Summary
हम पहले से एक सोने नैनोपैर्टिकल पेप्टाइड संकर इस्तेमाल किया है नसों के लिए एक सिंथेटिक पेप्टाइड उद्धार, प्रोटीन काइनेज सी-डेल्टा अवरोधक, जो ischemia कम-reperfusion-तीव्र फेफड़ों की चोट प्रेरित । यहां हम दवा तैयार करने का विस्तृत प्रोटोकॉल दिखाते हैं । अन्य इंट्राकोशिलर पेप्टाइड्स इसी तरह तैयार किया जा सकता है ।
Abstract
प्रोटीन काइनेज सी-डेल्टा अवरोधक (pkcδ i) इस्केमिया-रिपरफ्यूजन-प्रेरित अंग चोट को रोकने के लिए एक होनहार दवा है । यह आमतौर पर इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए एक कोशिका-मर्मज्ञ पेप्टाइड, टैट के लिए संयुग्मित है । हालांकि, TAT गैर विशिष्ट जैविक गतिविधियों को दिखाया गया है । गोल्ड नैनोकणों (gnps) मांयता प्राप्त विषाक्तता के बिना दवा वितरण वाहक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इसलिए, हम एक gnp/पेप्टाइड हाइब्रिड pkcδ वितरित करने के लिए उपयोग किया है i. दो लघु पेप्टाइड्स (P2: caaaae और P4: caaaae), एक 95:5 अनुपात में, gnp की सतह गुणों को संशोधित करने के लिए उपयोग किया गया. जीएनपी के साथ संयुग्मित pkcδ i (gnps/pkci) आसुत जल में स्थिर हैं, ०.९% nacl, और फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) जिसमें गोजातीय सीरम एल्बुमिन या भ्रूण गोजातीय सीरम है । जीएनपी-पीकेसीआई के अंतःशिरा इंजेक्शन को पहले फेफड़ों के इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोट को रोकने के लिए दिखाया गया था । इस लेख में gnp/pkci तैयार करने और gnp/pkci के फिजियोकेमिकल गुणों का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा है । हमने अन्य पेप्टाइड आधारित दवाओं को जीएनपी के साथ तैयार करने के लिए समान तरीकों का इस्तेमाल किया है । इस लेख में उम्मीद है कि इस उपन्यास इंट्रासेलुलर ड्रग डिलीवरी प्रौद्योगिकी और vivo में इसके अनुप्रयोगों के लिए और अधिक ध्यान आकर्षित करेगा ।
Introduction
फेफड़ों प्रत्यारोपण अंत चरण फेफड़ों की बीमारी के साथ रोगियों को बचाता है1. हालांकि, फेफड़ों प्रत्यारोपण के बाद गंभीर जटिलताओं एक बाधा रहते हैं । फेफड़ों के प्रत्यारोपण के बाद प्रारंभिक चरणों में, प्राथमिक भ्रष्टाचार शिथिलता सबसे हानिकारक जटिलता1है, और इसकी प्राथमिक कारण ischemia-reperfusion (आईआर)-प्रेरित तीव्र फेफड़ों की चोट2है ।
शीत संरक्षण के तहत, एक दाता फेफड़ों में चयापचय एक बहुत ही कम स्तर तक सीमित है । हालांकि, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और नाइट्रिक ऑक्साइड संश्लेषण रक्त प्रवाह3की समाप्ति के कारण सक्रिय होते हैं । प्रत्यारोपण के बाद, रक्त परिसंचरण बहाल है, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और नाइट्रिक ऑक्साइड ठंड ischemia के दौरान उत्पन्न सूजन और कोशिका मृत्यु को बढ़ाने, ऊतक चोट में जिसके परिणामस्वरूप.
IR चोट को रोकने के लिए, एक प्रोटीन काइनेज cδ अवरोधक (pkcδ मैं) दिल में इस्तेमाल किया गया है, मस्तिष्क और फेफड़ों4,5,6,7,8. इन अध्ययनों से पता चला है कि pkcδ मैं reperfusion के दौरान सूजन और apoptosis में कमी आई । यह भी चूहों में फेफड़े के IR की चोट को रोका गया है और एक फेफड़ों के प्रत्यारोपण मॉडल6में । pkcδ मैं आमतौर पर एक कोशिका के साथ संयुग्मित है-penetrating पेप्टाइड, TAT, इंट्रासेलुलर डिलीवरी के लिए. हालांकि, यह दिखाया गया है कि ताट पेप्टाइड अकेले गैर विशिष्ट जैविक प्रभाव है, एंजियोजेनेसिस के संवर्धन सहित, apoptosis, और कई साइटोकिन्स के निषेध9,10,11. नैनोकणों, छोटे व्यास12में 1 से १०० एनएम से लेकर कणों, दवा प्रसव13सुविधा में उंमीदवारों के रूप में पता लगाया गया है । विशेष रूप से, सोने नैनोकणों (gnps) noninvasive और nontoxic के रूप में माना जाता है । इसलिए, हम पेप्टाइड आधारित दवाओं के लिए दवा वितरण वाहक के रूप में gnps विकसित किया है14,15.
gnps की सतह आणविक मान्यता16,17, रासायनिक संवेदन18, इमेजिंग19, और नशीली दवाओं के वितरण जैसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए हेरफेर किया जा सकता है । एक gnp/पेप्टाइड हाइब्रिड सिस्टम विकसित किया गया है, जिसमें 20 एनएम gnp और दो शॉर्ट पेप्टाइड (P2: caaaae और P4: caaaae) एक 95:5 अनुपात में, gnp की सतह गुणों को संशोधित करने के लिए. P2 पेप्टाइड, नकारात्मक चार्ज glutamic एसिड के साथ (ई) अंत में, एक जलीय समाधान में gnps स्थिर, और पी 4 पेप्टाइड, अंत में हाइड्रोफोबिक tryptophan (डब्ल्यू) के साथ, कोशिकाओं में gnps प्रवेश में मदद करता है14. इन पेप्टाइड्स के एन टर्मिनस पर सिस्टीन (सी) अवशेष एक थियोल समूह है कि सोने की सतहों के लिए संयुग्मी कर सकते हैं14. यह पेप्टाइड/जीएनपी हाइब्रिड को pkcδ i (csfnsyelgsl) देने के लिए इस्तेमाल किया गया था । P2 के अनुकूलित मोलर अनुपात: पी 4 pkcδ करने के लिए मैं 47.5:2.5:50 है । gnps pkcδ i के साथ संयुग्मित (gnps/pkci) आसुत जल, ०.९% nacl, और pbs जिसमें गोजातीय एल्बुमिन या भ्रूण गोजातीय सीरम14में स्थिर हैं । gnp/pkci का अंतःशिरा इंजेक्शन फेफड़ों के15के इस्केमिया-रिपरफ्यूजन चोट को रोकने के लिए दिखाया गया है । इस लेख में gnp/pkci तैयार करने की विधि की रूपरेखा और वर्णन है कि gnp/pkci के भौतिकरासायनिक गुणों का मूल्यांकन कैसे करें । हमने अन्य पेप्टाइड आधारित औषधों को तैयार करने के लिए समान विधियों का उपयोग किया है जो जीएनपी20,21,22के लिए संयुग्मित हैं । हमें उंमीद है कि इस अनुच्छेद के इंट्रासेलुलर दवा वितरण के लिए इस उपंयास तैयार करने के लिए और अधिक ध्यान आकर्षित करेगा ।
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Protocol
1. पेप्टाइड समाधान की तैयारी
- -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर और कमरे के तापमान पर गल (आरटी) से पेप्टाइड्स (P2: caaaae, पी 4: caaaae, pkcδ मैं: csfnsyelgsl) निकालते हैं ।
नोट: बोतल को पेप्टाइड्स पर कंडेनसिंग से नमी को रोकने के लिए बंद रखें । - एक microscale पर प्रत्येक पेप्टाइड के ०.०१ जी वजन । प्रत्येक पेप्टाइड को एक अलग ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में रखें ।
- जोड़ने के १८.७४ मिलीलीटर के विआयनीकृत (डि) पानी P2 ट्यूब के लिए ।
- पी 4 ट्यूब के लिए डि पानी की १६.९३ मिलीलीटर जोड़ें ।
- ८.२१ मिलीलीटर के ५०% एसीतोनिटेरिले को डी पानी में pkcδ i tube को पतला कर जोड़ें ।
- भंवर पेप्टाइड समाधान संक्षेप में । एक sonicator (४० मेगाहर्ट्ज) में 5 मिनट के लिए ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों रखो ।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए पेप्टाइड समाधान लाओ । सभी पेप्टाइड समाधान तैयार किया जाना चाहिए 1 मिमी.
- एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए प्रत्येक पेप्टाइड समाधान के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण । P2 और P4 की ट्यूबों के लिए DI पानी की 19 मिलीलीटर जोड़ें और pkcδ मैं ट्यूब के लिए ५०% acetonitrile के 19 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, इस तरह है कि प्रत्येक समाधान ५० μm करने के लिए पतला और अपनी खुद की ट्यूब में संग्रहीत है ।
2. gnp/pkci का सूत्रीकरण
- जबकि अभी भी बीएससी में पेप्टाइड्स को जीएनपी सॉल्यूशन में जोड़ा जाना चाहिए
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ४७५ μl का P2, 25μl का P4 और ५०० μl का δ pkci समाधान जोड़ें । एक ही 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 20 एनएम gnp समाधान (7.0 x1011 कण/एमएल) के 9 मिलीलीटर जोड़ें ।
- जैव सुरक्षा कैबिनेट से बाहर निकलें । एल्यूमीनियम पन्नी के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब लपेटें । यह एक शेखर पर रात भर आरटी पर छोड़ दें ।
- जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए नमूने वापस । प्रत्येक १.५ मिलीलीटर माइक्रोट्यूब्स में जीएनपी/पीकेसीआई की aliquot 1 मिलीलीटर ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर १५,२९४ एक्स जी में 30 मिनट के लिए एक माइक्रो-अपकेंद्रिका में ट्यूबों को सेंट्रेसेज ।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें ।
नोट: सुनिश्चित करें कि जीएनपी गोली बरकरार रहता है और aspirated नहीं है, जबकि सतह पर तैरनेवाला को दूर करने के लिए सावधान रहना । - आवश्यक एकाग्रता के अनुसार वांछित विलायक में गोली फिर से निलंबित. लागू सॉल्वैंट्स DI पानी, pbs, और ०.९% nacl हो सकता है ।
नोट: gnp/pkci के 1 मिलीलीटर से शुरू, gnp गोली में ६.३ x 1011 कण हैं, जो निर्माता द्वारा प्रदान किए गए gnp एकाग्रता पर आधारित हैं । ०.९% nacl के ५०० μl में १.३ x 1012 कणों को प्रशासित करने के लिए, हम प्रत्येक तीन छर्रों के लिए ०.९% nacl के २३२ μl जोड़ते हैं । उंहें एक साथ पूलिंग के बाद, हम तो gnp/pkci समाधान के ५०० μl जमा कर सकते हैं ।
नोट: gnp/pkci गोली को पतला करने से पहले वांछित विलायक को अच्छी तरह मिलाएं, अन्यथा gnp/
3. gnp/pkci हाइब्रिड घुलनशीलता का मूल्यांकन
- एक acryl cuvette में ०.५ मिलीलीटर gnp/pkci समाधान डालो । एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर acryl द्रोणिका प्लेस और चोटी अवशोषण15का परीक्षण ।
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Representative Results
gnp/pkci हाइब्रिड के biophysical गुणों का मूल्यांकन करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए, के रूप में जीएनपी विलायक में कुल करने के लिए जाता है. जब जीएनपी एकत्रित होता है, तो समाधान का रंग गुलाबी से बैंगनी (चित्र 1a) में बदलता है । यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर परिवर्तन को अधिक संवेदनशीलता से पता लगाने में सक्षम है । यदि gnp/pkci का एकत्रीकृत नहीं किया जाता है तो अवशोषण की चोटी ५२५ एनएम (चित्र 1b) पर होनी चाहिए । यदि जीएनपी एकत्रित किया जाता है, तो अवशोषण की चोटी को दाईं ओर स्थानांतरित कर दिया जाएगा । विश्लेषण की एक वैकल्पिक विधि के रूप में, जब समुच्चय (४४० एनएम पर ५२५ एनएम-आयुध डिपो में) (ए. एम. ए.
चित्रा 1 : gnp/pkci की गुणवत्ता । (क) ठीक से तैयार gnp/pkci रंग में गुलाबी है (बाएं) । एकत्रित gnp/pkci प्रकाश बैंगनी (सही) प्रकट होता है । (ख) अच्छा gnp/pkci तैयारी पानी में स्थिर है, pbs, या में ०.९% nacl समाधान । एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोमीटर पर रीडिंग ने संकेत दिया कि अवशोषण की चोटी सभी समाधानों में ५२५ एनएम थी । (ग) अच्छा और बुरा gnp/pkci तैयारी का एक उदाहरण है । जब gnp एकत्रित किया गया था, अवशोषण की चोटी सही करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया था. इसके अलावा, δ od कमी आई है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
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Discussion
उचित निर्माण सुनिश्चित करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि δ pkci समाधान १.६ में उल्लिखित sonication कदम से गुजरता है । δ pkci पेप्टाइड अनुक्रम हाइड्रोफोबिक moieties शामिल हैं, तो एक sonicator ५०% एसीटोनिटरइल समाधान में pkci भंग में सहायता करता है. इसके अलावा, यह बहुत ही विलायक सावधानी से मिश्रण महत्वपूर्ण है, के रूप में चरण २.७ में उल्लिखित । gnp/pkci हाइब्रिड अच्छी तरह से तैयार नहीं किया जाएगा अगर इन कदमों को ठीक से नहीं किया जाता है, इस के एकत्रीकरण के कारण-δ pkci पेप्टाइड23.
जीएनपी आधारित दवा निर्माण कई फायदे प्रदान करता है । सबसे पहले, gnps आसानी से नियंत्रित आकार में संश्लेषित किया जा सकता है, कुछ नैनोमीटर से ~ १०० एनएम को लेकर । आमतौर पर, छोटे आकार gnps कोशिकाओं में अधिक कुशलता से छोटे लोगों को आसानी से अपने लक्ष्य24क्षेत्र में फैलाना कर सकते हैं के रूप में दवाओं वितरित कर सकते हैं. दूसरा, gnps विट्रो में गैर विषैले और vivo25में कर रहे हैं, उंहें सुरक्षित दवा वाहक बना । तीसरा, हाइड्रोफोबिक दवाओं संशोधित gnps26पर लोड किया जा सकता है । आगे, gnps की सतह रसायन आसानी से विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया गया है. हमारे अध्ययन में, दो कम पेप्टाइड के लिए gnp सतह को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है, उन्हें शारीरिक स्थितियों में स्थिर और नई bioactivities प्रदान. पेप्टाइड्स सोच समझकर सोने की बाइंडिंग, रिक्ति, और कार्यात्मक क्षेत्रों सहित तीन क्षेत्रों के साथ डिजाइन किए गए थे । विशेष रूप से, पेप्टाइड के एन टर्मिनस सिस्टीन (ग) थियोल समूह है कि सोने के साथ बांध कर सकते हैं युक्त अवशेष है । मध्य भाग में चार हाइड्रोफोबिक ऐलानिन अवशेष हैं जो पेप्टाइड असेंबली को gnps पर घनी पैक मोनोलेयर में बढ़ावा देते हैं । C टर्मिनस में एमिनो एसिड एक कार्यात्मक एमिनो एसिड है जो जावक की ओर इशारा करता है, जिसका उपयोग gnps की सतह के गुणों में हेरफेर करने के लिए किया जा सकता है । इन दो पेप्टाइड्स का 95:5 अनुपात एक पिछले अध्ययन में व्यवस्थित रूप से चुना गया था14. pkci और P2/P4 पेप्टाइड्स के बीच अनुपात भी प्रणालीनुसार परीक्षण किया गया था और चयनित15.
दूसरी ओर, जीएनपी ड्रग डिलीवरी सिस्टम की सीमाएं हैं । gnps सेल प्रकार या ऊतक विशिष्ट नहीं हैं । gnps मुख्य रूप से फेफड़े, जिगर में संचित कर रहे हैं, और प्लीहा नसों के बाद प्रशासन27,28,29. अब तक इस फार्मूले का केवल सेल कल्चर और छोटे पशु मॉडलों में ही परीक्षण किया गया है । यह नैदानिक आवेदन करने के लिए अनुवाद करने के लिए, बड़े पशु मॉडल और उसके फार्माकोकाइनेटिक्स, ऊतक वितरण और संभावित विषाक्तता पर आगे के अध्ययन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों के पास इस प्रोजेक्ट पर कुछ भी खुलासा नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (pjt-१४८८४७), अनुसंधान और ओंटारियो के नवाचार मंत्रालय (RE-08-029), और कनाडा के पहले अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित है उत्कृष्टता कार्यक्रम, चिकित्सा के टोरंटो विश्वविद्यालय में डिजाइन द्वारा । डॉ. mingyao लियू जेंस और मरियम डवी कुर्सी फेफड़ों की चोट, मरंमत, और उत्थान में है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| negatively charged glutamic acid peptide (P2) | CanPeptide | Sequence: CAAAAE-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| hydrophobic tryptophan peptide (P4) | CanPeptide | Sequence: CAAAAW-NH2 Length: 6aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| δPKCi peptide | CanPeptide | Seqeuence: CSFNSYELGSL-NH2 Length: 11aa Modification: C-terminal amidation Quantity: 50mg Purity: >95% |
|
| Conical tube(50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Conical tube(15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicator | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Gold nanoparticle solution | Ted Pella | 15705-5 | A particle size is 20nm |
| Rocking Platform shaker | VWR international | 40000-304 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Acryl cuvette | SARSREDT | 67.758 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
References
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