Summary
Vi har tidligere brugt en guld nanopartikel peptid hybrid intravenøst levere en syntetisk peptid, protein kinase C-delta hæmmer, hvilket reducerede iskæmi-reperfusion-induceret akut lunge skade. Her viser vi de detaljerede protokollen af narkotika formuleringen. Andre intracellulære peptider kan være formuleret på samme måde.
Abstract
Protein kinase C-delta hæmmer (PKCδi) er en lovende stof iskæmi-reperfusion-induceret orgel skade. Det er normalt konjugeret med en celle-gennemtrængende peptid, TAT, intracellulære levering. TAT har dog vist ikke-specifikke biologiske aktiviteter. Guld nanopartikler (BNI) kan bruges som drug delivery luftfartsselskaber uden anerkendt toksicitet. Derfor har vi brugt en GNP/peptid hybrid til at levere PKCδi. To korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW), i forholdet 95:5 blev brugt til at redigere egenskaberne overflade af BNI. BNI konjugeret med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destilleret vand, 0,9% NaCl og fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med bovin serum albumin eller føtal bovint serum. Intravenøs injektion af GNP-PKCi var tidligere vist at forhindre iskæmi-reperfusion skade af lungen. Denne artikel beskriver en protokol for at formulere GNP/PKCi og vurdere lægemiddels egenskaber af GNP/PKCi. Vi har brugt lignende metoder til at formulere andre peptid-baserede lægemidler med BNI. Denne artikel vil forhåbentlig gøre mere opmærksom på denne roman intracellulære drug delivery teknologi og dens anvendelsesmuligheder in vivo.
Introduction
Lunge transplantation sparer patienter med slutstadiet lunge sygdom1. Alvorlige komplikationer efter lunge transplantation er dog stadig en hindring. I de tidlige faser efter lunge transplantation, primære graft dysfunktion er den mest skadelige komplikation1, og dens primære årsag er iskæmi-reperfusion (IR)-induceret akut lunge skade2.
Under kolde bevarelse er stofskifte i en donor lunge begrænset til et meget lavt niveau. Dog er reaktive ilt arter og nitrogenoxid syntesen aktiveret som følge af ophør af blod flow3. Efter transplantation, blodcirkulationen er restaureret og reaktive ilt arter og nitrogenoxid genereret under kolde iskæmi forbedre betændelse og celle død, hvilket resulterer i vævsskade.
For at forhindre IR skade, har en protein kinase Cδ hæmmer (PKCδi) været anvendt i hjertet, hjernen og lungekræft4,5,6,7,8. Disse undersøgelser viste, at PKCδi faldt betændelse og apoptose i reperfusion. Det har også forhindret pulmonal IR skade i rotter og i en lunge transplantation model6. PKCδi er normalt konjugeret med en celle-gennemtrængende peptid, TAT, intracellulære levering. Det har imidlertid vist sig, TAT peptid alene har ikke-specifikke biologiske effekter, herunder fremme af angiogenese, apoptose og hæmning af flere cytokiner9,10,11. Nanopartikler, små partikler spænder fra 1 til 100 nm i diameter12, har været undersøgt som kandidater i lette drug delivery13. Især betragtes guld nanopartikler (BNI) som noninvasive og ugiftige. Derfor har vi udviklet BNI som drug delivery luftfartsselskaber for peptid-baserede lægemidler14,15.
Overfladen af BNI kan manipuleres til specifikke applikationer såsom molekylære anerkendelse16,17, kemiske sensing18, imaging19og medicinafgivelse. En GNP/peptid hybridsystem er blevet udviklet, som indeholder 20 nm BNI og to korte peptider (P2: CAAAAE og P4: CAAAAW) på et 95:5 forhold, til at redigere egenskaberne overflade af BNI. P2 peptid, med de negativt ladede glutaminsyre (E) i slutningen, stabiliserer BNI i en vandig opløsning, og P4 peptid, med de hydrofobe tryptophan (W) i slutningen, hjælper BNI indgangen til celler14. Cystein (C) rester fra N endepunktet for disse peptider indeholder en thiol gruppe, der kan konjugat til guld overflader14. Dette peptid/GNP hybrid blev yderligere brugt til at levere PKCδi (CSFNSYELGSL). Optimeret kindtand forholdet mellem P2:P4 til PKCδi er 47.5:2.5:50. BNI konjugeret med PKCδi (GNP/PKCi) er stabil i destilleret vand, 0,9% NaCl og PBS, som indeholder bovin albumin eller føtal bovint serum14. Intravenøs injektion af GNP/PKCi har vist sig at forhindre iskæmi-reperfusion skade af lunge15. Denne artikel beskriver en metode til at formulere GNP/PKCi og beskriver hvordan man kan evaluere de fysisk-kemiske egenskaber af GNP/PKCi. Vi har brugt lignende metoder til at formulere andre peptid-baserede lægemidler konjugeret til GNP20,21,22. Vi håber, denne artikel vil drage mere opmærksomhed på denne nye formulering for intracellulære medicinafgivelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af peptid løsninger
- Hente peptider (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) fra-20 ° C fryser og tø ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Hold flasken lukket for at forhindre fugt fra kondensering på peptider. - 0,01 g af hver peptid afvejes på en individuel. Læg hver peptid i en separat 50 mL konisk slange.
- Tilføje 18.74 mL deioniseret vand (DI) vand til P2 tube.
- Tilføjes P4 tube 16.93 mL Deioniseret vand.
- Tilføje 8,21 mL 50% acetonitril opløses i Deioniseret vand til PKCδi røret.
- Vortex peptid løsninger kort. Sætte 50 mL konisk rørene i en sonikator (40 MHz) i 5 min.
- Bringe peptid løsninger til en biosikkerhed kabinet. Alle peptid løsninger udarbejdet bør være 1 mM.
- Der overføres 1 mL af hver peptid løsning til en ny 50 mL konisk slange. 19 mL Deioniseret vand tilsættes til rør af P2 og P4 og tilføje 19 mL 50% acetonitril til PKCδi rør, således at hver løsning er fortyndet til 50 µM og lagret i sin egen tube.
2. udarbejdelsen af BNI/PKCi
- Peptider bør føjes til GNP løsning mens stadig i BSC
- Tilføje 475 μL af P2, 25μL af P4 og 500 μl af δPKCi løsning i en 15 mL tube. 9 mL 20 nm GNP løsning (7.0x1011 partikel/mL) tilsættes til den samme 15 mL tube.
- Frakørsel biosikkerhed kabinet. Wrap 15 mL tube med aluminiumsfolie. Lad det sidde en shaker på RT natten over.
- Returnere prøverne til biosikkerhed kabinet. Alikvot 1 mL af GNP/PKCi i hver 1,5 mL microtubes.
- Centrifugeres rør i en mikro-centrifugeres i 30 min. ved 15,294 x g ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten fra hver tube under en biosikkerhed kabinet.
Bemærk: Vær forsigtig til at fjerne supernatanten samtidig at sikre, at GNP pellet forbliver intakt og er ikke indsugning. - Genopslæmmes pellet i den ønskede opløsningsmiddel ifølge den koncentration, der kræves. Gældende opløsningsmidler kan være DI vand, PBS og 0,9% NaCl.
Bemærk: Start fra 1 mL af GNP/PKCi, indeholder GNP pellet 6,3 x 1011 partikler, baseret på GNP koncentrationen fra producenten. At administrere 1,3 x 1012 partikler i 500 µL af 0,9% NaCl, vi tilføje 232 µL af 0,9% NaCl til hver af tre pellets. Efter samle dem sammen, kan vi derefter indsamle 500 µL af GNP/PKCi løsning.
Bemærk: Bland den ønskede solvent godt før fortynding GNP/PKCi pellet, ellers GNP/PKCi bliver samlet.
3. vurdering af BNI/PKCi Hybrid opløselighed
- Hæld 0,5 mL af GNP/PKCi løsning i en acryl kuvette. Placer acryl kuvette på Spektrofotometer UV-Vis og teste peak absorption15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pleje bør tages til at evaluere de biofysiske egenskaber af GNP/PKCi hybrid, som GNP tendens til at samlede i opløsningsmiddel. Når GNP aggregeres, ændres farven på løsningen fra pink til lilla (figur 1a). UV-Vis Spektrofotometer er købedygtig opdager ændringerne mere følsomt. Hvis GNP/PKCi ikke er samlet toppen af absorption bør være på 525 nm (figur 1b). Hvis BNI er samlet, vil toppen af absorption være flyttet til højre. Som en alternativ metode til analyse, når aggregater har dannet ΔOptical tæthed (ΔOD = OD på 525 nm - OD ved 440 nm) falder.
Figur 1 : Kvaliteten af BNI/PKCi. (A) ordentligt forberedt GNP/PKCi er pink i farven (venstre). Aggregerede GNP/PKCi vises lys lilla (til højre). (B) god GNP/PKCi forberedelse er stabile i vand, PBS, eller 0,9% NaCl opløsning. Aflæsninger på en UV-Vis spektrometer tilkendegivet, at toppen af absorption var på 525 nm i alle løsninger. (C) et eksempel på god og dårlig GNP/PKCi præparater. Når BNP var samlet, blev toppen af absorption flyttet til højre. Desuden ΔOD faldt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at sikre korrekt formulering, er det afgørende, at δPKCi løsningen gennemgår sonikering trin skitseret i 1,6. ΔPKCi peptid sekvensen indeholder hydrofobe fraspaltning, så en sonikator hjælper med at opløse PKCi i 50% acetonitril løsning. Derudover er det meget vigtigt at blande opløsningsmiddel omhyggeligt, som beskrevet i trin 2.7. GNP/PKCi hybrid vil ikke formuleres godt, hvis disse trin ikke er udført korrekt, på grund af sammenlægning af δPKCi peptid23.
BNI-drug formulering giver flere fordele. Først, BNI let kan syntetiseres i velkontrollerede størrelser, lige fra nogle få nanometer til ~ 100 nm. Normalt, kan de mindre størrelse BNI levere medicin ind i celler mere effektivt end de store som de små kan nemt diffuse ind i deres mål region24. For det andet er BNI giftfri in vitro- og in vivo25, hvilket gør dem sikkert lægemiddel luftfartsselskaber. Tredje, hydrofobe narkotika kan indlæses på den modificerede BNI26. Frem, er overfladekemi af BNI let modificeret til specifikke programmer. I vores undersøgelser bruges to korte peptider til at ændre GNP overflade, for at stabilisere dem i fysiologiske forhold og give ny bioactivities. Peptider var omhyggeligt designet med tre regioner herunder guld bindende, afstand og funktionelle regioner. Konkret har N endestationen for peptid cystein (C) restprodukter indeholdende thiol gruppe, der kan binde med guld. Den midterste del har fire hydrofobe alanin rester at fremme peptid forsamling i en tæt pakket éncellelag på medlemsstaternes BNI. Aminosyre på C-terminus er en funktionel aminosyre peger udad, der kan bruges til at manipulere de overflade egenskaber af medlemsstaternes BNI. 95:5 forholdet mellem disse to peptider er systemisk valgt i en tidligere undersøgelse14. Forholdet mellem PKCi og P2/P4 peptider var også systemisk testet og udvalgt15.
På den anden side har GNP drug delivery system begrænsninger. BNI er ikke celletype eller væv specifikke. BNI er hovedsagelig ophobet i lungerne, leveren og milten efter intravenøs indgift27,28,29. Hidtil har denne formel er kun blevet testet i cellekultur og lille dyr modeller. For at oversætte det til klinisk anvendelse, yderligere undersøgelser på store dyremodeller og dens farmakokinetik, væv distribution og potentielle toksicitet skal bestemmes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at videregive på dette projekt.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes af forskningstilskud fra canadiske institutter for sundhedsforskning (PJT-148847), Ministeriet for forskning og Innovation i Ontario (RE-08-029) og Canada første forskning af topkvalitet Program, medicin ved Design på University of Toronto. Dr. Mingyao Liu er James og Mary Davie stol i lunge skade, reparation og Regeneration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
