell'anticorpo non è necessaria, il tessuto è pronto per microscopia dopo passo 2.2. - Aggiungere 0,5 – 1 mL di tampone bloccante (5% di siero animale diluito in PBS-0.3T). Mettere la piastra sull'agitatore e incubare per 1 h di RT.
- Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere gli anticorpi primari diluiti in PBS-0.3T con 1% di siero animale.
- Posizionare la piastra su un agitatore a 4 ° C durante la notte.
- Il giorno dopo, lavare i tessuti con PBS-0.3T 3 volte per 5 minuti ciascuno di RT.
- Utilizzare appropriati anticorpi secondari diluiti in PBS-0.3T. Aggiungere 0,5 – 1 mL anticorpo secondario soluzioni a ciascun pozzetto. Avvolgere la piastra in alluminio e incubare su un agitatore per 1 h a TA.
Nota: Diluire l'anticorpo secondario al buio per evitare photobleaching. - Dopo l'incubazione anticorpo secondario, lavare con PBS-0.3T due volte per 5 min, ciascuno in RT. i campioni di immagine se non si desidera una macchia di lipidi neutri. Se la visualizzazione di goccioline lipidiche è necessario utilizzando il lipido neutro macchia, lavare con PBS 1X (senza tensioattivi non ionici) due volte, per 5 minuti ciascuno.
- Dopo i passaggi di lavaggio, incubare con la macchia di lipido neutro diluita con fattore di diluizione di 1: 1500 in 1X PBS per 30 min in RT. I tessuti sono ora pronti per microscopia. Per l'imaging di futuro, i tessuti possono essere memorizzati in questa soluzione a 4 ° C.
Nota: Qualità dell'immagine diminuisce nel tempo; quindi, il momento migliore per l'imaging è entro 1 o 2 giorni. - Usando il forcipe, appoggiare il tessuto sul vetrino coprioggetti 24 x 60 mm ² e posizionarlo su un sistema di microscopio invertito confocale laser.
- Se si desidera la macchiatura dei nuclei con DAPI, aggiungere 1-2 gocce di mezzo di montaggio contenente DAPI per immergere il tessuto completamente e impediscono l'essiccazione.
- Per ottenere immagini di intero-monta tinto tessuti a più piani focali, eseguire Z-pile di 100 – 150 μm in profondità con passaggio-dimensione: 4 – 6 μm presso l'ingrandimento desiderato.
3. tessuto schiarimento e Immunolabeling utilizzando iDISCO +
Nota: Questo protocollo è basato su procedure pubblicate in precedenza9,10,19.
- Fissazione e metanolo pre-trattamento
- Incubare i tessuti in 4% PFA diluito in PBS 1X a 4° C durante la notte in provette microcentrifuga da 2 mL.
Nota: Lasciare i tessuti nei tubi da 2 mL per tutti i seguenti trattamenti fino a formazione immagine. - Il giorno dopo, lavare i tessuti in PBS 1X tre volte, per 1 ora ciascuno su un agitatore a TA.
Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione di lasciare il campione durante la notte a RT o 4 ° C. - Disidratare i tessuti a RT a 20%, 40%, 60% e 80% metanolo, successivamente, per 1h ciascuna. Disidratare in metanolo al 100% a TA per 1 ora, poi trasferire i tessuti freschi 100% metanolo e incubare a 4 C per 1 h.
Nota: Metanolo diluito in acqua distillata. Durante l'incubazione di metanolo, non c'è nessun bisogno di mettere i campioni su un agitatore, purché i campioni di tessuto sono immersi.
Attenzione: Questo passaggio è pericoloso, come metanolo è tossico. È altamente infiammabile su fiamme libere. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante. Memorizzare il metanolo dalla accensione e in un armadietto di sicurezza infiammabile. - Candeggiare i tessuti con 5% di perossido di idrogeno (H2O2; 1 volume del 30% H2O2 diluito in 5 volumi di 100% metanolo) durante la notte a 4 ° C.
Attenzione: 30% di perossido di idrogeno è molto pericoloso su pelle e contatto con gli occhi. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante. - Reidratare i tessuti a RT in 80%, 60%, 40% e 20% metanolo e 1x PBS, successivamente, per 1 ora ciascuna.
- Lavare con 0,2% di tensioattivo non ionico diluito in 1X PBS due volte, per 1h ciascuna su un agitatore a TA.
- Incubare i tessuti in 4% PFA diluito in PBS 1X a 4° C durante la notte in provette microcentrifuga da 2 mL.
- Immunolabeling
Nota: Riempire i tubi di 2 mL contenente il tessuto alla parte superiore del tubo con la soluzione utilizzata in ogni passaggio per evitare l'ossidazione del tessuto appena immunolabeling comincia, fino a quando la compensazione è completato.- Permeabilize tessuti incubando in una soluzione di 1X PBS, tensioattivo non ionico 0,2%, 20% di dimetilsolfossido (DMSO) e 0,3 M glicina a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 2 giorni.
Nota: Il tempo massimo di incubazione per passaggio di permeabilizzazione di 37 ° C è 2 giorni. - Bloccare i tessuti in una soluzione di 1X PBS, tensioattivo non ionico 0,2%, 10% DMSO, asino 5% siero e blocco Fc 1% a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 2 giorni.
Nota: Il tempo massimo di incubazione per il passaggio di blocco è 2 giorni. - Incubare i tessuti in anticorpi primari di interesse in una soluzione di PBS 1X, 0,2% polisorbato 20, 10 µ g/mL eparina, 5% DMSO e siero di asino di 5% a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 4 giorni.
- Lavare con 1x PBS, 0,2% polisorbato 20 e l'eparina 10 µ g/mL su un agitatore a RT cinque volte, ciascuno per 1 h.
Nota: Questo passaggio può essere un punto di pausa per lasciare durante la notte campioni di RT. - Incubare i tessuti con anticorpo secondario in una soluzione di PBS 1X, 0,2% polisorbato 20, 10 µ g/mL eparina e siero di asino di 5% a 37 ° C in un agitatore orbitale da tavolo per 4 giorni.
Nota: Dal punto 3.2.5, tutti i campioni devono essere avvolti con carta stagnola per evitare che photobleaching di anticorpo secondario. - Lavare tessuti in una soluzione di PBS, 0,2% polisorbato 20 e l'eparina 10 µ g/mL su un agitatore in RT: 1x cinque volte, per ogni 2h.
Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione per lasciare i campioni durante la notte a TA.
- Permeabilize tessuti incubando in una soluzione di 1X PBS, tensioattivo non ionico 0,2%, 20% di dimetilsolfossido (DMSO) e 0,3 M glicina a 37 ° C su agitatore orbitale da tavolo incubato per 2 giorni.
- Tessuto del tessuto adiposo bianco e imaging con volumi di compensazione
- Disidratare i tessuti contenuti in provette 2 mL incubando a 20%, 40%, 60% e 80% metanolo, successivamente, ciascuno per 1 ora a TA. Quindi, disidratare i campioni in metanolo al 100% due volte a TA.
Nota: Questo passaggio può essere un punto di sospensione dell'esecuzione di lasciare i vostri campioni in metanolo al 100% durante la notte a TA. - Incubare i tessuti con una miscela di 2 volumi di DCM a 1 volume di metanolo per 3 h a RT su un agitatore.
Nota: DCM è volatile. Assicurarsi che i tubi sono sigillati ermeticamente per evitare l'evaporazione.
Attenzione: Questo passaggio è pericoloso. DCM è tossico su inalazione. L'esposizione prolungata può causare ustioni chimiche. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., guanti in nitrile, camice, scarpe, occhiali di sicurezza). Utilizzare una cappa aspirante. - Incubare i tessuti in 100% DCM due volte, per 15 minuti ciascuno, su un agitatore a TA.
- Incubare in 100% DBE in RT fino a formazione immagine e per la conservazione dei campioni. Prima di formazione immagine, invertire i tubi più volte per mescolare le soluzioni.
Nota: Riempire completamente i tubi con DBE per impedire l'ossidazione, che può portare nel tessuto infruttuoso di compensazione. Non agitare i tubi durante l'incubazione DBE.
Attenzione: Questo passaggio è pericoloso. DBE è tossico. Può causare irritazione agli occhi e alla pelle. Indossare dispositivi di protezione individuale (ad es., nitrile guanti, camice, occhiali di sicurezza) e gestire in una cappa aspirante. - Immagine per il campione di tessuto intero con un microscopio ottico che corrisponde l'indice di rifrazione del solvente organico DBE. Eseguire Z-stacking ad un ingrandimento desiderato e passo-size per l'intero tessuto.
- Disidratare i tessuti contenuti in provette 2 mL incubando a 20%, 40%, 60% e 80% metanolo, successivamente, ciascuno per 1 ora a TA. Quindi, disidratare i campioni in metanolo al 100% due volte a TA.
4. esempi di analisi dei dati dall'intero-monta macchiato tessuto immagini usando ImageJ
Nota: Vedere https://imageJ.nih.gov/ij/download.html per le istruzioni di download e installazione.
- Quantificazione della densità del vaso sanguigno (integrativa Figura 2)
- Importare le immagini salvate del solo canale con vaso sanguigno immunostaining su ImageJ.
Nota: Le immagini per la quantificazione devono essere coerenti in termini di procedura di macchiatura e condizione di acquisizione immagine. Identici reagenti dovrebbero essere usati. Il tempo di esposizione, intensità e ingrandimento dovrebbe anche essere equivalente a imaging processo20. - Convertire l'immagine a colori in bianco e nero per la quantificazione di densità del vaso sanguigno. A tale scopo, sotto la scheda "Immagine" , selezionare il comando "Regola" , quindi l'opzione "soglia del colore" . La "soglia colore" visualizzare casella, scegliere "Dark Background"20 e selezionare "B & W" sotto "soglia colore".
- Per misurare la percentuale di area del vaso sanguigno segnale sfondo, selezionare la scheda "Analizza" , quindi il comando di "analizzare particelle" . Sotto il display delle "particelle analizzati", selezionare le opzioni "risultati chiari" e "Summarize" . Fare clic su "OK".
- Copiare e incollare il valore dell'area percentuale sotto la scheda Riepilogo in un foglio di calcolo per l'analisi. La percentuale di area indicherà la densità del vaso sanguigno. Ripetere i passaggi 4.3.1–4.3.4 per ogni singola immagine.
- Importare le immagini salvate del solo canale con vaso sanguigno immunostaining su ImageJ.
- Quantificazione dell'adipocita dimensioni21 (integrativa Figura 3)
- Importare le immagini salvate degli adipociti su ImageJ.
- Per impostare la scala dell'immagine, è necessario misurare la lunghezza della scala in pixel tracciando una linea alla scala con una distanza nota sull'immagine usando lo strumento selezione Straight-line. Sotto la scheda "Analizza" , selezionare il comando "Imposta scala" . La distanza della linea che è stata rintracciata prima viene calcolata automaticamente in pixel.
- Verrà visualizzata la finestra di visualizzazione di "Imposta scala" . Immettere la distanza nota e unità di lunghezza. Selezionare "Global" per applicare l'impostazione per tutte le immagini importate della scala e fare clic su "OK".
- Per scegliere la zona come il metodo di misurazione, sotto la scheda "Analizza" selezionare il comando "Set Measurements" . Verrà visualizzato un elenco di opzioni diverse per le misurazioni. Selezionare l'opzione "Area" e fare clic su "OK".
- Utilizzando lo strumento selezione a mano libera, tracciare il perimetro di ogni adipocita di interesse. Sotto la scheda "Analizza" , selezionare il comando "Misura (Ctrl + M)" e verrà visualizzata l'area dell'adipocita. Ripetere questa procedura per altri adipociti nell'immagine.
Nota: Per garantire misure accurate, utilizzare più immagini per quantificazione. - Copiare e incollare le misurazioni di zona in un foglio di calcolo per ulteriori analisi dei dati.
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Representative Results
A causa della fragilità del tessuto adiposo, metodi che coinvolgono più fasi di lavorazione e sezionamento possono condurre allo sfregio del tessuto adiposo morfologia3 (Figura 1A). Tuttavia, l'intero-monta la macchiatura può preservare la morfologia degli adipociti, assicurando la corretta interpretazione dei risultati (Figura 1B).
Sovra-fissazione del tessuto adiposo conduce ad autofluorescenza fissativo-indotta. Come mostrato nella Figura 2A, canali verde e rosso, macchiatura per tirosina idrossilasi (TH) e segnali PECAM-1, rispettivamente, si sovrappongono nelle regioni identiche del tessuto, che indica che quello autofluorescence potrebbe essersi verificato a causa di sovra-fissazione in PFA per 3 giorni. Al contrario, la Figura 2B Mostra un'immagine rappresentativa dell'intero-monta colorazione quando viene eseguita la corretta fissazione, come il segnale per la colorazione del TH si verifica in aree diverse rispetto al segnale PECAM-1, dimostrando che questo segnale non è autofluorescenza e in realtà è un segnale positivo.
Intero-monta la macchiatura è uno strumento di visualizzazione importanti per l'analisi basate su Cre-loxP lignaggio di adipociti15, con essere il giornalista ideale sistema18mT/mG. Ng2, un indicatore per la popolazione di cellule progenitrici del adipocyte, è un proteoglicano della membrana plasmatica. In questo sistema, Ng2-Cre-positivo cellule espressa m-GFP, mentre m-pomodoro è espresso in cellule Ng2-Cre-negative (Figura 3).
Il tessuto adiposo è un organo incredibilmente dinamico, capace di espansione e contrazione sotto diverse condizioni ed esigenze fisiologiche20. Intero-monta macchiato tessuto adiposo di imaging consente di quantificazione dei cambiamenti imorphological in diverse condizioni sperimentali. In particolare, il tessuto adiposo è altamente vascolarizzato, che è importante nel mediare la omeostasi metabolica al momento di rapidi cambiamenti nel livello di energia1. Per esempio, topi C57BL/6J che subiscono la 24 ore di digiuno visualizzare significativamente più piccola dimensione degli adipociti (Figura 4), che indica la lipolisi, e una tendenza nel vaso sanguigno elevata densità rispetto al continuamente alimentato i topi (Figura 5). Software di ImageJ è stata utilizzata per quantificare la dimensione dei adipocytes e densità del vaso sanguigno, come descritto in precedenza.
Tessuto di compensazione è una tecnica relativamente nuova sviluppata per rimuovere l'opacità del tessuto adiposo per permettere la visualizzazione profonda all'interno il tessuto volume9,10 (Figura 6). Intero-monta colorazione sul uncleared IWAT usando la microscopia confocal ha mostrata soltanto lo stimolo simpatico sparso, poiché non potrebbero essere visualizzate fibre nervose sotto la superficie del tessuto (figura 7A). Tuttavia, denso arborization neurale potrebbe essere osservato dopo tessuto di compensazione e immunolabeling con l'uso di iDISCO + così come l'uso di microscopia fluorescente luce-foglio (LSFM) (figura 7B).
Figura 1: confronto della morfologia del tessuto adiposo con tecniche morfologiche convenzionali e tecnica di pittura del intero-monta. (A) H & E macchiato il tessuto adiposo su una sezione di paraffina (a sinistra), con punte di freccia nere che indica regioni distorte degli adipociti. Iniezione, macchiatura immunofluorescente F4/80 (indicatore del macrofago, punte di freccia gialle) e DAPI nuclei macchiatura del tessuto adiposo su donatrici (a destra) tintura fluorescente lectin (frecce di carboidrati vincolante proteine, bianco) di interesse della zona. Visualizzazione di tessuto adiposo bianco (B) usando la macchiatura intero-monta con una dimensione di passaggio di 5 μm. La profondità dello stack Z totale catturata è circa 100 μm. Goccioline del lipido del adipocyte erano macchiate con la macchia di lipidi neutri (grigio), e vasi sanguigni sono stati macchiati con PECAM-1. Immagine è stata catturata con microscopia con una dimensione di passaggio di 5 μm per Z-stacking (rosso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: visualizzazione delle fibre nervose e vasi sanguigni usando intero-monta macchiato del tessuto adiposo. (A) rappresentante immagini microscopiche di risultati indesiderati da intero-monta PWAT macchiato a causa di sovra-fissazione in PFA per 3 giorni. Segnali sovrapposti sono indicati da frecce bianche. (B) rappresentante immagini microscopiche di un risultato positivo da intero-monta macchiato IWAT dal controllo mouse. Le immagini sono state catturate a 100 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'analisi di lineage utilizzando il sistema mT/mG nel tessuto adiposo. Rappresentante immagini Cre-positiva (mG) e cellule di Cre-negative (mT) in IWAT di un Ng2-Cre; mouse mT/mG. Le immagini sono state catturate a 200 ingrandimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: visualizzazione e quantificazione della dimensione del adipocyte. (A) immagini rappresentative dei adipocytes in PWAT dei topi C57BL/6J digiuno nutriti e 24 ore usando la macchiatura di lipidi neutri. Le immagini sono state catturate a 200 ingrandimenti. Confronto fra i topi C57BL/6J digiuno nutriti e 24-h utilizzando software ImageJ dimensioni dell'adipocita (B). I valori sono espressi come media ± SEM; 2-tailed spaiati di Student t-test; p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: visualizzazione e quantificazione di densità del vaso sanguigno. (A) immagini rappresentative dei vasi sanguigni in topi C57BL/6J digiuno nutriti e 24 ore usando l'anticorpo PECAM-1. (B) confronto tra densità del vaso sanguigno tra nutriti e 24 ore a digiuno topi C57BL/6J utilizzando software ImageJ. I valori sono espressi come media ± SEM; 2-tailed spaiati di Student t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: rimozione del tessuto adiposo mediante il metodo iDISCO +. Prima della compensazione, il tessuto è opaco. Il tessuto diventa completamente trasparente all'estremità del tessuto passi di compensazione.
Figura 7: Intero-monta macchiato IWAT confrontato con IWAT tessuto-eliminato utilizzando il metodo iDISCO +. (A) visualizzazione di fibre neurali usando TH anticorpo (1: 500) in intero-monta IWAT macchiato all'ingrandimento 100x con microscopia confocale con una dimensione di passaggio di 5 μm. La profondità dello stack Z totale catturata è circa 100 μm. (B) visualizzazione di fibre neurali usando TH anticorpo (1: 200) in intero-monta macchiato IWAT con protocollo iDISCO + a 1.6 X ingrandimento utilizzando LSFM con una dimensione di passaggio di 4 μm. La profondità dello stack Z totale catturata è circa 8 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 1: diagramma schematico per sistema di tracciatura di lignaggio mT/mG. Un doppio sistema fluorescente che si avvale di targeting per membrana eGFP e targeting per membrana tdTomato. Prima Cre ricombinazione, la mT è espresso a livello globale. Quando la cellula esprime Cre, la cassetta di mT è asportata e mG è espresso in modo permanente. pA rappresenta sequenze di poliadenilazione dopo il codone di stop. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 2: software di applicazione di ImageJ per quantificare la percentuale di area di densità del vaso sanguigno. (A), «Immagine» scheda comandi e opzioni per convertire un'immagine in un colore di soglia in bianco e nero. (B) misurazione Riepilogo dell'area percentuale di densità del vaso utilizzando il comando "Analizzare particelle". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Complementare figura 3: software di applicazione di ImageJ per quantificare la zona del adipocyte. "Analizzare" scheda: comandi "Imposta scala" e "Misura" di misurare l'area della adipocyte(s). Visualizzazione dei risultati Mostra l'area di ogni adipocita misurato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se le tecniche convenzionali come l'istologia e donatrici offrono benefici per osservando struttura intracellulare, intero-monta la macchiatura offre una prospettiva diversa nella ricerca del tessuto adiposo, che consente la visualizzazione in 3D del cellulare architettura del tessuto minimamente trasformato.
Per eseguire correttamente la macchiatura intero-monta, i seguenti suggerimenti dovrebbero essere presi in considerazione. Depositi di differenti del tessuto adiposo possono produrre vari risultati immunostaining; così, il tipo di tessuto adiposo depot utilizzato dovrebbe essere determinato in primo luogo. Per esempio, il tessuto adiposo marrone (pipistrello) è più denso rispetto al tessuto adiposo bianco (WAT) a causa di più piccoli adipocytes multilocular21. Questa densità aumentata del pipistrello rende difficile per gli anticorpi a permeare attraverso il tessuto. Inoltre, la dimensione del tessuto adiposo è anche imperativa per la macchiatura dell'anticorpo appropriato, poiché troppo grande/spessi tessuti possono anche tradursi in penetrazione insufficiente dell'anticorpo. Quindi, quando si ottiene il tessuto adiposo durante la dissezione animale, la porzione distale del tessuto grasso perigonadal dovrebbe essere usata, poiché questo è la regione più sottile e può consentire sufficiente penetrazione dell'anticorpo e dati coerenti. In alternativa, per i tessuti più densi, utilizzo di una linea di topo reporter fluorescenti, come mT/mG, può consentire per una migliore visualizzazione dell'indicatore di interesse, poiché questo evita il problema della penetrazione dell'anticorpo insufficiente. Successivamente, il 1% PFA è utilizzato per la fissazione del tessuto per preservare la naturale distribuzione delle proteine e assicurare tessuto permeabilizzazione e anticorpo penetrazione22,23. Tuttavia, sovra-fissazione può diminuire il riconoscimento dell'antigene e produrre autofluorescence24. Questo è dovuto alla reazione tra gruppi di aldeide il PFA e altri aldeide-contenenti fissativo e componenti del tessuto, che crea composti fluorescenti24. Per evitare la necessità di un passaggio di ricupero dell'antigene, si consiglia di lasciare i tessuti in un fissativo per solo un'ora a temperatura ambiente e cominciare i prossimi passi appena la fissazione è completato7. Come molte altre tecniche di immunolabeling, titolazione la concentrazione di anticorpi è un passo di risoluzione dei problemi essenziale per garantire il segnale desiderato.
Infatti, ci sono diverse limitazioni di intero-monta la macchiatura nonostante il suddetto significato e vantaggi. Intero-monta la macchiatura ha requisiti rigorosi per quanto riguarda il tipo di tessuto e le dimensioni, perché anticorpo insufficiente penetrazione e macchiatura irregolare può verificarsi nei tessuti più spessi come i muscoli e fegato. Inoltre, l'intero-monta colorazione non è la rappresentazione più precisa di alcuni anticorpi come tirosina idrossilasi (TH), un indicatore per il sistema nervoso simpatico, come il suo segnale è spesso mascherato da denso di lipidi nel tessuto adiposo (Figura 7). Inoltre, la superficie irregolare del tessuto adiposo pone anche una sfida per l'imaging confocale, poiché i segnali situati a diversi strati di tessuto adiposo non possono essere facilmente catturati su una singola immagine. Pertanto, la quantificazione dell'intensità del segnale nelle immagini ottenute da intero-monta colorazione resa risultati incoerenti per arborization fibre nervose intero. La porzione distale del PWAT è solitamente il minimo del lipido-denso; quindi, le immagini migliori possono essere ottenute da questa zona. Tuttavia, se questa zona è rappresentante del tessuto intero per immunostaining in tutti i tipi di anticorpi richiederà ulteriori indagini.
Facendo tessuto otticamente trasparente, un metodo di compensazione riduce la dispersione della luce, consentendo la visualizzazione della struttura profonda25. iDISCO + è che un protocollo economico recentemente sviluppato che combina intero-monta immunolabeling con imaging con volumi di vari tessuti sgomberati grande9. Modificate iDISCO + metodi con LSFM dimostrato da recenti studi9,10 osservato arborization dentritico denso il WAT che non può essere visto con immunolabeling convenzionale e microscopia confocale. Formazione immagine confocal convenzionale utilizza un sistema di imaging fascio e pinhole per scansione laser. La velocità di scansione e penetrante profondità sono limitazioni del microscopio; così, il tessuto 3D dinamiche sono spesso perso. Al contrario, la microscopia luce-foglio ha vantaggi apparenti in quanto utilizza la scansione foglio e illumina solo una sezione ottica alla volta, l'acquisizione di tutte le molecole di fluorescenza all'interno di quella sezione. Inoltre, fluorofori in altre sezioni non sono entusiasti, prevenire effetti foto-candeggio e fototossiche26. Così, la quantità di innervazione del nervo all'interno del tessuto adiposo può essere valutata più accuratamente con iDISCO + e LSFM. Nonostante questo, ci sono alcune limitazioni all'uso di iDISCO + e LSFM. Per esempio, gli utenti dovrebbero notare che solo canali nel canale rosso e da' sono compatibili con iDISCO +, perché lunghezze d'onda della luce sono meglio in grado di penetrare l'esempio27. Inoltre, autofluorescenza nello spettro blu-verde è abbastanza alto in campioni di tessuto grande, modo imaging negli spettri rossi e da' contribuirà a ridurre qualsiasi autofluorescenza che si verifica14. Per quanto riguarda topi transgenici reporter fluorescente, iDISCO + può essere utilizzato per visualizzare proteine reporter. Tuttavia, immunolabeling del reporter fluorescente con un anticorpo secondario dovrebbe essere condotta, come il segnale endogeno può sbiadire durante il tessuto processo14di compensazione. Tuttavia, questa tecnica è estremamente preziosa per lo studio delle interazioni del sistema nervoso simpatico-adiposo e per indagare adiposa plasticità in differenti condizioni fisiologiche e metaboliche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio (NSERC) del Canada, pilota e Grant di studio di fattibilità di Banting e Best diabete centro (PPMI), il fondo iniziale di SickKids a H-K. S., Medical Research Center programma (2015R1A5A2009124) attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro progettando di J-R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
