Summary
Ранее мы использовали гибридом пептид золотых наночастиц внутривенно доставить синтетический пептид, белка ингибитора киназы C-Дельта, который сокращен индуцированной ишемии реперфузии острого повреждения легких. Здесь мы покажем подробный протокол разработки препарата. Другие внутриклеточные пептиды могут быть сформулированы аналогичным образом.
Abstract
Белка ингибитора киназы C-Дельта (PKCδi) является перспективным наркотиков для предотвращения ишемии реперфузии индуцированной орган травмы. Это обычно спрягаются для ячейки проникая пептид, ТАТ, внутриклеточный доставки. Однако ТАТ показал неспецифической биологической деятельности. Наночастиц золота (ВНП) может использоваться в качестве перевозчиков наркотиков доставки без признанного токсичности. Таким образом мы использовали ВНП/пептид гибрид для доставки PKCδi. Два коротких пептидов (P2: CAAAAE и P4: CAAAAW), в соотношении 95:5, были использованы для изменения свойств поверхности ВНП. ВНП, конъюгированных с PKCδi (ВНП/PKCi) являются стабильными в дистиллированной воде, 0,9% NaCl и фосфат амортизированное saline (PBS), содержащие бычьим сывороточным альбумином или плода бычьим сывороточным. Внутривенные инъекции ВНП-PKCi был ранее виден для предотвращения ишемии реперфузии повреждения легких. Эта статья конспектирует протокол сформулировать ВНП/PKCi и оценить свойства физико ВНП/PKCi. Мы использовали аналогичные методы для разработки других препаратов на основе пептида с ВНП. Эта статья будет мы надеемся привлечь больше внимания к этой технологии доставки Роман внутриклеточных наркотиков и ее применения в естественных условиях.
Introduction
Трансплантации легких сохраняет больных с терминальной стадии легких заболеваний1. Однако серьезные осложнения после трансплантации легких остаются препятствием. На ранних этапах после трансплантации легких, первичный трансплантата дисфункция является наиболее вредных осложнение1, и ее основной причиной является ишемии реперфузии (ИК)-индуцированной ОПЛ травмы2.
При холодной сохранения метаболизм в донорских легких ограничен до очень низкого уровня. Однако из-за прекращения потока крови3активизируются реактивнооксигенных видов и синтеза оксида азота. После пересадки восстанавливается кровообращение, и активных форм кислорода и окиси азота, созданные во время холодной ишемии повышение воспаления и клеток смерти, травме ткани.
Чтобы предотвратить травмы ИК, ингибитор Cδ киназы протеина (PKCδi) был использован в сердце, мозг и легких4,5,6,7,8. Эти исследования показали, что PKCδi снижение воспаления и апоптоза при реперфузии. Это также мешало легочной ИК травмы в крыс и в пересадке легких модель6. PKCδi обычно проспряганное с клетки проникая пептид, ТАТ, внутриклеточный доставки. Однако было показано, что ТАТ пептид только имеет неспецифической биологические эффекты, включая содействие ангиогенезе, апоптозе и ингибирование несколько цитокинов9,10,11. Наночастицы, мелкие частицы, от 1 до 100 Нм в диаметре12, были изучены как кандидатов в содействии наркотиков доставки13. В частности наночастиц золота (ВНП) рассматриваются как неинвазивной и нетоксичен. Таким образом мы разработали ВНП как носители доставки наркотиков на основе пептидные препараты14,15.
На поверхности ВНП можно манипулировать для конкретных приложений, таких как Молекулярное распознавание16,17, химические зондирования18, изображений19и доставки лекарств. Была разработана ВНП/пептид гибридной системы, содержащие 20 Нм ВНП и два коротких пептидов (P2: CAAAAE и P4: CAAAAW) в соотношении 95:5, чтобы изменить свойства поверхности ВНП. P2 пептид с отрицательно заряженных глутаминовая кислота (Е) в конце, стабилизирует ВНП в водном растворе, и P4 пептид с гидрофобным триптофан (W) в конце, помогает ВНП вход в клетки14. Остатков цистеина (C) на конечной остановке N этих пептидов содержит тиоловых группу, которая может конъюгат на золотых поверхностях14. Далее этот пептид/ВНП гибрид использовался для доставки PKCδi (CSFNSYELGSL). Оптимизированный молярное соотношение P2:P4 к PKCδi-47.5:2.5:50. ВНП, конъюгированных с PKCδi (ВНП/PKCi), стабильная в дистиллированной воде, 0,9% NaCl и PBS, содержащие альбумина bovine или плода бычьим сывороточным14. Внутривенные инъекции ВНП/PKCi было показано для предотвращения ишемии реперфузии травмы легких15. Эта статья описывает метод для разработки ВНП/PKCi и описывает способы оценки физико-химических свойств ВНП/PKCi. Мы использовали аналогичные методы формулировать другие препараты на основе пептида, конъюгированных ВНП20,,2122. Мы надеемся, что эта статья будет привлечь больше внимания к этот роман формулировка для доставки внутриклеточных лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов пептида
- Извлечение пептидов (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) от-20 ° C морозильника и разморозить при комнатной температуре (RT).
Примечание: Держите бутылку закрыты, чтобы предотвратить влаги от конденсации на пептиды. - Весят 0,01 г каждый пептид на микромасштабной. Положите каждый пептид в отдельном 50 мл Конические трубки.
- Добавьте 18,74 мл деонизированной воды (DI) P2 трубки.
- Добавьте 16,93 мл воды ди P4 трубки.
- Добавьте 8.21 мл 50% ацетонитриле, разводят в воде ди PKCδi трубу.
- Вихревой пептид решения кратко. Положите 50 мл конические трубы в sonicator (40 МГц) за 5 мин.
- Привести решения пептид биобезопасности кабинета. Все решения пептид подготовлен должна быть 1 мм.
- 1 мл раствора Каждый пептид передать новой 50 мл Конические трубки. Добавить 19 мл воды ди к трубкам P2 и P4 и добавьте 19 мл 50% Ацетонитрил PKCδi трубки, что каждый раствор разбавляют до 50 мкм и хранится в собственной трубе.
2. Формулирование ВНП/PKCi
- Пептиды должны быть добавлены в ВНП решение еще в BSC
- Добавление 475 мкл P2, 25μL P4 и 500 мкл раствора δPKCi в 15 мл трубку. Добавление же 15 мл 9 мл раствора 20 Нм ВНП (7.0x1011 частиц/мл).
- Выйдите из кабинета по биобезопасности. Оберните 15 мл тюбик с алюминиевой фольгой. Оставьте его на шейкер на RT на ночь.
- Возвращает образцы биобезопасности кабинета. Аликвота 1 мл ВНП/PKCi в каждом 1.5 мл пробирок.
- Центрифуга для труб в микро центрифуга для 30 мин при 15,294 x g при 4 ° C.
- Удалите супернатант из каждой трубы под биобезопасности кабинета.
Примечание: Будьте осторожны удалить супернатант обеспечивая Пелле ВНП остается неизменным и не наддува. - Вновь приостановите гранулы в нужный растворитель согласно необходимо концентрацию. Применимые растворители могут быть ди воды, PBS и 0,9% NaCl.
Примечание: Начиная с 1 мл раствора ВНП/PKCi, Пелле ВНП содержит 6.3 x 1011 частицы, основанный на концентрации ВНП, предоставляемых производителем. Чтобы администрировать 1.3 x 1012 частиц в 500 мкл 0,9% NaCl, мы мкл 232 0,9% NaCl для каждого из трех окатышей. После объединения их вместе, мы можем затем собрать 500 мкл раствора ВНП/PKCi.
Примечание: Смешать желаемого задолго до разбавления Пелле ВНП/PKCi растворителей, в противном случае будет агрегировать ВНП/PKCi.
3. Оценка ВНП/PKCi гибридные растворимость
- Залейте 0,5 мл раствора ВНП/PKCi в кювет акрил. Поместите кювету акрил на Спектрофотометр UV-Vis и проверить пик поглощения15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следует для оценки биофизических свойств ВНП/PKCi гибрид, как ВНП, как правило, чтобы совокупные в растворителе. При агрегировании ВНП, цвет раствора меняется от розового до пурпурного (рис. 1a). Спектрофотометр UV-Vis способен обнаружить изменения более чутко. Если PKCi ВНП не агрегируются пик поглощения должно быть в 525 Нм (рис. 1b). Если агрегируется ВНП, пик поглощения будет смещен вправо. Как альтернативный метод анализа, когда агрегаты образовали ΔOptical плотность (ΔOD = OD в 525 Нм - ОД при 440 Нм) уменьшается.
Рисунок 1 : Качество ВНП/PKCi. (A) должным образом подготовлена ВНП/PKCi-розового цвета (слева). Агрегированные ВНП/PKCi появляется свет фиолетовый (справа). (B) подготовка хороших ВНП/PKCi является стабильным, в воде, PBS, или в растворе 0,9% NaCl. Чтений на UV-Vis спектрометр указал, что пик поглощения в 525 Нм во всех решений. (C) пример хороших и плохих ВНП/PKCi препаратов. При агрегировании ВНП, пик поглощения был перенесен на право. Кроме того снижение ΔOD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для обеспечения надлежащей разработки, важно, что δPKCi раствор подвергается sonication шаг, изложенные в 1.6. ΔPKCi пептид последовательность содержит гидрофобные постановление, так что sonicator помогает в растворении PKCi в ацетонитриле 50% растворе. Кроме того очень важно тщательно, как указано в шаге 2.7 смешать растворитель. ВНП/PKCi гибрид не будет быть хорошо сформулированы, если эти шаги не выполняются должным образом, благодаря агрегации δPKCi пептид23.
На основе ВНП наркотиков формулировка обеспечивает несколько преимуществ. Во-первых, ВНП могут быть легко синтезированы в хорошо контролируемых размеров, начиная от нескольких нанометров до ~ 100 Нм. Как правило меньше размера ВНП могут доставить наркотики в клетки более эффективно, чем крупные, мелкие легко может диффундировать в их целевого региона24. Во-вторых ВНП являются токсичными в vitro и in vivo25, делая их безопасным препаратом перевозчиков. Третьих, гидрофобные наркотиков может быть загружен на изменение ВНП26. Далее химии поверхности ВНП легко модифицируется для конкретных приложений. В наших исследованиях два коротких пептидов используются для изменения поверхности ВНП, стабилизировать их в физиологических условиях и распространять новые bioactivities. Пептиды были тщательно разработан с тремя регионами, включая золото привязки, интервал и функциональных областей. В частности N-го пептида имеет остатков цистеина (C), содержащие тиоловых групп, который можно связать с золотом. Средняя часть имеет четыре гидрофобные аланина остатков для содействия Ассамблее пептида в плотно упакованных монослоя на ВНП. Амино кислоты на конечной остановке C является функциональной аминокислота указывая наружу, который может использоваться для манипулирования свойств поверхности ВНП. 95:5 соотношение этих двух пептиды системно был выбран в предыдущем исследовании14. Соотношение между PKCi и P2/P4 пептиды также системно тестировалось и отдельных15.
С другой стороны система доставки наркотиков ВНП имеет ограничения. Не типа клеток или тканей конкретных ВНП. ВНП основном накапливается в легких, печени и селезенке после внутривенного введения27,,2829. До настоящего времени, эта формула протестирована только в культуре клеток и небольших животных моделей. Чтобы перевести его клинического применения, дальнейшие исследования на больших животных моделей и его фармакокинетики, распределения и потенциал токсичность ткани должны определяться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать на этот проект.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается научно-исследовательских грантов от канадской институты здравоохранения исследований (PJT-148847), Министерство исследований и инноваций Онтарио (RE-08-029) и Канада первой исследований передового опыта программы, медицина дизайн в университете Торонто. Д-р Лю Mingyao, Джеймс и Мэри Дэви стул в легких повреждений, ремонт и восстановление.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
