Summary
El objetivo del presente estudio es demostrar la técnica de inmunotinción y visualización de conjunto de montaje como un método ideal para la proyección de imagen 3D del componente celular y arquitectura de tejido adiposo.
Abstract
Tejido adiposo es un órgano metabólico importante con alta plasticidad y responde a estímulos ambientales y estado nutricional. Como tal, han desarrollado varias técnicas para estudiar la morfología y la biología del tejido adiposo. Sin embargo, métodos de visualización convencionales se limitan a estudiar el tejido en secciones 2D, pudiendo capturar la arquitectura 3D del órgano entero. Aquí presentamos el conjunto de montaje coloración, un método de inmunohistoquímica que conserva intacto el tejido adiposo morfología con pasos de proceso mínima. Por lo tanto, se mantienen las estructuras de los adipocitos y otros componentes celulares sin distorsión, lograr la visualización 3D más representativa del tejido. Además, Monte toda la coloración se puede combinar con métodos de rastreo de linaje para determinar las decisiones de destino celular. Sin embargo, esta técnica tiene algunas limitaciones para proporcionar información precisa con respecto a partes más profundas del tejido adiposo. Para superar esta limitación, todo Monte tinción más combinables con técnicas para eliminar la opacidad del tejido y permitir la visualización completa de la anatomía de todo el tejido adiposo mediante microscopía fluorescente luz-hoja de limpieza del tejido. Por lo tanto, una mayor resolución y una representación más precisa de las estructuras de tejido adiposo pueden ser capturados con la combinación de estas técnicas.
Introduction
Tejido adiposo es un órgano esencial para el almacenamiento de energía y se caracteriza por remodelación dinámica y expansión casi ilimitada1. Además de homeostasis de energía, el tejido adiposo también juega un papel esencial en la secreción de la hormona de más de 50 adipokines para modular la función metabólica de todo el cuerpo2. El tejido adiposo tiene una arquitectura diversa que consta de diversos tipos celulares como adipocitos maduros, fibroblastos, células endoteliales, células inmunes y adipocito progenitoras células3. Estudios recientes han demostrado que la obesidad y otra disfunción metabólica pueden alterar significativamente la función del tejido adiposo y su microambiente, que incluye pero no se limita a la ampliación de los adipocitos, infiltración de células inflamatorias (por ejemplo, los macrófagos) y disfunción vascular3.
Técnicas morfológicas convencionales como la histología y cryosectioning demuestran varias limitaciones en el estudio de Biología adiposo como pasos largos procesos químicos, que puede conducir a tejido estructura y contracción distorsión3, 4. Además, estas técnicas 2D son insuficientes para observar las interacciones intercelulares ejercidas por diversos tipos celulares, como las secciones obtenidas se limitan a regiones más pequeñas del tejido entero3. Métodos en comparación con convencional de imágenes fluorescentes, todo montaje coloración no requiere de otras medidas invasivas, como inclusión, seccionamiento y deshidratación; por lo tanto, esto evita el problema de disminuir la especificidad del anticuerpo. Como tal, es un método sencillo y eficaz para la proyección de imagen el tejido adiposo, con mejor preservación de la morfología de los adipocitos y de estructura de tejido adiposo total5. Por lo tanto, todo montaje de tinción como una técnica rápida y barata de la inmunomarcación fue establecida para preservar tejido adiposo arquitectura 3D1,6,7,8.
Sin embargo, a pesar de la preservación de la morfología del tejido adiposo con el uso de tinción montaje en conjunto, esta técnica es todavía incapaz de visualizar estructuras internas, debajo de la superficie lipídica de los tejidos. Varios recientes estudios9,10 han creado tejido claro técnicas combinadas con inmunomarcación conjunto montaje1,6 para permitir la visualización completa en 3D dentro del tejido adiposo. En particular, redes neuronales y vasculatura densas fueron visualizadas en reciente estudios9,10,11,12 con la proyección de imagen de volumen 3D. De hecho, estudiando la plasticidad neural y vascular del tejido adiposo en diferentes condiciones fisiológicas es esencial para el estudio de su biología. Proyección de imagen tridimensional de inmunomarcación compatible de claro de tejido de órganos despejó de solvente (iDISCO +) es un proceso compuesto por tratamiento previo de metanol, inmunomarcación y claro de opacidad tejido con reactivos químicos orgánicos diclorometano (DCM ) y dibencilo éter (DBE)13,14. Haciendo que el tejido adiposo totalmente transparente, puede obtenerse una representación más precisa de la anatomía dentro de los tejidos como vasos sanguíneos y fibras nerviosas9,10. IDISCO + tiene ventajas en que es compatible con varios anticuerpos y Reporteros fluorescentes11,14, y se ha demostrado éxito en múltiples órganos y embryoes hasta14. Sin embargo, su principal limitación es un tiempo de incubación, en el que 18 a 20 días se necesitan para completar todo el experimento.
Otra aplicación importante de montaje conjunto de tinción es la visualización del destino celular en combinación con un sistema de rastreo de linaje. Seguimiento del linaje es el etiquetado de un gen/marcador específico en una celda que puede transmitirse a todas las células de la hija y se conserva largo tiempo15. Como tal, es una poderosa herramienta que puede utilizarse para determinar el destino de la progenie de una célula15. Desde la década de 1990, sistema Cre-LoxP recombinante se ha convertido en un poderoso enfoque para seguimiento del linaje en la vida de los organismos15. Cuando una línea de ratón que expresa Cre, una enzima recombinase de ADN, se cruza con otra línea de ratón expresan un reportero que es adyacente a una secuencia loxP-parada-loxP, la proteína reportera es expresado15.
Para la tinción de todo montaje, el uso de fluorescentes reporteros multicoloras es adecuado para la proyección de imagen del tejido adiposo porque permite la interferencia mínima con actividades intracelulares del adipocito16. Sin embargo, reporteros tradicionales típicamente manchan el citoplasma, lo que es difícil rastrear el linaje de los adipocitos blancos, que tienen un limitado contenido citoplásmico17. Para superar este problema, el uso del marcador de membrana membrana tdTomato fluorescente eGFP (mT/mG) reporter es una herramienta ideal. Orientada a la membrana tdTomato se expresa en Cre-negativo células18. Sobre supresión de Cre, un interruptor para la expresión de eGFP orientada a la membrana se produce, lo que este reportero adecuado para rastrear el linaje del adipocito progenitores17,18 (Complementario de la figura 1).
El propósito de este trabajo es proporcionar un protocolo detallado para montaje en conjunto tinción y mostrar cómo se puede combinar con otras técnicas para estudiar el desarrollo y la fisiología del tejido adiposo. Dos ejemplos de aplicaciones descritas en este protocolo son su uso con líneas de ratón reportero 1) multicolor para identificar los distintos orígenes de los adipocitos y 2) tejido claro para visualizar más la arborización neuronal en el tejido adiposo blanco (WAT).
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Protocol
Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal del centro para Phenogenomics (TCP) se ajustó a las normas del Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal. Ratones fueron mantenidos en ciclos de luz/oscuridad de 12-h y con libre acceso a agua y alimentos. 7 meses viejos ratones machos C57BL/6J se utilizaron en el experimento de tinción montaje en conjunto.
Nota: Las secciones 1 y 2 están en orden cronológico, con la sección 3 es un paso opcional justo después de la sección 1. Sección 4 puede realizarse para analizar la densidad de tamaño y los vasos sanguíneos de adipocitos después de la terminación de la sección 2.
1. materiales preparación y aislamiento de tejido
- Preparar el fresco 1% paraformaldehido (PFA) diluida en 1 x de tampón fosfato salino (PBS) para la fijación del tejido. Preparar los 0,3% surfactante no iónico diluido en PBS 1 x (en lo sucesivo como PBS-0.3T) para el tejido subsecuente pasos de lavado.
Nota: Para cada tejido, preparar aproximadamente 1,5 mL de 1% PFA para garantizar una inmersión completa. Volumen de fijación puede aumentarse o disminuirse dependiendo del tamaño del tejido.
Atención: Este paso es peligroso, como PFA es corrosivo y tóxico. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad) y la manija en una campana de humos. - Eutanasia de animales siguiendo un procedimiento aprobado (p. ej., dislocación cervical o asfixia dióxido de carbono). Sin demora, disecar el tejido adiposo deseado depósitos (p. ej., tejido adiposo blanco inguinal o perigonadal blanco el tejido adiposo)18.
- Con tijeras de disección, cortar el tejido en un 100 x 15 mm2 caja de Petri en trozos de aproximadamente 0,5 – 1 cm de tamaño y sumergirlos en tubos de microcentrífuga con 1% PFA. Mantener en hielo.
2. whole-mount tinción de tejido adiposo blanco
- Una vez completada la disección, mover las muestras de tejido en 1% PFA del hielo a temperatura (RT) por 1 h y luego se transfieren los tejidos a una placa de cultivo celular 12 o 24 pocillos para el lavado más rápido.
- Lavar los tejidos con PBS-0.3T, 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT en un agitador inclinado a 22 º, con inclinaciones de 20 a 25 por minuto como la velocidad.
Nota: Utilice esta inclinación y la velocidad para todos los pasos posteriores que implican el uso de una coctelera.
Nota: Si utiliza una línea de ratón multicolor reportero como mT/mG y adicional anticuerpos no es necesario, el tejido está listo para microscopía tras el paso 2.2. - Agregar 0,5 a 1 mL de tampón de bloqueo (5% de suero animal diluido en PBS-0.3T). Poner la placa en la coctelera e incubar durante 1 h en RT
- Aspire la solución de bloqueo y añadir anticuerpos primarios diluidos en PBS-0.3T con 1% de suero de animales.
- Coloque el plato en un agitador a 4 ° C durante la noche.
- Al día siguiente, lavar los tejidos con PBS-0.3T 3 veces durante 5 minutos cada uno en RT
- Uso de anticuerpos secundarios apropiados diluidos en PBS-0.3T. Añadir 0,5 – 1 soluciones de anticuerpo secundario de mL en cada pocillo. Envolver la placa en papel de aluminio e incubar en un agitador durante 1 hora a TA.
Nota: Diluir el anticuerpo secundario en la oscuridad para evitar el fotoblanqueo. - Después de la incubación del anticuerpo secundario, lavar con PBS-0.3T dos veces durante 5 minutos, cada uno en RT. las muestras de la imagen si no se desea una tinción de lípidos neutros. Si la visualización de las gotitas de lípidos es necesaria utilizando el lípido neutral mancha, lavado con PBS 1 x (sin tensioactivo no iónico) dos veces, 5 minutos cada uno.
- Tras los pasos de lavado, incubar con la mancha de lípido neutral diluida con 1:1500 factor de dilución en PBS 1 x durante 30 min en RT Los tejidos están ahora preparados para microscopía. Para la proyección de imagen de futuro, los tejidos pueden almacenarse en esta solución a 4 ° C.
Nota: Calidad de imagen disminuye con el tiempo; por lo tanto, la mejor época para la proyección de imagen es dentro de 1 o 2 días. - Utilizando pinzas, coloque el tejido en un cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm² y colóquelo en un sistema del microscopio láser confocal invertido.
- Si la coloración de los núcleos con DAPI se desea, agregar 1-2 gotas de medio de montaje con DAPI para sumergir el tejido completamente y evitar que se resequen.
- Para obtener imágenes de montaje todo manchado de los tejidos en varios planos focales, realizar Z-pilas de 100 – 150 μm en profundidad con 4 – 6 μm tamaño de paso en el aumento deseado.
3. tejido claro e inmunomarcación utilizando iDISCO +
Nota: Este protocolo se basa en los procedimientos anteriormente publicados en9,10,19.
- Fijación y tratamiento previo de metanol
- Incubar los tejidos en el 4% PFA diluido en PBS 1 x a 4° C durante la noche en tubos de microcentrífuga de 2 mL.
Nota: Deje los tejidos en los tubos de 2 mL para los siguientes tratamientos hasta la proyección de imagen. - Al día siguiente, lavar los tejidos en PBS 1 x tres veces, durante 1 hora en un agitador a TA.
Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar la muestra durante la noche en RT o 4 ° C. - Deshidratar los tejidos en RT en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, durante 1 hora. Deshidratar en metanol al 100% a temperatura ambiente durante 1 hora, luego transferir los tejidos frescos 100% metanol e incubar a 4 ° C durante 1 hora.
Nota: Metanol diluido en agua destilada. Durante la incubación de metanol, no hay necesidad para poner las muestras en un agitador como se sumergen las muestras de tejido.
Atención: Este paso es peligroso, como el metanol es tóxico. Es altamente inflamable en llamas. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos. Almacenar el metanol de encendido y en un gabinete de seguridad inflamable. - Blanquear los tejidos con 5% de peróxido de hidrógeno (H2O2; 1 volumen de 30% H2O2 diluido en 5 volúmenes de metanol 100%) durante la noche a 4 ° C.
PRECAUCIÓN: el peróxido de hidrógeno 30% es muy peligroso en la piel y contacto con los ojos. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos. - Rehidratar los tejidos en RT en 80%, 60%, 40% y 20% de metanol y 1 x PBS, posteriormente, durante 1 hora.
- Lavado con surfactante no iónico 0,2% diluido en 1 x PBS dos veces, durante 1 hora en un agitador a TA.
- Incubar los tejidos en el 4% PFA diluido en PBS 1 x a 4° C durante la noche en tubos de microcentrífuga de 2 mL.
- Inmunomarcación
Nota: Llenar los tubos de 2 mL que contiene el tejido de la parte superior del tubo con la solución utilizada en cada paso para evitar la oxidación de tejido como inmunomarcación comienza, hasta que claro se ha completado.- Permeabilizar los tejidos por los de incubación en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) y glicina de 0.3 M a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días.
Nota: El tiempo de incubación máximo para paso de permeabilización de 37 ° C es de 2 días. - Bloquear los tejidos en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 10% DMSO, suero burro 5% y 1% Fc bloque a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días.
Nota: El tiempo de incubación máximo para el paso de bloqueo es de 2 días. - Incubar los tejidos en anticuerpos primarios de interés en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, 10 μg/mL heparina, DMSO 5% y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 4 días.
- Lave con 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 de μg/mL heparina, en un agitador a temperatura ambiente cinco veces, cada uno por 1 h.
Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche en RT - Incubar anticuerpo secundario en una solución de PBS 1 x, 0.2% polisorbato 20, de los tejidos 10 μg/mL heparina y 5% de suero de burro a 37 ° C en un agitador orbital mesa durante 4 días.
Nota: De paso 3.2.5, todas las muestras necesitan ser envueltos con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de anticuerpo secundario. - Lavar los tejidos en una solución de 1 x PBS, 0.2% polisorbato 20 y 10 heparina μg/mL en un agitador en RT cinco veces, por 2 h.
Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar las muestras durante la noche a TA.
- Permeabilizar los tejidos por los de incubación en una solución de 1 x PBS, surfactante no iónico 0,2%, 20% de dimetilsulfóxido (DMSO) y glicina de 0.3 M a 37 ° C en un agitador orbital mesa incubado durante 2 días.
- Tejido de tejido adiposo blanco y la proyección de imagen de volumen
- Deshidratar los tejidos contenidos en tubos de 2 mL por incubación en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, cada uno durante 1 hora a TA. Entonces, deshidratan las muestras en metanol al 100% dos veces a TA.
Nota: Este paso puede ser un punto de pausa para dejar sus muestras en metanol al 100% durante la noche a TA. - Incubar los tejidos con una mezcla de 2 volúmenes de DCM a 1 volumen de metanol durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador.
Nota: DCM es volátil. Asegúrese de que los tubos están sellados herméticamente para evitar la evaporación.
Atención: Este paso es peligroso. DCM es tóxico por inhalación. La exposición prolongada puede causar quemaduras químicas. Use equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata de laboratorio, calzado, gafas de seguridad). Utilizar una campana de humos. - Incubar dos veces, los tejidos en DCM de 100% durante 15 min en un agitador a TA.
- Incubar a 100% DBE en RT hasta la proyección de imagen y para el almacenamiento de la muestra. Antes de la proyección de imagen, invertir los tubos varias veces para mezclar las soluciones.
Nota: Llene completamente los tubos con DBE para evitar la oxidación, que puede resultar en tejido claro. No agite los tubos durante la incubación de DBE.
Atención: Este paso es peligroso. DBE es tóxico. Puede causar irritación a los ojos y la piel. Usar equipo de protección personal (p. ej., guantes de nitrilo, bata, gafas de seguridad) y el mango en una campana de humos. - Imagen de la muestra de todo tejido con un microscopio de luz que coincida con el índice de refracción de DBE solvente orgánico. Realizar apilamiento Z aumento deseado y el tamaño de paso para el tejido entero.
- Deshidratar los tejidos contenidos en tubos de 2 mL por incubación en 20%, 40%, 60% y 80% metanol, posteriormente, cada uno durante 1 hora a TA. Entonces, deshidratan las muestras en metanol al 100% dos veces a TA.
4. ejemplos de análisis de datos de Whole-mount mancharon tejido imágenes con ImageJ
Nota: Vea https://imageJ.nih.gov/ij/download.html para instrucciones de descarga e instalación.
- Cuantificación de la densidad de vasos sanguíneos ( figura 2de lacomplementaria )
- Importar las imágenes guardadas del solo canal con inmunotinción de vasos sanguíneos en ImageJ.
Nota: Las imágenes de cuantificación deben ser coherentes en términos de procedimiento de tinción y la condición de adquisición de imagen. Deben utilizarse reactivos idénticos. El tiempo de exposición, intensidad y la ampliación también deberían ser equivalente en la proyección de imagen de proceso20. - Convertir el color de la imagen en blanco y negro para la cuantificación de densidad de los vasos sanguíneos. Para ello, en la pestaña "Imagen" , seleccione el comando de "Ajuste" , entonces la opción de "umbral de Color" . En el "umbral de Color" Mostrar cuadro, seleccione "Fondo oscuro"20 y seleccione "B & W" bajo el "umbral de Color".
- Para medir el porcentaje de área de la señal de los vasos sanguíneos contra el fondo, seleccione la pestaña de "Analizar" , luego el comando "analizar partículas" . En la pantalla de "partículas analizadas", seleccione las opciones "Borrar resultados" y "Resumir" . Haga clic en "Aceptar".
- Copie y pegue el valor de la zona de porcentaje en la ficha Resumen en una hoja de cálculo para el análisis. El porcentaje de área indicará la densidad de los vasos sanguíneos. Repita los pasos 4.3.1–4.3.4 para cada imagen individual.
- Importar las imágenes guardadas del solo canal con inmunotinción de vasos sanguíneos en ImageJ.
- Cuantificación del adipocito tamaño21 (suplementario figura 3)
- Importar las imágenes guardadas de los adipocitos en ImageJ.
- Para establecer la escala de la imagen, mida la longitud de la escala en pixeles trazando una línea a la escala con una distancia conocida en la imagen usando la herramienta de selección lineal. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Set Scale" . La distancia de la línea que trazó ante se calcularán automáticamente en píxeles.
- Aparece el cuadro de pantalla "establecer escala" . Entrar en la unidad de longitud y distancia conocida. Seleccionar "Global" para aplicar la escala para todas las imágenes importadas y haga clic en "Aceptar".
- Para elegir el área como el método de medición, en la pestaña de "Analizar" Seleccione el comando de "establecer medidas" . Aparecerá una lista de opciones diferentes para las mediciones. Seleccione la opción de "Zona" y haga clic en "Aceptar".
- Con la herramienta Selección a mano alzada, trazar el perímetro de cada adipocito de interés. En la pestaña de "Analizar" , seleccione el comando "Medida (Ctrl + M)" , y aparecerá en el área de los adipocitos. Repita este procedimiento para otros adipocitos en la imagen.
Nota: Para garantizar mediciones precisas, utilizar varias imágenes para la cuantificación. - Copie y pegue las mediciones de área en una hoja de cálculo para mayor análisis de los datos.
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Representative Results
Debido a la fragilidad del tejido adiposo, métodos que implican varios pasos de procesamiento y seccionamiento pueden llevar a la desfiguración de tejido adiposo morfología3 (figura 1A). Sin embargo, el conjunto montaje coloración puede conservar la morfología de los adipocitos, garantizar la precisa interpretación de los resultados (figura 1B).
Fijación excesiva de tejido adiposo lleva a autofluorescence fijador-inducida. Como se muestra en la figura 2A, los canales verdes y rojos para tirosina hidroxilasa (TH) y señales de PECAM-1, respectivamente, se superponen en regiones idénticas del tejido, indicando que autofluorescencia puede haber ocurrido debido a la excesiva fijación en PFA durante 3 días. En cambio, figura 2B muestra una imagen representativa del todo-Monte de tinción cuando se realiza la fijación adecuada, como la señal para la tinción de TH se produce en las diferentes áreas en relación con la señal de PECAM-1, demostrando que esta señal no es Autofluorescencia y de hecho es una señal positiva.
Conjunto montaje coloración es una herramienta de visualización importante seguimiento basadas en Cre-loxP linaje de los adipocitos15, siendo el sistema ideal reportero de18mT/mg. Ng2, un marcador para la población de células progenitoras adipocito, es un proteoglicano de la membrana plasmática. En este sistema, Ng2-Cre-positive células expresa m-GFP, mientras que m-tomate se expresa en las células Ng2-Cre-negativas (figura 3).
Tejido adiposo es un órgano muy dinámico, capaz de expansión y contracción bajo diferentes fisiológico las condiciones y demandas20. Imagen montaje conjunto manchado tejido adiposo permite la cuantificación de los cambios de imorphological bajo diferentes condiciones experimentales. En particular, el tejido adiposo es vascularizado muy, que es importante en la mediación de la homeostasis metabólica sobre rápidos cambios en el nivel de energía1. Por ejemplo, ratones C57BL/6J que 24 h de ayuno pantalla significativamente más pequeño tamaño del adipocito (figura 4), indicando la lipolisis, y una tendencia en la densidad de vasos sanguíneos elevados comparado continuamente alimentados con ratones (figura 5). Software ImageJ fue utilizado para cuantificar el tamaño de los adipocitos y la densidad de vasos sanguíneos, como se describe anteriormente.
Claro el tejido es una técnica relativamente nueva desarrollada para eliminar la opacidad del tejido adiposo para permitir una visualización profunda en el tejido volumen9,10 (figura 6). Conjunto montaje coloración en pendientes IWAT usando microscopia confocal sólo mostró escasa inervación simpática, ya que no podría visualizar fibras nerviosas debajo de la superficie del tejido (Figura 7A). Sin embargo, se pudo observar la densa arborización neuronal después de tejido claro y de inmunomarcación con el uso de iDISCO + así como el uso de la hoja de luz microscopia fluorescente (LSFM) (figura 7B).
Figura 1: comparación de la morfología del tejido adiposo con técnicas morfológicas convencionales y técnica de maquillaje conjunto Monte. (A) H & E tinción de tejido adiposo en una sección de parafina-encajado (izquierda), con puntas de flecha negras que indica regiones distorsionadas de los adipocitos. Fluorescente de lectinas (hidratos de carbono vinculante proteínas blanco las flechas) tinte inyección, tinción inmunofluorescente de F4/80 (marcador de macrófagos, puntas de flecha amarillas) y DAPI núcleos tinción de tejido adiposo en criosección (derecha). Visualización de tejido adiposo blanco (B) mediante tinción de montaje en conjunto con un tamaño de paso de 5 μm. La profundidad de Z-stack total capturada es de alrededor de 100 μm. Gotitas de lípidos de adipocitos fueron teñidas con tinción de lípidos neutros (gris), y los vasos sanguíneos fueron teñidos con PECAM-1. Imagen fue capturada con microscopía con un tamaño de paso de 5 μm para apilar Z (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: visualización de las fibras nerviosas y vasos sanguíneos por todo montaje teñido tejido adiposo. (A) imágenes microscópicas representativas de resultados no deseados de PWAT manchada todo montaje debido a la excesiva fijación en PFA durante 3 días. Puntas de flecha blancas indican señales superpuestas. (B) imágenes microscópicas representativas de un resultado positivo del conjunto de montaje habían teñido IWAT de control del ratón. Las imágenes fueron capturadas en 100 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Seguimiento de linaje con sistema mT/mG en el tejido adiposo. Representante imágenes Cre-positivo (mG) y las células de la Cre-negativo (mT) en IWAT de un Ng2-Cre; ratón de mT/mG. Las imágenes fueron captadas con 200 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: visualización y cuantificación del tamaño del adipocito. (A) imágenes representativas de los adipocitos en PWAT de fed y 24 horas ayunas ratones C57BL/6J utilizando tinción de lípidos neutros. Las imágenes fueron captadas con 200 aumentos. El tamaño de adipocitos (B) comparación entre alimentados y 24 h ayunas ratones C57BL/6J utilizando el software ImageJ. Los valores se expresan como media ± SEM; 2-cola desapareado del estudiante t-pruebas; p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: visualización y cuantificación de la densidad de los vasos sanguíneos. (A) imágenes representativas de los vasos sanguíneos en los alimentados y 24 horas ayunas ratones C57BL/6J usando el anticuerpo de PECAM-1. (B) comparación de la densidad de vasos sanguíneos entre alimentados y 24 horas en ayunas ratones C57BL/6J utilizando el software ImageJ. Los valores se expresan como media ± SEM; 2-cola desapareado de Student t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: eliminación de tejido adiposo mediante el método iDISCO +. Antes claro, el tejido es opaco. El tejido se vuelve completamente transparente en el extremo del tejido claro pasos.
Figura 7: Whole-mount manchado IWAT comparado con tejido despejó IWAT iDISCO + método. (A) visualización de fibras neuronales usando anticuerpos TH (1: 500) en todo montaje IWAT manchada con 100 aumentos con microscopía confocal con un tamaño de paso de 5 μm. La profundidad de Z-stack total capturada es de alrededor de 100 μm. (B) visualización de fibras neuronales usando anticuerpos TH (1: 200) en conjunto-Monte manchado IWAT iDISCO + protocolo en 1.6 X magnificación LSFM con un tamaño de paso de 4 μm. La profundidad de Z-stack total capturada es alrededor de 8 m m. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 1: diagrama esquemático de sistema de rastreo de linaje mT/mG. Un sistema fluorescente doble que emplea eGFP membrana dirigida y orientada por la membrana tdTomato. Antes de recombinación del Cre, la mT se expresa a nivel mundial. Cuando la célula expresa Cre, el cassette de mT es suprimido, y mG se expresa permanentemente. pA representa secuencias de poliadenilación después del codón de parada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 2: software de aplicación de ImageJ para cuantificar el área de porcentaje de la densidad de vasos sanguíneos. (A) "Imagen" pestaña comandos y opciones para convertir una imagen en un color de umbral en blanco y negro. (B) Resumen medición de porcentaje de área de densidad del recipiente utilizando el comando "Analizar partículas". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementario Figura 3: software de aplicación de ImageJ para cuantificar adipocito área. Ficha de "Analizar": comandos "Set Scale" y "Medición" para medir el área de la adipocyte(s). Visualización de resultados muestra el área de cada adipocito medido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque las técnicas convencionales como la histología y criosección ofrecen beneficios para la observación de la estructura intracelular, conjunto Monte coloración proporciona una perspectiva diferente en la investigación de tejido adiposo, que permite la visualización en 3D de celular arquitectura del tejido mínimamente procesada.
Con el fin de realizar con éxito el montaje conjunto de tinción, las siguientes sugerencias deben tomarse en consideración. Depósitos de tejido adiposo diferentes pueden producir varios resultados de immunostaining; así, el tipo de depósito de tejido adiposo utilizado debe determinarse en primer lugar. Por ejemplo, el tejido adiposo marrón (BAT) es más denso en relación con el tejido adiposo blanco (WAT) por adipocitos multiloculares, menor de21. Este aumento de densidad de murciélago hace difícil para los anticuerpos a permear a través del tejido. Además, el tamaño del tejido adiposo también es imprescindible para la tinción de anticuerpo apropiado, ya que los tejidos demasiado grande gruesa también pueden resultar en la penetración de anticuerpos insuficiente. Por lo tanto, cuando se obtiene el tejido adiposo durante la disección de animales, la porción distal del tejido de grasa perigonadal debe utilizarse, ya que es la región más delgada y puede permitir la suficiente penetración de anticuerpos y datos coherentes. Por otra parte, para los tejidos más densos, uso de una línea de ratón reportero fluorescente, como mT/mG, puede permitir mejor visualización del marcador de interés, ya que esto evita el problema de la penetración de anticuerpos insuficiente. Posteriormente, el 1% PFA se utiliza para la fijación de tejidos para conservar la distribución natural de las proteínas y garantizar tejido permeabilización y anticuerpo penetración22,23. Sin embargo, la fijación excesiva puede disminuir el reconocimiento del antígeno y producir autofluorescence24. Esto es debido a la reacción entre grupos aldehído en PFA, fijador que contiene aldehídos y otras componentes del tejido, que genera compuestos fluorescentes24. Para evitar la necesidad de un paso de recuperación de antígenos, se recomienda dejar los tejidos en un fijador durante sólo una hora a temperatura ambiente y comenzar los pasos a seguir en cuanto la fijación se completa7. Como muchas otras técnicas de inmunomarcación, valorar la concentración de anticuerpos es un paso esencial de la solución de problemas para la señal deseada.
De hecho, existen varias limitaciones de coloración a pesar de la mencionada importancia y ventajas de montaje en conjunto. Conjunto montaje coloración tiene estrictos requisitos en cuanto a tamaño y tipo de tejido debido a penetración de anticuerpos insuficiente y coloración irregular pueden ocurrir en tejidos más gruesos como el músculo y el hígado. También, todo Monte tinción no es la representación más precisa de ciertos anticuerpos como la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador para el sistema nervioso simpático, como su señal es a menudo enmascarada por contenido denso de lípidos en el tejido adiposo (figura 7). Además, la superficie irregular del tejido adiposo también plantea un desafío para la proyección de imagen confocal, puesto que las señales ubicadas en diferentes capas del tejido adiposo no pueden ser capturadas fácilmente en una sola imagen. Por lo tanto, la cuantificación de la intensidad de la señal en imágenes de montaje toda tinción rendimiento resultados inconsistentes para arborización de la fibra nerviosa de todo. La porción distal del PWAT es generalmente el menos lípidos-denso; por lo tanto, pueden obtenerse mejores imágenes de esta zona. Sin embargo, si esta zona es representante del tejido entero para la inmunotinción en todos los tipos de anticuerpos requieren investigación adicional.
Haciendo que tejido ópticamente transparente, un método claro reduce la dispersión de la luz, lo que permite la visualización de la estructura profunda25. iDISCO + es que un protocolo de bajo costo recientemente desarrollado que combina todo montaje inmunomarcación con proyección de imagen de volumen de varias grandes tejidos despejado9. IDISCO modificado + métodos con LSFM demostrada recientes estudios9,10 observan densa arborización dendrítica en WAT que no pueden verse con inmunomarcación convencional y microscopía confocal. Proyección de imagen confocal convencional utiliza un sistema de proyección de imagen de la viga y agujero de alfiler de escaneo láser. La velocidad de escaneado y penetrar en profundidad son limitaciones del microscopio; por lo tanto, dinámica de tejido 3D menos. Por el contrario, microscopía de luz de hoja tiene ventajas evidentes en que se utiliza la hoja de exploración y sólo se ilumina una sección óptica a la vez, capturando todas las moléculas de fluorescencia dentro de esa sección. Por otra parte, fluoróforos en otras secciones no muy contentos, evitando efectos phototoxic y blanqueo foto26. Por lo tanto, la cantidad de inervación del nervio dentro del tejido adiposo puede ser evaluada con mayor precisión y iDISCO + LSFM. A pesar de esto, existen algunas limitaciones al uso de iDISCO + y LSFM. Por ejemplo, los usuarios deben notar que solamente los canales en el canal rojo y far-red son compatibles con iDISCO +, más de largo longitudes de onda de la luz mejor es capaces de penetrar la muestra27. Además, autofluorescencia en el espectro azul y verde es bastante alto en muestras de tejido grandes, por lo que la proyección de imagen en el espectro rojo y far-red ayudará a reducir cualquier autofluorescencia que ocurre14. Con respecto a ratones transgénicos reportero fluorescente, iDISCO + pueden usarse para visualizar proteínas de reportero. Sin embargo, se debe realizar inmunomarcación del reportero fluorescente con un anticuerpo secundario, como la señal endógena puede desaparecer durante el tejido claro proceso14. Sin embargo, esta técnica es muy valiosa para el estudio de las interacciones de tejido adiposo sistema nervioso simpático y para investigar adiposo plasticidad bajo diferentes condiciones fisiológicas y metabólicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por subvenciones de las ciencias naturales y Consejo de investigación Ingeniería (NSERC) de Canadá, piloto y beca de estudio de viabilidad de Banting y Best Diabetes centro (BBDC), el fondo inicial de SickKids a H-K. S., médica centro de programa de investigación (2015R1A5A2009124) a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y futuro planea J r
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LipidTox | Life Technologies | H34477 | |
| PECAM-1 primary antibody | Millipore | MAB1398Z(CH) | |
| TH (tyrosine hydroxylase) primary antibody | Millipore | AB152, AB1542 | |
| DAPI stain | BD Pharmingen | 564907 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| Ultramicroscope I | LaVision BioTec | Light sheet image fluorescent microscope | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Jackson ImmunoResearch | Wavelengths 488, 594 and 647 used | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 | BioSciences | 553141 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dibenzyl-ether | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Methanol | Fisher Chemical | A452-1 | |
| 30% Hydrogen Peroxide | BIO BASIC CANADA INC | HC4060 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | J7126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
| Lectin kit I, fluorescein labeled | VECTOR LABORATORIES | FLK-2100 | |
| F4/80 | Bio-Rad | MCA497GA | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI | VECTOR LABORATORIES | H-1500 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | |||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | |||
| Triton-X | |||
| Tween | |||
| Animal serum (goat, donkey) |
References
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