Summary
De focus van de huidige studie is om aan te tonen van de gehele-mount immunokleuring en visualisatie techniek als een ideale methode voor 3D beeldvorming van vetweefsel architectuur en cellulaire component.
Abstract
Vetweefsel is een belangrijk metabolisch orgaan met hoge plasticiteit en inspelen op milieu stimuli en de status van de nutriënten. Als zodanig, zijn verschillende technieken ontwikkeld om te bestuderen van de morfologie en de biologie van vetweefsel. Conventionele visualisatie methoden zijn echter beperkt tot het bestuderen van het weefsel in 2D secties, niet te vangen de 3D architectuur van het gehele orgaan. Hier presenteren we geheel-mount kleuring, een immunohistochemistry methode die bewaart intact adipeus weefsel morfologie met minimale processing stappen. Vandaar, de structuren van adipocytes en andere cellulaire componenten worden gehandhaafd zonder vervorming, bereiken de meest representatieve 3D visualisatie van het weefsel. Geheel-mount kleuring kan bovendien worden gecombineerd met lineage tracering methoden ter bepaling van de cel lot besluiten. Deze techniek heeft echter enkele beperkingen aan het verstrekken van nauwkeurige informatie met betrekking tot de diepere delen van vetweefsel. Om deze beperking ondervangen kan geheel-mount kleuring worden verder gecombineerd met weefsel van het ontruimen van technieken om de ondoorzichtigheid van weefsel te verwijderen en te zorgen voor volledige visualisatie van hele adipeus weefsel anatomie met behulp van licht vel fluorescent microscopie. Dus kunnen een hogere resolutie en meer accurate weergave van vetweefsel structuren worden vastgelegd met de combinatie van deze technieken.
Introduction
Vetweefsel is een essentieel orgaan voor energieopslag en wordt gekenmerkt door de dynamische reorganisatie en bijna onbeperkte uitbreiding1. Naast energie homeostase speelt adipeus weefsel ook een essentiële rol in hormoon afscheiding van meer dan 50 adipokines te moduleren van gehele lichaam metabole functie2. Vetweefsel heeft een divers het platform bestaande uit verschillende celtypen, met inbegrip van volwassen adipocytes, fibroblasten, endotheliale cellen, immune cellen en adipocyte voorlopercellen cellen3. Recente studies hebben aangetoond dat overgewicht en andere metabole disfunctie aanzienlijk veranderen kunnen adipeus weefsel functie en de communicatie, die omvat, maar is niet beperkt tot uitbreiding van de adipocytes, infiltratie van ontstekingscellen (b.v., macrofagen), en vasculaire dysfunctie3.
Conventionele morfologische technieken zoals histologie en cryosectioning tonen verschillende beperkingen bij het bestuderen van obesitas biologie zoals lange chemische verwerking stappen, die tot weefsel krimp en structuur vervorming3leiden kan, 4. Bovendien, deze 2D technieken zijn onvoldoende om het observeren van intercellulaire interacties uitgeoefend door verschillende soorten cellen, zoals de secties verkregen beperkt tot kleinere regio's van de gehele weefsel3 zijn. In vergelijking met conventionele methoden voor fluorescerende imaging, geheel-mount kleuring vereist geen extra invasieve stappen, zoals insluiten, afdelen en uitdroging; Dus, dit voorkomt het probleem van de afnemende antilichamenspecificiteit. Als zodanig is het een eenvoudige en efficiënte methode voor imaging adipeus weefsel, met beter behoud van de adipocyte morfologie en algehele adipeus weefsel structuur5. Daarom geheel-mount kleuring zoals een snelle en goedkope immunolabeling techniek werd opgericht voor het behoud van vetweefsel 3D het platform1,6,7,8.
Echter, ondanks het behoud van vetweefsel morfologie met gebruik van het geheel-mount kleuring, deze techniek is nog steeds niet in staat om te visualiseren van innerlijke structuren onder de oppervlakte van de lipide van het weefsel. Verschillende recente studies9,10 geconstateerd weefsel clearing technieken gecombineerd met geheel-mount immunolabeling1,6 te voorzien van uitgebreide 3D-visualisatie in adipeus weefsel. In het bijzonder zijn dichte neurale en therapieën netwerken gevisualiseerd in recente studies9,10,11,12 met 3D-volume imaging. Inderdaad, het bestuderen van de neurale en vasculaire plasticiteit van vetweefsel onder verschillende fysiologische omstandigheden is essentieel voor de studie van de biologie. Immunolabeling ingeschakelde driedimensionale beeldvorming van oplosmiddel-gewist organen (iDISCO +) weefsel clearing is een proces bestaat uit methanol voorbehandeling, immunolabeling, en ruimen van weefsel ondoorzichtigheid met organische chemische reagentia dichloormethaan (DCM ) en dibenzyl ether (DBE)13,14. Door het vetweefsel volkomen transparant te maken, kan een meer accurate weergave van anatomie binnen het weefsel zoals bloedvaten en neurale vezels worden verkregen9,10. IDISCO + heeft voordelen het is compatibel met verschillende antilichamen en fluorescerende verslaggevers11,14, en het heeft aangetoond dat succes in meerdere organen en zelfs embryoes14. De belangrijkste beperking is echter een lange incubatietijd, waarin 18 tot 20 dagen nodig om te voltooien van het hele experiment.
Een andere belangrijke toepassing van geheel-mount kleuring is de visualisatie van het lot van de cel in combinatie met een systeem voor de tracering van afkomst. Lineage tracering is de etikettering van een specifiek gen/markering in een cel die kan worden doorgegeven aan alle cellen van de dochter en over tijd15wordt behouden. Als zodanig is het een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt voor het bepalen van het lot van15nakomelingen van een cel. Sinds de jaren 1990, de Cre-LoxP recombinante systeem is uitgegroeid tot een krachtige aanpak voor lineage tracering in levende organismen15. Wanneer een muis-lijn die Cre, een DNA recombinase enzym uitdrukt, is gekruist met een andere muis lijn uiting van een verslaggever die grenst aan een reeks loxP-STOP-loxP, is het eiwit verslaggever uitgedrukt15.
Voor geheel-mount kleuring, is het gebruik van fluorescerend multicolor verslaggevers geschikt voor imaging van vetweefsel, omdat het zorgt voor minimale interferentie met intracellulaire activiteiten van de adipocyte16. Echter, traditionele verslaggevers meestal vlek het cytoplasma, waardoor het moeilijk is om te traceren van de bloedlijn van witte adipocytes, die weinig hebben cytoplasmatische inhoud17. Om dit probleem te verhelpen, is het gebruik van membraan-gebonden fluorescerende tdTomato/membraan eGFP (mT/mG) verslaggever marker een ideaal hulpmiddel. Membraan-gerichte tdTomato wordt uitgedrukt in Cre-negatieve cellen18. Op Cre excisie optreedt een schakelaar op de expressie van eGFP membraan-gerichte, waardoor deze verslaggever geschikt voor het traceren van de bloedlijn van adipocyte voorlopercellen17,18 (Aanvullende figuur 1).
Het doel van deze paper is te voorzien in een gedetailleerd protocol geheel-mount kleuring en tonen hoe het kan worden gecombineerd met andere technieken te bestuderen voor de ontwikkeling en de Fysiologie van vetweefsel. Twee voorbeelden van toepassingen die zijn beschreven in dit protocol zijn het gebruik ervan met 1) Multikleur verslaggever muis lijnen te identificeren van verschillende oorsprong van adipocytes en 2) weefsel wissen om de neurale arborization in witte vetweefsel (WAT) verder te visualiseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele dierlijke protocollen werden goedgekeurd door het dier Care Comité van het centrum voor Phenogenomics (TCP) gelijkvormig aan de normen van de Canadese Raad op Animal Care. Muizen werden gehandhaafd op 12 uur licht/donker cycli en voorzien van gratis toegang tot water en voedsel. 7 maand oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt in het geheel-mount kleuring experiment.
Opmerking: Secties 1 tot en met 2 zijn in chronologische volgorde, met punt 3 wordt een optionele stap direct na sectie 1. Afdeling 4 kan worden uitgevoerd voor het analyseren van adipocyte grootte en bloedvat dichtheid na de voltooiing van sectie 2.
1. materialen voorbereiding en weefsel isolatie
- Het bereiden van vers 1% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor fixatie van het weefsel. Bereiden van 0,3% nonionic oppervlakteactieve stof verdund in 1 x PBS (hierna te noemen de PBS-0.3T) voor latere weefsel wassen stappen.
Opmerking: Voor elk weefsel, bereiden ongeveer 1,5 mL 1% PFA om ervoor te zorgen volledige onderdompeling. Fixatie volume kan worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de grootte van het weefsel.
Let op: Deze stap is gevaarlijk, aangezien PFA bijtende en giftige. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, schoeisel, veiligheidsbril) en handvat in een zuurkast. - Euthanaseren dieren volgens een goedgekeurde procedure (bijvoorbeeld, cervicale dislocatie en/of kooldioxide verstikking). Onverwijld, ontleden de gewenste adipeus weefsel depots (b.v., inguïnale witte vetweefsel of perigonadal witte vetweefsel)18.
- Met een dissectie schaar, snijd het weefsel op een 100 x 15 mm2 petrischaal in stukken ongeveer 0,5 – 1 cm groot, en hen te onderdompelen in microcentrifuge buizen gevuld met 1% PFA. Houd op ijs.
2. geheel-mount kleuring van witte vetweefsel
- Nadat dissectie voltooid is, verplaatst u de weefselmonsters in 1% PFA uit het ijs tot kamertemperatuur (RT) gedurende 1 uur, en vervolgens de weefsels overbrengen in een 12 - of 24-well cel cultuur plaat voor sneller wassen.
- Wassen van de weefsels met PBS-0.3T, 3 keer gedurende 5 minuten elk op RT op een shaker gekanteld op 22 °, met 20 tot 25 kantelt per min als de snelheid.
Opmerking: Gebruik deze tilt en snelheid voor alle volgende stappen met behulp van een shaker.
Opmerking: Als de opdrachtregel multicolor verslaggever muis zoals mT/mG en extra antilichaam kleuring is niet nodig, het weefsel is klaar voor microscopie na stap 2.2. - Voeg toe 0,5 – 1 mL blokkeerbuffer (dierlijke serum 5% verdund in PBS-0.3T). Zet de plaat op het schudapparaat en incubeer gedurende 1 h in RT.
- De blokkerende oplossing gecombineerd en toevoegen van primaire antilichamen verdund in PBS-0.3T met 1% dierlijke serum.
- Plaats de plaat op een shaker bij 4 ° C's nachts.
- De volgende dag wassen de weefsels met PBS-0.3T 3 keer voor 5 minuten elk in RT.
- Gebruiken van passende secundaire antilichamen verdund in PBS-0.3T. Voeg toe 0,5 – 1 mL secundair antilichaam oplossingen aan elk putje. De plaat wikkel in aluminiumfolie en Incubeer het op een shaker gedurende 1 uur bij RT.
Opmerking: Verdun het secundaire antilichaam in het donker om te voorkomen dat photobleaching. - Na incubatie van secundair antilichaam, wassen met PBS-0.3T tweemaal voor 5 min, elk in RT. Image de monsters als een neutrale lipide vlek is niet gewenst. Als visualisatie van lipide druppels nodig met behulp van de neutrale lipide vlek, wassen met 1 x PBS (zonder niet-ionogene oppervlakteactieve stof) tweemaal, voor elke 5 min.
- Na de stappen wassen, incubeer met de vlek van de neutrale lipide verdund met 1:1500 verdunningsfactor in 1 x PBS gedurende 30 min. in RT. De weefsels zijn nu klaar voor microscopie. Voor toekomstige beeldvorming, kunnen de weefsels worden opgeslagen in deze oplossing in 4 ° C.
Opmerking: Imaging kwaliteit vermindert na verloop van tijd; Daarom is de beste tijd voor imaging binnen 1 of 2 dagen. - Met behulp van Tang, leg het weefsel plat op een 24 x 60 mm² glas dekglaasje aan en plaats deze op een omgekeerde confocal microscoop lasersysteem.
- Als de kleuring van de kernen met DAPI is gewenst, voeg 1-2 druppels montage medium dat DAPI om volledig onderdompelen het weefsel en te voorkomen dat het drogen.
- Uitvoeren om te halen beelden van geheel-mount bevlekt weefsels op meerdere focal vlakken, Z-stacks van 100 – 150 μm in de diepte met 4 – 6 μm stap-grootte op de gewenste vergroting.
3. de weefsels Clearing- en Immunolabeling gebruikt iDISCO +
Opmerking: Dit protocol is gebaseerd op eerder gepubliceerde procedures9,10,19.
- Fixatie en methanol voorbehandeling
- Incubeer de weefsels in 4% PFA verdund in 1 x PBS bij 4° C's nachts in 2 mL microcentrifuge buizen.
Opmerking: Laat de weefsels in de buizen 2 mL voor alle van de volgende behandelingen tot imaging. - De volgende dag, spoel de weefsels in 1 x PBS driemaal, gedurende 1 uur op een shaker op RT.
Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken het monster 's nachts bij RT of 4 ° C. - Uitdrogen van de weefsels op RT in 20%, 40%, 60% en 80% methanol, vervolgens voor elk 1U. Dehydrateren in 100% methanol op RT voor 1 uur, vervolgens de weefsels overbrengen in vers 100% methanol en Incubeer bij 4 C gedurende 1 uur.
Opmerking: Verdunde methanol in gedestilleerd water. Tijdens methanol incubatie is er geen behoefte om monsters op een shaker, zolang de weefselmonsters worden ondergedompeld.
Let op: Deze stap is gevaarlijk, zoals methanol giftig is. Het is ontvlambaar bij open vlammen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast. Bewaar de methanol uit de buurt van ontsteking en in een brandbare veiligheidskast. - De weefsels met 5% waterstof peroxide (H2O2; 1 volume van 30% H2O2 verdund in 5 volumes van 100% methanol) 's nachts bleekmiddel bij 4 ° C.
Let op: 30% waterstofperoxide is zeer gevaarlijk bij huid- en oogcontact. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast. - Hydrateren de weefsels op RT in 80%, 60%, 40% en 20% methanol en 1 x PBS, vervolgens voor elk 1 uur.
- Wassen met 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof verdund in 1 x PBS twee keer, voor 1 h op een shaker op RT.
- Incubeer de weefsels in 4% PFA verdund in 1 x PBS bij 4° C's nachts in 2 mL microcentrifuge buizen.
- Immunolabeling
Opmerking: Vul de 2 mL buisjes met het weefsel naar de top van de buis met de oplossing die in elke stap wordt gebruikt om te voorkomen dat weefsel oxidatie zodra immunolabeling begint, totdat clearing is voltooid.- Permeabilize de weefsels door ze aan het broeden in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof, 20% dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,3 M glycine bij 37 ° C op een roteerschudapparaat uit bebroede-tafelblad voor 2 dagen.
Opmerking: De maximale incubatietijd voor 37 ° C permeabilization stap is 2 dagen. - Het blokkeren van de weefsels in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof, 10% DMSO, 5% ezel serum en 1% Fc blok bij 37 ° C op een roteerschudapparaat uit bebroede-tafelblad voor 2 dagen.
Opmerking: De maximale incubatietijd voor de blokkerende stap is 2 dagen. - Incubeer de weefsels in primaire antilichamen van belang in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20, 10 µg/mL heparine, 5% DMSO en 5% ezel serum bij 37 ° C op een bebroede tafelblad roteerschudapparaat voor 4 dagen.
- Wassen met 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20 en 10 µg Fe/mL heparine in een roteerapparaat bij RT vijfmaal, elk gedurende 1 uur.
Opmerking: Deze stap kan zijn een punt van de pauze om te laten van monsters overnachten in RT. - Incubeer weefsels met secundair antilichaam in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20, 10 µg/mL heparine, en 5% ezel serum bij 37 ° C op een tafelblad roteerschudapparaat voor 4 dagen.
Opmerking: Vanaf stap 3.2.5, alle monsters moeten worden omwikkeld met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van secundair antilichaam. - Wassen van weefsels in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% Polysorbaat 20 en 10 µg Fe/mL heparine op een shaker in RT vijfmaal, voor elke 2 h.
Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken van de monsters 's nachts op RT.
- Permeabilize de weefsels door ze aan het broeden in een oplossing van 1 x PBS, 0,2% nonionic oppervlakteactieve stof, 20% dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,3 M glycine bij 37 ° C op een roteerschudapparaat uit bebroede-tafelblad voor 2 dagen.
- Weefsel ruimen van witte vetweefsel en volume imaging
- Uitdrogen van de weefsels opgenomen in 2 mL buizen door broeden in 20%, 40%, 60% en 80% methanol, vervolgens, elk gedurende 1 uur op RT. Vervolgens het uitdrogen van de monsters in 100% methanol tweemaal op RT.
Opmerking: Deze stap kan worden een onderbreken punt om te vertrekken uw monsters in 100% methanol's nachts op RT. - Incubeer de weefsels met een mengsel van 2 delen van DCM 1 volume van methanol gedurende 3 uur bij RT op een shaker.
Opmerking: DCM is vluchtig. Zorg ervoor dat de buizen zijn strak verzegeld om te voorkomen dat de verdamping.
Let op: Deze stap is gevaarlijk. DCM is giftig bij inademing. Langdurige blootstelling kan potentieel veroorzaken chemische brandwonden. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, schoeisel, veiligheidsbril). Gebruik een zuurkast. - De weefsels in 100% DCM tweemaal, Incubeer gedurende 15 minuten op een shaker op RT.
- Incubeer in 100% DBE in RT tot beeldvorming en van de opslagcapaciteit van de steekproef. Omkeren voor imaging, meerdere malen op de buizen te mengen de oplossingen.
Opmerking: Vul volledig buizen met DBE ter voorkoming van oxidatie, die kan resulteren in een mislukte weefsel wissen. De buizen niet schudden tijdens DBE incubatie.
Let op: Deze stap is gevaarlijk. DBE is giftig. Het kan irritatie aan de ogen en de huid. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld nitril handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) en verwerken in een zuurkast. - Afbeelding het hele weefsel monster met een lichte Microscoop die overeenkomt met de brekingsindex van organische oplosmiddelen DBE. Presteren Z-stapelen op een gewenste vergrotingsfactor en de stap-grootte voor het hele weefsel.
- Uitdrogen van de weefsels opgenomen in 2 mL buizen door broeden in 20%, 40%, 60% en 80% methanol, vervolgens, elk gedurende 1 uur op RT. Vervolgens het uitdrogen van de monsters in 100% methanol tweemaal op RT.
4. voorbeelden van Data-analyse uit geheel-mount gekleurd weefsel beelden met behulp van ImageJ
Opmerking: Zie https://imageJ.nih.gov/ij/download.html voor download en installatie-instructies.
- Kwantificering van bloedvat dichtheid (aanvullende Figuur 2)
- De opgeslagen beelden van alleen het kanaal met bloedvat immunokleuring op ImageJ importeren.
Opmerking: De afbeeldingen voor de kwantificering moet consistent in termen van kleuring procedure en afbeelding overname voorwaarde. Identieke reagentia moeten worden gebruikt. De belichtingstijd, moet intensiteit en vergroting ook gelijkgesteld in de beeldvorming proces20. - De kleur van de afbeelding converteren naar zwart-wit voor bloedvat dichtheid kwantificering. Om dit te doen, onder tabblad "Afbeelding" , de "Aanpassen" -opdracht, dan de "kleurdrempel" -optie te selecteren. In de "drempel kleur" weergeven, kies "Donkere achtergrond"20 en selecteer "B & W" onder "drempel kleur".
- Voor het meten van het percentage van ruimte van bloedvat signaal tegen achtergrond, selecteer het tabblad "Analyseren" , vervolgens de opdracht "analyseren Particles" . Selecteer onder de display van de "geanalyseerd Particles", de "duidelijke resultaten" en "Samenvatten" opties. Klik op "OK".
- Kopieer en plak de waarde van het percentage gebied onder het tabblad Samenvatting in een spreadsheet voor analyse. Het percentage van ruimte geeft de dichtheid van het bloedvat. Herhaal de stappen 4.3.1–4.3.4 voor elke afzonderlijke afbeelding.
- De opgeslagen beelden van alleen het kanaal met bloedvat immunokleuring op ImageJ importeren.
- Kwantificering van adipocyte grootte21 (aanvullende Figuur 3)
- De opgeslagen beelden van de adipocytes op ImageJ importeren.
- Meet de lengte van de schaal in pixels door het traceren van de lijn naar de schaal met een bekende afstand op de afbeelding met het lineaire gereedschap stelt de schaal van de afbeelding. Onder het tabblad "Analyseren" door de "schaal instellen" opdracht te selecteren. De afstand van de lijn die is opgespoord voordat worden automatisch berekend in pixels.
- Er verschijnt in het display "schaal instellen" . Voer de bekende afstand en lengte-eenheid. Selecteer "Global" toe te passen van de schaal instellen voor alle geïmporteerde afbeeldingen en klik op "OK".
- Gebied als de methode van meting, onder het tabblad "Analyseren" Selecteer de opdracht "Set metingen" . Er verschijnt een lijst met verschillende opties voor metingen. Selecteer de optie "Ruimte" en klik "OK".
- Met het gereedschap freehand selecteren, traceren de omtrek van elke adipocyte van belang. Selecteer de opdracht "Maatregel (Ctrl + M)" onder het tabblad "Analyseren" en het gebied van de adipocyte zal verschijnen. Herhaal deze procedure voor andere adipocytes in de afbeelding.
Opmerking: Gebruik meerdere afbeeldingen om nauwkeurige metingen voor kwantificering. - Kopieer en plak de metingen van het gebied in een spreadsheet voor verdere gegevensanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als gevolg van de kwetsbaarheid van vetweefsel, kunnen methoden waarbij meerdere verwerking stappen en segmenteren leiden tot verminking van vetweefsel morfologie3 (figuur 1A). Echter kunt geheel-mount kleuring behouden de morfologie van adipocytes, zorgen voor nauwkeurige interpretatie van de resultaten (figuur 1B).
Overmatige fixatie van vetweefsel leidt tot fixeer-geïnduceerde autofluorescence. Zoals blijkt uit figuur 2A, overlappen groene en rode kanalen kleuring voor tyrosine hydroxylase (TH) en PECAM-1 signalen, respectievelijk, in dezelfde regio's van het weefsel, die aangeeft dat autofluorescence kan hebben plaatsgevonden als gevolg van overmatige fixatie in PFA voor 3 dagen. In tegenstelling, figuur 2B toont een representatief beeld van geheel-mount kleuring als goede fixatie wordt uitgevoerd, zoals het signaal voor TH kleuring gebeurt op verschillende terreinen ten opzichte van de PECAM-1 signaal, aan te tonen dat dit signaal is niet autofluorescence en is in feite een positief signaal.
Geheel-mount kleuring is een belangrijke visualisatie tool voor Cre-loxP-gebaseerde lineage tracering van adipocytes15, met mT/mG wordt de ideale reporter systeem18. Ng2, een marker voor adipocyte progenitor cel bevolking, is een plasmamembraan Proteoglycaan. In dit systeem cellen Ng2-Cre-positieve uitdrukkelijke m-GFP, overwegende dat m-tomaat wordt uitgedrukt in Ng2-Cre-negatieve cellen (Figuur 3).
Vetweefsel is een ongelooflijk dynamisch orgaan, kan uitbreiden en krimpen onder verschillende fysiologische voorwaarden en eisen20. Imaging geheel-mount gekleurd adipeus weefsel zorgt voor de kwantificering van imorphological wijzigingen onder verschillende experimentele omstandigheden. In het bijzonder adipeus weefsel is zeer gevacuoliseerd, dat is belangrijk in het bemiddelen van metabole homeostase op snelle veranderingen in energie niveau1. Bijvoorbeeld, C57BL/6J muizen die ondergaan 24u van vasten weergavegrootte aanzienlijk kleiner adipocyte (Figuur 4), met vermelding van de lipolyse, en een trend in verhoogde bloedvat dichtheid in vergelijking met voortdurend gevoed muizen (Figuur 5). ImageJ software werd gebruikt om te kwantificeren van de grootte van de adipocytes en de dichtheid van het bloedvat, zoals hierboven beschreven.
Weefsel wissen is een relatief nieuwe techniek ontwikkeld voor het verwijderen van de ondoorzichtigheid van vetweefsel dat visualisatie diep in het weefsel volume9,10 (Figuur 6). Geheel-mount kleuring op onontgonnen IWAT met behulp van de confocal microscopie alleen toonde sparse sympathiek innervatie arm, aangezien zenuwvezels onder het oppervlak van het weefsel niet kon worden gevisualiseerd (figuur 7A). Echter, dichte neurale arborization kon worden waargenomen na weefsel clearing- en immunolabeling met het gebruik van iDISCO +, evenals het gebruik van licht-blad fluorescent microscopie (LSFM) (figuur 7B).
Figuur 1: vergelijking van vetweefsel morfologie met conventionele morfologische technieken en geheel-mount kleuring techniek. (A) H & E gekleurd adipeus weefsel op een paraffine-ingebedde sectie (links), met zwarte pijlpunten die vervormde gebieden van adipocytes aangeeft. Lectine (koolhydraten bindende eiwit, witte pijlen) fluorescerende kleurstof injectie immunefluorescentie kleuring van F4/80 (macrophage marker, gele pijlpunten) en DAPI kernen kleuring van vetweefsel op cryosection (rechts). (B) witte vetweefsel visualisatie met behulp van geheel-mount kleuring met een stap-grootte van 5 μm. De totale diepte van de Z-stack gevangen is ongeveer 100 μm. Adipocyte lipide druppels werden gekleurd met neutrale lipide vlek (grijs), en bloedvaten waren bevlekt met PECAM-1. Opname werd gemaakt met microscopie met een stap-grootte van 5 μm voor Z-stapelen (rood). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: visualisatie van neurale vezels en bloedvaten met behulp van geheel-mount gekleurd adipeus weefsel. (A) representatieve microscopische afbeeldingen van de ongewenste resultaten van geheel-mount gekleurd PWAT als gevolg van overmatige fixatie in PFA voor 3 dagen. Overlappende signalen worden aangegeven door witte pijlpunten. (B) vertegenwoordiger microscopische beelden van een positieve uitkomst van geheel-mount gekleurd IWAT van controle muis. De beelden werden gevangen op 100 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Lineage tracering met behulp van mT/mG systeem in het adipeus weefsel. Vertegenwoordiger afbeeldingen Cre-positieve (mG) en Cre-negatief (mT) cellen in de IWAT van een Ng2-Cre; mT/mG muis. De beelden werden gevangen op 200 X vergroting. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: visualisatie en kwantificering van adipocyte grootte. (A) representatieve beelden van adipocytes in PWAT van de fed en 24-uurs snelste C57BL/6J muizen met behulp van neutrale lipide kleuring. De beelden werden gevangen op 200 x vergroting. (B) Adipocyte grootte vergelijking tussen gevoed en 24u snelste C57BL/6J muizen ImageJ softwarematig. Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SEM; 2-tailed ongepaarde Student t-test; p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: visualisatie en kwantificering van bloedvat dichtheid. (A) representatieve beelden van bloedvaten in fed en 24-uurs snelste C57BL/6J muizen met behulp van PECAM-1 antilichaam. (B) vergelijking van bloedvat dichtheid tussen gevoed en 24-uurs C57BL/6J muizen ImageJ softwarematig gevast. Waarden worden uitgedrukt als bedoel ± SEM; 2-tailed ongepaarde Student t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Clearing van vetweefsel met behulp van de methode iDISCO +. Voorafgaand aan het clearing is het weefsel ondoorzichtig. Het weefsel wordt volledig transparant aan het eind van het weefsel ontruimen stappen.
Figuur 7: Geheel-mount gekleurd IWAT vergeleken met weefsel-gewist IWAT methode iDISCO +. (A) visualisatie van neurale vezels met behulp van TH antilichaam (1:500) in geheel-mount gekleurd IWAT bij 100 x vergroting met confocale microscopie met een stap-grootte van 5 μm. De totale diepte van de Z-stack gevangen is ongeveer 100 μm. (B) visualisatie van neurale vezels met behulp van TH antilichaam (1:200) in geheel-mount gekleurd IWAT met iDISCO + protocol bij 1.6 X vergroting met behulp van LSFM met een stap-grootte van 4 μm. De totale diepte van de Z-stack gevangen is ongeveer 8 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 1: Schematisch diagram voor mT/mG lineage traceersysteem. Een dubbel fluorescerend systeem die gebruikmaakt van eGFP membraan-gerichte en membraan-gerichte tdTomato. Voordat Cre recombinatie, wordt wereldwijd de mT uitgedrukt. Wanneer de cel Cre spreekt, de mT-cassette is weggesneden en mG permanent wordt uitgedrukt. pA vertegenwoordigt polyadenylatie sequenties na de stop codon. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2: toepassing van ImageJ software te kwantificeren percentage bloedvat dichtheid inzake. (A) "Image" tabblad opdrachten en opties een afbeelding te zetten in een kleur zwart-drempel. (B) samenvatting meting van het percentage ruimte van schip dichtheid met behulp van de opdracht "Analyseren Particles". Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende figuur 3: toepassing van ImageJ software te kwantificeren gebied van adipocyte. "Analyseren" tab: "Stel schaal" en "Measurement" opdrachten voor het meten van het gebied van de adipocyte(s). Resultaten display toont het gebied van elke adipocyte gemeten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel conventionele technieken zoals histologie en cryosection voordelen bieden voor de observatie van intracellulaire structuur, biedt geheel-mount kleuring een ander perspectief in adipeus weefsel onderzoek, waarmee 3D-visualisatie van cellulaire architectuur van minimaal verwerkte weefsel.
Om het geheel-mount kleuring uitvoeren, moeten de volgende suggesties in aanmerking worden genomen. Verschillende adipeus weefsel depots kunnen verschillende immunokleuring resultaten opleveren; Dus, het soort adipeus weefsel depot gebruikt moet eerst worden vastgesteld. Bruin vetweefsel (BAT) is bijvoorbeeld dichtere ten opzichte van witte vetweefsel (WAT) als gevolg van kleinere, multilocular adipocytes21. Deze verhoogde dichtheid van BBT bemoeilijkt op antilichamen tegen het doordringen via het weefsel. Bovendien is de grootte van het vetweefsel is ook noodzakelijk voor goede antilichaam kleuring, omdat het te groot/dik weefsels kunnen ook leiden tot onvoldoende antilichaam penetratie. Vandaar, wanneer u het vetweefsel tijdens dierlijke dissectie, het distale gedeelte van het vetweefsel van de perigonadal moet worden gebruikt, aangezien dit de dunste regio is en voor voldoende antilichaam penetratie en consistente gegevens zorgen kan. Als alternatief voor dichtere weefsels kunnen gebruik van dezelfde fluorescerende verslaggever muis regel, zoals mT/mG, voor betere visualisatie van de markering van belang, aangezien dit het probleem van onvoldoende antilichaam penetratie voorkomt. Vervolgens 1% PFA wordt gebruikt voor fixatie van weefsel te behouden van de natuurlijke verspreiding van eiwitten en zorgen van weefsel permeabilization en antilichaam penetratie22,23. Echter kan overmatige fixatie verlagen antigeen erkenning en produceren van autofluorescence24. Dit is te wijten aan de reactie tussen aldehyde groepen op PFA, aldehyde-bevattende fixeer en andere weefsel componenten, waardoor fluorescerende verbindingen24. Om te voorkomen dat de behoefte aan een antigeen-ophalen stap, is het aanbevolen om weefsels laat in een fixatief voor slechts een uur bij kamertemperatuur en de volgende stappen begint zodra fixatie voltooide7 is. Net als vele andere technieken van de immunolabeling is titrating van de antilichaam-concentratie een essentiële stap om het gewenste signaal.
Inderdaad, er zijn verschillende beperkingen voor geheel-mount kleuring ondanks de bovengenoemde betekenis en de voordelen. Geheel-mount kleuring heeft strenge eisen met betrekking tot weefseltype en grootte, omdat onvoldoende antilichaam penetratie en ongelijke kleuring in dikkere weefsels zoals spieren en lever optreden kunnen. Ook is geheel-mount kleuring niet de meest accurate weergave van bepaalde antistoffen zoals tyrosine hydroxylase (TH), een marker voor het orthosympatisch zenuwstelsel, zoals zijn signaal wordt vaak gemaskeerd door dichte vetgehalte in adipeus weefsel (Figuur 7). Bovendien, uitdaging het oneffen oppervlak van vetweefsel ook een voor confocal denkbaar, omdat signalen gelegen op verschillende lagen van het vetweefsel kunnen niet gemakkelijk worden vastgelegd op een enkel beeld. Daarom is de kwantificering van signaalsterkte in beelden verkregen uit geheel-mount kleuring opbrengst inconsistente resultaten voor geheel-zenuw vezel arborization. Het distale gedeelte van PWAT is meestal de minste lipide-dichte; Vandaar, betere beelden kunnen worden verkregen vanuit dit gebied. Echter, of dit gebied vertegenwoordiger van de gehele weefsel voor immunokleuring in alle types van antilichamen is vergt verder onderzoek.
Weefsel optisch door doorzichtig te maken, vermindert een clearing methode verstrooiing van licht, waardoor de visualisatie van de diepe structuur25. iDISCO + is dat een goedkope protocol onlangs ontwikkeld dat combineert geheel-mount immunolabeling met volume beeldvorming van verschillende grote gewiste weefsels9. Gewijzigde iDISCO + methoden met blijkt uit recente studies9,10 LSFM waargenomen dichte dendritische arborization op WAT die met conventionele immunolabeling en confocale microscopie kan worden waargenomen. Conventionele confocal imaging gebruikt een imaging systeem van de lichtbundel en pinhole voor laser scannen. De scansnelheid en doordringende diepte zijn beperkingen van de Microscoop; 3D weefsel dynamiek zijn dus vaak gemist. Daarentegen heeft licht vel microscopie duidelijk voordelen in dat het gebruikt vel-scannen en alleen één optische sectie tegelijk verlicht, vastleggen van alle van de fluorescentie moleculen binnen dat gedeelte. Bovendien zijn fluorophores in andere secties niet enthousiast, foto-bleken en fototoxische effecten26voorkomen. Dus, het bedrag van de innervatie van de zenuw arm binnen het vetweefsel kan nauwkeuriger worden beoordeeld met iDISCO + en LSFM. Ondanks dit zijn er enkele beperkingen aan het gebruik van iDISCO + en LSFM. Bijvoorbeeld, is gebruikers moeten er rekening mee dat alleen kanalen in het rood en far-red kanaal compatibel met iDISCO +, zijn omdat langere golflengten van licht zijn beter in staat de monster27doordringen. Bovendien, is autofluorescence in het blauw-groene spectrum vrij hoog in grote weefselsteekproeven, dus beeldvorming in de spectra rood en far-red zal helpen verminderen van elke autofluorescence die plaatsvindt van14. Met betrekking tot de transgene fluorescerende reporter muizen, kan iDISCO + worden gebruikt om te visualiseren verslaggever eiwitten. Echter moet immunolabeling van de fluorescerende verslaggever met een secundair antilichaam worden uitgevoerd, zoals het endogene signaal kan vervagen tijdens het weefsel clearing proces14. Deze techniek is evenwel uiterst waardevol voor de studie van sympathische zenuwstelsel-adipeus weefsel interacties en voor het onderzoek van obesitas plasticiteit onder verschillende fysiologische en metabolische voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Raad (NSERC) van Canada, Pilot en haalbaarheid studie Grant Banting & beste Diabetes centrum (BBDC), het startfonds SickKids aan H-K. S., medische Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van wetenschap, ICT en toekomst van plan om J-R.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
- Sung, H. K. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17, 61-72 (2013).
- Greenberg, A. S., Obin, M. S. Obesity and the role of adipose tissue in inflammation and metabolism. American Journal of Clinical Nutrition. 83, 461-465 (2006).
- Martinez-Santibañez, G., Cho, K. W., Lumeng, C. N. Imaging White Adipose Tissue With Confocal Microscopy. Methods in Enzymology. 537, 17-30 (2014).
- Laforest, S. Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk. Obesity (Silver Spring, MD). 25 (1), 122-131 (2017).
- Berry, R.
- Kim, K. H. Intermittent fasting promotes adipose thermogenesis and metabolic homeostasis via VEGF-mediated alternative activation of macrophage. Cell Research. 27 (11), 1309-1326 (2017).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Lee, J. H., Yeganeh, A., Konoeda, H., Moon, J. H., Sung, H. K. Flow Cytometry and Lineage Tracing Study for Identification of Adipocyte Precursor Cell (APC) Populations. Methods in Molecular Biology. 1752, 111-121 (2018).
- Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation. in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
- Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
- Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Molecular Metabolism. , (2018).
- Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Whole-tissue 3D imaging reveals intra-adipose sympathetic plasticity regulated by NGF-TrkA signal in cold-induced beiging. Protein & Cell. 9 (6), 527-539 (2018).
- Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
- Vorhagen, S., et al. Lineage tracing mediated by cre-recombinase activity. Journal of Investigative Dermatology. 135 (1), 1-4 (2015).
- Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Method, D. W. iDISCO+ protocol. , Available from: https://www.idiscodotinfo.files.wordpress.com/2015/04/whole-mount-staining-bench-protocol-methanol-dec-2016.pdf (2016).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. The Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Papadopulos, F., et al. Common tasks in microscopic and ultrastructural image analysis using ImageJ. Ultrastructural Pathology. 31 (6), 401-407 (2007).
- Abcam. Whole-mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from: http://docs.abcam.com/pdf/protocols/Whole_mount_fluorescent_ihc.pdf (2018).
- Stanly, T. A., et al. Critical importance of appropriate fixation conditions for faithful imaging of receptor microclusters. Biology Open. 5 (9), 1343-1350 (2016).
- UHN. Autofluorescence: Causes and Cures. , Available from: http://wwwfacilities.uhnresearch.ca/wcif/PDF/Autofluorescence.pdf (2018).
- Spalteholz, W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. , (1914).
- Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
