Summary
Anteriormente hemos utilizado un híbrido de péptido nanopartículas de oro para entregar por vía intravenosa un péptido sintético, inhibidor de proteína cinasa C-delta, que reduce la lesión pulmonar aguda inducida por isquemia-reperfusión. A continuación os mostramos el protocolo detallado de la formulación de la droga. Otros péptidos intracelulares pueden ser formuladas de manera similar.
Abstract
Inhibidores de proteína quinasa c-Delta (PKCδi) es un fármaco prometedor para evitar lesiones de órgano inducida por isquemia-reperfusión. Generalmente se conjuga a un penetración de célula péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, TAT ha mostrado actividad biológica no específica. Nanopartículas de oro (SPNG) pueden utilizarse como portadores de drogas entrega sin toxicidad reconocida. Por lo tanto, hemos utilizado un híbrido de GNP/péptido para entregar PKCδi. Dos cortos péptidos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW), en una proporción de 95: 5, fueron utilizados para modificar las propiedades superficiales del PNB. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) es estables en agua destilada 0,9% NaCl y el tampón fosfato salino (PBS) con albúmina sérica bovina o suero bovino fetal. La inyección intravenosa de GNP-PKCi fue demostrada previamente para evitar lesiones de isquemia-reperfusión pulmonar. Este artículo describe un protocolo para GNP/PKCi de formular y evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos con el PIB. Este artículo que sacarán más atención a esta tecnología de entrega de nuevas drogas intracelular y sus aplicaciones en vivo.
Introduction
Trasplante de pulmón guarda a pacientes con fase final pulmón enfermedad1. Sin embargo, complicaciones serias después de trasplante de pulmón siguen siendo un obstáculo. En las primeras etapas después del trasplante del pulmón, la disfunción primaria del injerto es la complicación más perjudiciales1, y su principal causa es la isquemia-reperfusión (IR)-inducida de lesión pulmonar aguda2.
Bajo conservación en frío, el metabolismo en el pulmón de un donante es restringido a un nivel muy bajo. Sin embargo, la síntesis de óxido nítrico y especies reactivas de oxígeno se activan debido a la cesación del flujo de sangre3. Después del trasplante, se restablece la circulación de la sangre, y especies reactivas del oxígeno y el óxido nítrico generado durante la isquemia fría mejoran la inflamación y muerte celular, dando por resultado la lesión del tejido.
Para evitar lesiones de IR, se ha utilizado un inhibidor de proteína cinasa Cδ (PKCδi) en el corazón, cerebro y pulmón4,5,6,7,8. Estos estudios demostraron que el PKCδi disminuido la inflamación y la apoptosis durante la reperfusión. También ha impedido pulmonar lesiones IR en ratas y en un modelo de trasplante pulmonar6. PKCδi generalmente se conjuga con un penetración celular péptido, TAT, para la entrega intracelular. Sin embargo, se ha demostrado que el péptido de TAT solo tiene efectos biológicos no específicos, incluyendo la promoción de la angiogénesis, apoptosis y la inhibición de múltiples citoquinas9,10,11. Nanopartículas, pequeñas partículas que van desde 1 a 100 nm de diámetro12, han sido exploradas como candidatos en la facilitación de entrega de drogas13. En particular, nanopartículas de oro (SPNG) son consideradas como no invasiva y no tóxico. Por lo tanto, hemos desarrollado SPNG como portadores de entrega de medicamentos de fármacos basados en péptidos14,15.
La superficie de PNB puede ser manipulada para aplicaciones específicas como el reconocimiento molecular16,17, sensores químicos18, imagen19y entrega de la droga. Se ha desarrollado un sistema híbrido de GNP/péptido, que contiene 20 nm SPNG y dos péptidos cortos (P2: CAAAAE y P4: CAAAAW) en una proporción de 95: 5, para modificar las propiedades superficiales de PNB. El péptido de la P2, con el cargado negativa el ácido glutámico (E) al final, estabiliza el SPNG en una solución acuosa, y el péptido de P4, con el triptófano hidrofóbico (W) al final, ayuda a PNB entrada en células14. El residuo de cisteína (C) en el término de N de estos péptidos contiene un grupo tiol que puede conjugar a las superficies del oro14. Este híbrido de péptido y PNB se utilizó más para entregar PKCδi (CSFNSYELGSL). La relación molar optimizada de P2:P4 a PKCδi es 47.5:2.5:50. SPNG conjugado con PKCδi (GNP/PKCi) son estables en agua destilada, 0.9% NaCl y PBS con albúmina bovina o suero bovino fetal14. La inyección intravenosa de GNP/PKCi se ha demostrado para prevenir lesiones de isquemia-reperfusión del pulmón15. Este artículo describe un método para formular GNP/PKCi y describe cómo evaluar las propiedades fisicoquímicas de GNP/PKCi. Hemos utilizado métodos similares para formular otros fármacos basados en péptidos conjugados a GNP20,21,22. Esperamos que este artículo dibuja más atención a esta formulación novedosa para la entrega intracelular de la droga.
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Protocol
1. preparación de soluciones de péptido
- Recuperar los péptidos (P2: CAAAAE, P4: CAAAAW, PKCδi: CSFNSYELGSL) del congelador de-20 ° C y descongelar a temperatura ambiente (RT).
Nota: Mantenga el frasco cerrado para evitar que la humedad de condensación en los péptidos. - Pesar 0.01 g de cada péptido en una microescala. Poner cada péptido en un tubo cónico de 50 mL separadas.
- Añadir 18,74 mL de agua desionizada (DI) al tubo de P2.
- Añadir 16,93 mL de agua desionizada al tubo P4.
- Añadir 8,21 mL de acetonitrilo 50% diluido en agua desionizada para el tubo de PKCδi.
- Vortex brevemente las soluciones de péptido. Poner los tubos cónicos de 50 mL en un sonicador (40 MHz) durante 5 minutos.
- Llevar las soluciones de péptido a un gabinete de bioseguridad. Todas las soluciones de péptido preparadas deben ser de 1 mm.
- Transferir 1 mL de cada solución del péptido a un nuevo tubo cónico de 50 mL. 19 mL de agua desionizada en los tubos de P2 y P4 y añadir 19 mL de acetonitrilo 50% al tubo de PKCδi, tal que cada solución es diluida a 50 μm y almacenado en su propio tubo.
2. formulación de PNB/PKCi
- Péptidos se deben agregar a la solución de GNP mientras que todavía en el BSC
- Añadir 475 μL de P2, 25μL de P4 y 500 μL de solución de δPKCi en un tubo de 15 mL. Añadir 9 mL de solución de GNP de 20 nm (7.0x1011 partículas/mL) en el mismo tubo de 15 mL.
- La salida del gabinete de seguridad de la biotecnología. Envuelva el tubo de 15 mL con papel de aluminio. Dejarlo toda la noche en un agitador a temperatura ambiente.
- Retomar las muestras la bioseguridad gabinete. Alícuota 1 mL de GNP/PKCi en cada microtubos de 1,5 mL.
- Centrifugar los tubos en una microcentrífuga durante 30 min a 15.294 x g a 4 ° C.
- Retire el sobrenadante de cada tubo en un gabinete de bioseguridad.
Nota: Tenga cuidado de quitar el sobrenadante asegurando que el GNP se mantiene intacta y no se aspira. - Vuelva a suspender el sedimento en el solvente deseado según la concentración necesaria. Aplicables disolventes pueden ser agua DI, PBS y 0.9% NaCl.
Nota: A partir de 1 mL de GNP/PKCi, la pelotilla de GNP contiene 6.3 x 1011 partículas, basadas en la concentración de GNP proporcionada por el fabricante. Administrar 1.3 x 1012 partículas en 500 μl de 0.9% NaCl, añadimos 232 μl de 0.9% NaCl a cada uno de tres gránulos. Después de la les agrupación juntos, entonces podemos recolectar 500 μl de solución de GNP/PKCi.
Nota: Mezcle el deseado solvente antes de diluir la pastilla de GNP/PKCi, de lo contrario GNP/PKCi será agregado.
3. evaluación de la PNB/PKCi híbrido solubilidad
- Verter 0,5 mL de solución de GNP/PKCi en una cubeta de acrílico. Coloque la cubeta de acrílico en un espectrofotómetro UV-Vis y el pico de absorción15de prueba.
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Representative Results
Se debe evaluar las propiedades biofísicas del GNP/PKCi híbrido, como GNP tiende a agregado de solvente. Cuando se agrega GNP, el color de la solución cambia de color de rosa a púrpura (Figura 1a). Espectrofotómetro UV-Vis es capaz de detectar los cambios más sensible. Si GNP/PKCi no se agrega el pico de absorción debe ser en 525 nm (Figura 1b). Si se agrega el PNB, el pico de absorción se desplazan hacia la derecha. Como un método alternativo de análisis, cuando los agregados han formado ΔOptical densidad (ΔOD = do a 525 nm - OD a 440 nm) disminuye.
Figura 1 : Calidad de PNB/PKCi. (A) preparada GNP/PKCi es de color rosa en color (izquierda). GNP/PKCi agregado aparece luz púrpura (derecha). (B) preparación de GNP/PKCi buena es estable en agua, PBS, o en solución de NaCl al 0,9%. Lecturas en un espectrómetro de UV-Vis indicaron que el pico de absorción a 525 nm en todas las soluciones. (C) un ejemplo de buenas y malas preparaciones de GNP/PKCi. Cuando el PNB fue agregado, el pico de absorción se desplaza hacia la derecha. Por otra parte, ΔOD disminuido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para garantizar la formulación correcta, es crucial que la solución de δPKCi sufre el paso de sonicación en 1.6. ΔPKCi secuencia de péptido contiene moléculas hidrofóbicas, por lo que un sonicador ayuda a disolver PKCi en la solución de 50% acetonitrilo. Además, es muy importante mezclar el solvente meticulosamente, como se indica en el paso 2.7. El híbrido de GNP/PKCi no se bien formularán si estos pasos no se realizan correctamente, debido a la agregación del péptido δPKCi23.
Formulación de drogas PNB proporciona varias ventajas. En primer lugar, el PNB puede ser sintetizados fácilmente en tamaños bien controlados, que van desde unos pocos nanómetros a ~ 100 nm. Generalmente, el SPNG tamaño más pequeño puede entregar medicamentos en células más eficientemente que los más grandes como los más pequeños pueden difundir fácilmente a su destino región24. En segundo lugar, SPNG es no tóxico in vitro e in vivo25, lo que los hace portadores de droga segura. Drogas en tercer lugar, hidrofóbicas pueden cargar en el SPNG modificado26. La química superficial de PNB es modificada fácilmente para aplicaciones específicas. En nuestros estudios, dos péptidos cortos se utilizan para modificar la superficie de GNP, para estabilizar en las condiciones fisiológicas y difundir nuevos bioactividades. Los péptidos fueron cuidadosamente diseñados con tres regiones como enlace de oro, espaciado y regiones funcionales. Específicamente, el N terminal del péptido tiene residuos de cisteína (C) que contienen grupo tiol que se puede unir con el oro. La parte media tiene cuatro residuos de alanina hidrofóbico para promover el montaje del péptido en una monocapa densamente en el PNB. El aminoácido en la terminal C es un funcional aminoácido apuntando hacia el exterior, que puede utilizarse para manipular las propiedades superficiales de las PNB. La proporción de 95: 5 de estos dos péptidos sistémica fue seleccionada en un anterior estudio14. La relación entre péptidos PKCi y P2/P4 también sistémicamente fue probada y seleccionado15.
Por otro lado, el sistema de entrega de drogas GNP tiene limitaciones. PNB no es tipo de la célula o tejido específico. PNB se acumula principalmente en el pulmón, el hígado y el bazo después de administración intravenosa27,28,29. Hasta ahora, esta fórmula sólo se ha probado en cultivos celulares y animales pequeños modelos. Para traducir la aplicación clínica, otros estudios en modelos animales grandes y su farmacocinética, toxicidad potencial y distribución de tejido necesario determinar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar en este proyecto.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por becas de investigación de los institutos canadienses de investigación en salud (PJT-148847), Ministerio de investigación e innovación de Ontario (RE-08-029) y Canadá primer investigación de excelencia del programa, medicina por diseño en la Universidad de Toronto. Dr. Mingyao Liu es James y María Davie Cátedra de lesión pulmonar, la reparación y la regeneración.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
- Yusen, R. D., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-first adult lung and heart-lung transplant report--2014; focus theme: retransplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (10), 1009-1024 (2014).
- Lee, J. C., Christie, J. D., Keshavjee, S. Primary graft dysfunction: definition, risk factors, short- and long-term outcomes. Seminars in Respiratory and Critical. 31 (2), 161-171 (2010).
- Chatterjee, S., Nieman, G. F., Christie, J. D., Fisher, A. B. Shear stress-related mechanosignaling with lung ischemia: lessons from basic research can inform lung transplantation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (9), 668-680 (2014).
- Inagaki, K., et al. Inhibition of delta-protein kinase C protects against reperfusion injury of the ischemic heart in vivo. Circulation. 108 (19), 2304-2307 (2003).
- Lincoff, A. M., et al. Inhibition of delta-protein kinase C by delcasertib as an adjunct to primary percutaneous coronary intervention for acute anterior ST-segment elevation myocardial infarction: results of the PROTECTION AMI Randomized Controlled Trial. European Heart Journal. 35 (37), 2516-2523 (2014).
- Kim, H., et al. deltaV1-1 Reduces Pulmonary Ischemia Reperfusion-Induced Lung Injury by Inhibiting Necrosis and Mitochondrial Localization of PKCdelta and p53. American Journal of Transplantation. 16 (1), 83-98 (2016).
- Lin, H. W., et al. Derangements of post-ischemic cerebral blood flow by protein kinase C delta. Neuroscience. 171 (2), 566-576 (2010).
- Lin, H. W., et al. Protein kinase C delta modulates endothelial nitric oxide synthase after cardiac arrest. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 34 (4), 613-620 (2014).
- Albini, A., et al. HIV-tat protein is a heparin-binding angiogenic growth factor. Oncogene. 12 (2), 289-297 (1996).
- Kim, H., Moodley, S., Liu, M. TAT cell-penetrating peptide modulates inflammatory response and apoptosis in human lung epithelial cells. Drug Delivery and Translational Research. 5 (3), 275-278 (2015).
- Lee, D., Pacheco, S., Liu, M. Biological effects of Tat cell-penetrating peptide: a multifunctional Trojan horse. Nanomedicine (Lond). 9 (1), 5-7 (2014).
- Auffan, M., et al. Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective. Nature Nanotechnology. 4 (10), 634-641 (2009).
- Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M.
- Yang, H., Fung, S. Y., Liu, M. Programming the cellular uptake of physiologically stable peptide-gold nanoparticle hybrids with single amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 50 (41), 9643-9646 (2011).
- Lee, D., et al. Effective delivery of a rationally designed intracellular peptide drug with gold nanoparticle-peptide hybrids. Nanoscale. 7 (29), 12356-12360 (2015).
- Cheng, M. M., et al. Nanotechnologies for biomolecular detection and medical diagnostics. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (1), 11-19 (2006).
- Rosi, N. L., Mirkin, C. A.
- Saha, K., Agasti, S. S., Kim, C., Li, X., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing. Chemical Reviews. 112 (5), 2739-2779 (2012).
- Boisselier, E., Astruc, D. Gold nanoparticles in nanomedicine: preparations, imaging, diagnostics, therapies and toxicity. Chemical Society Reviews. 38 (6), 1759-1782 (2009).
- Yang, H., et al. Amino Acid-Dependent Attenuation of Toll-like Receptor Signaling by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. ACS Nano. 9 (7), 6774-6784 (2015).
- Yang, H., et al. Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials. 111, 90-102 (2016).
- Yang, H., et al. Amino Acid Structure Determines the Immune Responses Generated by Peptide-Gold Nanoparticle Hybrids. Particle & Particle Systems Characterization. 30 (12), 1039-1043 (2013).
- Pamies, R., et al. Aggregation behaviour of gold nanoparticles in saline aqueous media. Journal of Nanoparticle Research. 16 (4), (2014).
- Perrault, S. D., Walkey, C., Jennings, T., Fischer, H. C., Chan, W. C. Mediating tumor targeting efficiency of nanoparticles through design. Nano Letters. 9 (5), 1909-1915 (2009).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Kim, C. K., et al. Entrapment of Hydrophobic Drugs in Nanoparticle Monolayers with Efficient Release into Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 131 (4), 1360 (2009).
- Sonavane, G., Tomoda, K., Makino, K. Biodistribution of colloidal gold nanoparticles after intravenous administration: Effect of particle size. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces. 66 (2), 274-280 (2008).
- Balasubramanian, S. K., et al. Biodistribution of gold nanoparticles and gene expression changes in the liver and spleen after intravenous administration in rats. Biomaterials. 31 (8), 2034-2042 (2010).
- Lipka, J., et al. Biodistribution of PEG-modified gold nanoparticles following intratracheal instillation and intravenous injection. Biomaterials. 31 (25), 6574-6581 (2010).
