Induktion af Intestinal Graft - versus host klovesyge og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Summary

Vi præsenterer her, en protokol, der beskriver allogene hæmatopoietisk stamcelletransplantation og tillader gentagne mini-endoskopisk evalueringer af den distale colon på levestedet for tilstedeværelse, egenskaber og sværhedsgraden af Colon betændelse i live mus lider af intestinal graft - versus - host sygdom.

Abstract

Akut graft - versus - host-sygdommen (GvHD) repræsenterer den mest alvorlige komplikation at patienter tidligere i allogen hæmatopoietisk stamcelle transplantation (allo-HCT) ansigt og er ofte forbundet med en dårlig klinisk resultat. Stykke tid, for eksempel GvHD manifestationer af huden er normalt lydhør over for etablerede immun-undertrykkende behandlingsformer og, derfor, tage ikke en fatal kurs, tilstedeværelse og intensiteten af intestinal GvHD, især af de mid-til-nedre dele af tarmen, påvirke stærkt resultatet og samlet overlevelse af patienter med akut GvHD. terapeutiske muligheder er hovedsagelig begrænset til de klassiske immun-undertrykkende agenter giver kun moderat sygdom-formildende effekter. Derfor, detaljeret viden om væv-resident immun kaskade, ændringer i den tarmens mikrobiota, og stromale svaret før, på og efter tarm GvHD indsættende det er tvingende nødvendigt at forstå de begivenheder og underliggende mekanismer sin patogenese og udvikle nyskabende terapeutiske muligheder. Murine modeller af GvHD er ofte ansat til at identificere og funktionelt vurdere molekyler og veje derfor køre intestinal GvHD. Dog mangler midler til specielt at overvåge og evaluere tarmbetændelse over tid væsentlige da etablerede noder til at vurdere og grade akut GvHD rutinemæssigt består af forskellige parametre, som snarere afspejler systemisk GvHD manifestationer. Den detaljerede evaluering af intestinal GvHD er blevet begrænset til undersøgelser ved hjælp af aflivede mus, derved hovedsagelig undtagen længderetningen (dvs., kinetic) analyser af Colon rum under en given eksperimentelle tilstand (fx antistof-medieret blokade af en proinflammatoriske cytokin) i levende mus (dvs., i vivo). Mini-endoskopisk in situ vurderingen af den distale colon af allo-HCT-behandlede mus beskrevet her tillader en) en detaljeret makroskopisk evaluering af forskellige aspekter af tarmbetændelse og b) mulighed for at indsamle vævsprøver for downstream analyser på forskellige tidspunkter i løbet af observationsperioden. Generelt, den mini-endoskopiske tilgang giver et stort fremskridt i prækliniske noninvasive overvågning og vurdering af intestinal GvHD.

Introduction

Hæmatopoietisk maligniteter som hidrører direkte fra hæmatopoietisk stamcelle rum og ukontrolleret, er hurtigt forløber, og svær immun-medierede sygdomme ofte tegn på at udføre allo-HCT^1,2. Selv om regnskab for forekomst af prognostiske gavnlige graft-versus-tumor respons, er donor lymfocytter dog ofte overtalelse og fremme en uønsket immun-medieret angreb af sunde væv komponenter i allo-HCT modtageren , en proces, der kaldes graft - versus - host-sygdommen³. Manifestationer i tarmen, den såkaldte intestinal GvHD, repræsenterer den mest frygtede komplikation til akut GvHD, alvorlige former som er rutinemæssigt forbundet med en høj dødelighed^1,2,4.

Samlede, murine modeller af allo-HCT er dukket op som uvurderlige værktøjer til at identificere og undersøge immun-medierede mekanismer patogenesen af GvHD⁵. Dog kinetic vurdering af, for eksempel, gavnlige virkninger af nye terapeutiske interventioner over tid i levende mus er rutinemæssigt baseret på bestemmelse af kliniske GvHD scorer⁶. Mens disse scores er egnet til at afspejle, for eksempel, den samlede sygdom byrde (dvs. den systemiske GvHD), kliniske scorer manglende følsomhed for at pålideligt spejle orgel-specifikke manifestationer (f.eks., i tarmen). Derfor, konklusioner, for eksempel med hensyn til gut-beskyttende virkninger af en given terapeutisk intervention, der er baseret på disse scoring systemer normalt kommer til kort.

Trods store fremskridt gennem opfindelsen af romanen hele kroppen imaging modaliteter i kombination med brug af enten en bioluminescerende eller fluorescerende genetiske mus modeller^7,8, metoder til direkte og specifikt vurdere den intestinale manifestation af GvHD i levende mus mangler. Rationalet bag protokollen af endoskopisk vurderingen af intestinal GvHD fænotype beskrevet i næste afsnit er derfor, at overvinde denne hindring. Motivationen er derudover også at reducere eksperimentelle mus tal siden hidtil, en detaljeret vurdering af de cellulære, morfologiske og molekylære karakteristika (f.eks., ved histopatologi eller Molekylærbiologi) af intestinal GvHD manifestation har i sidste ende kræves ofringen af eksperimentelle musen.

Vores institution har tidligere rapporteret på metode for en mini-endoskopisk vurdering af Colon manifestationer i løbet af syngeneic colitis modeller⁹. I protokollen præsenteres her, har vi forfinet og tilpasset den colonoscopic scoring matrix for alloresponse-drevet colitis i levende mus med tarm GvHD ved transplantation af alloreactive HCT og donor lymfocytter i en MHC klasse jeg helt forkert indstilling . Vi identificerede fire parametre egnet til at afspejle intestinal GvHD-relaterede Colon læsioner. Desuden, vi etableret et system, der tillader en finjusteret sortering af en enkelt faktor, hvilket resulterer i en ny score, der let informerer læseren om sværhedsgraden af intestinal GvHD stede i en given musen på et givet tidspunkt. Histopatologisk analyser bekræftet, at en endoskopisk score over en vis tærskel er pålideligt at forudsige moderat til høj grade væv betændelse. Derfor, mini-endoskopisk evaluering synes at repræsentere en arbejdende erstatning for den guld standard histopatologisk undersøgelse, der rutinemæssigt kræver ofringen af de eksperimentelle mus. Vigtigst, denne protokol kan anvendes til næsten enhver given tid og kan bruges flere gange i løbet af sygdommen^10,11. Desuden, i modsætning til brugen af bioluminescens-afhængige tilgange, ingen labor-intens og tidskrævende foranstaltninger som intercrossing genetisk modificerede mus er påkrævet, og dermed metoden kan anvendes på stort set alle mus linje af interesse.

Taget under ét, givet den skadelige klinisk perspektiv af allo-HCT patienter med svær intestinal GvHD, er hurtige videnskabelige fremskridt og større indsigt i de molekylære mekanismer bag immun patogenesen tvingende nødvendigt. Vigtigt, etiske overvejelser kræver ligeledes, at gevinst på viden bør opnås med brugen af det minimale antal eksperimentelle mus. Derfor anerkendte både fordringer på Fællesskabets forskning at udforske intestinal GvHD kan være avanceret ved at gennemføre serie mini-endoskopisk evalueringer af tyktarmen i eksperimentelle arbejde kæden til at overvåge og grade intestinal GvHD i live eksperimentelle mus modeller, som beskrevet og valideret i protokollen præsenteres her.

Protocol

De eksperimentelle metoder beskrevet her er blevet godkendt af regeringen i Mittel, Bayern, Tyskland.

1. GvHD induktion

1. Dag 0: Kroppens samlede bestråling af de modtagende mus
   1. Bruge kvindelige CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c mus der er mindst 10 uger gammel som modtagere.
   2. Vejer og vægt af de modtagende mus før GvHD induktion.
      Bemærk: Sikre, at modtageren har en minimal vægt 20 g. Start kropsvægten vil tjene som referenceværdi til at beregne vægttab af de individuelle mus i løbet af GvHD induktion og progression.
   3. Placere op til fem mus i beholderen for X-ray irradiator.
   4. Bestråle mus af kroppens samlede bestråling med en enkelt dosis af 8 Gy af X-ray. Brug Cs¹³⁷ som stråling kilde.
2. Dag 1: Rekonstituering af bestrålede mus med T-celle-forarmet knoglemarv
   BEMÆRK:Transplantation af allogen knoglemarv celler, som skitseret og detaljeret henhold til afsnit 1.2, bør finde sted inden for 24 timer efter bestråling. Udføre de procedurer, der er beskrevet nedenfor i en steril vævskultur hætte og bruge filtreret reagenser. Bruge allogen CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl mus som donorer for T-celle-forarmet knoglemarv.
   1. Aflive CD45.1/Ly5.1 B6. SJL mus, der vil donere allogen knoglemarv celler i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer, 12-24 timer efter bestråling af de modtagende BALB/c mus. For dette, bedøver CD45.1/Ly5.1 B6. SJL mus ved indånding af 5% isofluran. Fortsætte med isofluran eksponering over 1 min efter vejrtrækning anholdelse og bekræfte eutanasi af cervikal dislokation.
   2. Desinficere pels og hud af musen grundigt med 70% ethanol.
   3. Position med musen på en ren arbejder kappe, så musen er i en udsat position, med sine bagfjerdinger vender eksperimentatoren. Løft pels på akilleshæl med spidsen af en Semken pincet med en længde på 13 cm og savtakket buede tips. Incise hud mellem pincet og hæl med hærdet 8,5 cm fin saks med lige tips.
   4. Aflang snit cranially (dvs. fra hæl over lavere ben og lår til hofte-regionen). Fjerne hud og pels fra hind lemmer ved hjælp af pincet.
   5. Udføre den samme procedure på de andre hind Lem.
   6. Fjerne hind lemmer ved at skære gennem de tilstødende hofteled.
   7. Skære væk de bagerste poter. Skære igennem knæleddet. Lagring af låret og skanken af hver hind lemmer sammen i en 92 mm petriskål fyldt med phosphat bufferet saltvand (PBS) løsning på is.
   8. Ren femur og tibia knoglerne forsigtigt ved at fjerne så meget muskelvæv som muligt fra hvert lår og skaft. Overføre femur og tibia knoglerne til en 50 mL tube fyldt med sterilt RPMI 1640 medium og læg det på våde is indtil alle skinnebenet og lårbenet knogler indsamlede i trin 1.2.7 er renset fra muskelvæv.
   9. At isolere knoglemarven, overføre en lårben eller tibia knogle på et tidspunkt (som er blevet renset som beskrevet i trin 1.2.8) fra 50 mL tube til en petriskål (med en diameter på 92 mm) fyldt med RPMI 1640 medium. Skær enderne af lårben eller tibia med en skalpel til at få adgang til hulrummet af den knogle, som indeholder knoglemarven.
   10. Forberede en 50 mL collection tube med 5 mL af RPMI 1640 medium. Indsæt en 26 G kanyle tilsluttet en 1 mL sprøjte fyldt med 1 mL af RPMI 1640 medium i knoglen hulrum og skylle knoglemarv ud af hulrummet i collection tube ved at skubbe stemplet.
   11. Gentag trin 1.2.10 indtil knoglen vises lyse og skinnende (dvs. knogle hulrummet er synligt rødlig knoglemarv). Kassér den tomme knogle.
   12. Gentag trin 1.2.9 - 1.2.11, ved hjælp af alle femur og tibia knogler fra trin 1.2.8, og indsamle alle gendannede knoglemarv stykker i samme 50 mL collection tube fra trin 1.2.10. Holde samling røret på våde is, indtil alle knogler fra trin 1.2.8 er blevet behandlet i overensstemmelse hermed.
   13. Oprette en enkelt celle suspension af sagte pipettering blussende, smuldrende knoglemarv stykker op og ned. Filtrer knoglemarv encellede suspension via en 40 µm mesh skærm celle si placeret på en ny 50 mL collection tube.
   14. Centrifugeres 50 mL collection tube som indeholder knoglemarven encellede suspension ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
   15. Resuspenderes i 5 mL af ACK lysing buffer (1 mM Na₂EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) for røde blodlegemer lysering. Inkuber cellesuspension til 3 min. ved stuetemperatur. Bagefter, straks tilsættes 10 mL PBS løsning til cellesuspension.
   16. Centrifugeres suspension ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend celler i 2 mL PBS løsning.
   17. Tælle knoglemarv celler, ved hjælp af en hemocytometer. Bevare en alikvot af 6 x 10⁶ celler til flow flowcytometri analyse at tjekke renheden af cellerne efter celle rensning (Se trin 1.2.20).
   18. Udtynding af T-celler fra knoglemarven encellede suspension, bruge en kommercielt tilgængelig celle rensning kit. Magnetisk nedbryder CD90.2⁺ celler (dvs. lymfocytter) fra de samlede knoglemarv celler, efter producentens protokol.
   19. Tælle de T-celle-forarmet knoglemarv celler, der har været isoleret, som beskrevet i trin 1.2.18, ved hjælp af en hemocytometer. Bevare en alikvot af 1 x 10⁶ celler til flow flowcytometri analyse udføres senere, som beskrevet i trin 1.2.20.
       Bemærk: På gennemsnit celle udbyttet stammer fra en donor mus er normalt fra 2 x 10⁷ til 3,4 x 10⁷ T-celle-forarmet knoglemarv celler.
   20. Bekræfte en vellykket T-celle nedbrydningen ved flowcytometri. Pletten 1 x 10⁶ celler, bevaret fra trin 1.2.17 (knoglemarv celler før magnetiske celleseparering) og 1.2.19 (T-celle-forarmet knoglemarv celler efter magnetiske celleseparering), med følgende antistoffer: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 ( GK1.5), og α-CD8α (53-6.7). Bruge de resterende celler fra trin 1.2.17 som en unstained kontrol og single-farvning kontrolelementer til at konfigurere flow Flowcytometret.
       1. Overføre 1 x 10⁶ celler fra hver prøve til et godt af en 96-brønd plade med en V-bund til at udføre flow cytometric farvning procedure.
       2. Spin ned celler i 96-brønd plade (trin 1.2.20.1) på 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend celler i 100 µL af FACS buffer (PBS suppleret med 3% filtreret bovint serum).
       3. Centrifugeres celler i 96-brønd pladen på 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
       4. Tilføje en passende mængde antistof valg (Sammenlign med trin 1.2.20) til prøverne for enkelt farvning i 100 µL af FACS buffer.
       5. Forbered en blanding af alle antistoffer (master mix) indeholdende de passende mængder tilstrækkeligt til separat pletten knoglemarv celle delprøver bevaret fra forudgående (Se trin 1.2.17) og efter (Se trin 1.2.19) magnetiske T-celle nedbrydningen. Tilføje 100 µL af de master mix til begge delprøver.
       6. Tilføj kun 100 µL af FACS buffer til den unstained prøve.
       7. Inkuber celler i 96-brønd pladen i 20 min. ved 4 ° C i mørke.
       8. Tilsæt 100 µL af FACS buffer og centrifugeres celler i 96-brønd pladen på 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend celler i 100 µL af FACS buffer.
       9. Centrifugeres celler ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend celler i 250 µL af FACS buffer.
       10. Overføre prøverne til en 5 mL polystyren runde-nederste rør og analysere dem med et flow forskellige instrument, der er i stand til at opdage de fluorescerende molekyler, der blev brugt til at mærke de antistoffer, der er ansat til at karakterisere de celle prøver (Se trin 1.2.20).
       11. Sammenligne den celle sammensætning fra før og efter den magnetiske celleseparering.
           Bemærk: En renhed på ca 95% CD45.1⁺CD3^- (dvs. T-celle-forarmet knoglemarv) celler i den levende gate opnås normalt.
   21. Vaske T-celle-forarmet knoglemarv celle suspensioner 2 x med PBS løsning (x 450 g i 5 min. ved 4 ° C) og endelig resuspend celler i PBS løsning, justere celle koncentration på 5 x 10⁷ celler/mL. Hold celler på våde is indtil injektion.
   22. Indsprøjtes T-celle-forarmet knoglemarv celler i de modtagende mus, som blev bestrålet dagen før (Se afsnit 1.1).
       1. Opstille den eksperimentelle mus i en lækagetætte kammer og fremkalde anæstesi ved inhalation af op til 4% isofluran, indtil musen er ubevidste. Bekræfte analgesi og tab af bevidsthed ved at teste tabet af den oprettende refleks og efterfølgende tab af pedalen trække refleks.
       2. Indsprøjtes 5 x 10⁶ T-celle-forarmet knoglemarv celler (dvs. 100 µL af 5 x 10⁷ celler/mL) der indeholder PBS løsning ved hjælp af en 1 mL sprøjten udstyret med en 30 G nål intravenøst i retrobulbær rum indeholdende den venøse sinus.
3. Dag 2: Overførsel af T-celler
   Bemærk: Udføre de beskrevne procedurer nedenfor i en steril vævskultur hætte og bruge filtreret reagenser. Brug CD45.2 C57Bl/6 (wild-type; WT) mus som donorer til alloreactive T celler. Brugen af congenic markør systemer giver mulighed for distinguishability mellem modtageren (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c mus) og donor hæmatopoietisk celletyper (knoglemarv celler: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL mus; allogen T celler: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 mus).
   1. Aflive C57Bl/6 mus i overensstemmelse med de gældende institutionelle retningslinjer og myndigheder. Derfor bedøver mus ved inhalation med en koncentration på 5% isofluran. Fortsætte isofluran eksponering indtil 1 min efter vejrtrækning anholdelse og bekræfte eutanasi af cervikal dislokation. Desinficere pels og hud af musen grundigt med 70% ethanol.
   2. Placere en si med en 40 µm mesh skærm på en 50 mL collection tube. Fjerne milten og placere det på sien.
   3. Med en sprøjte stemplet, comminute milt i sien. Vask si og sprøjte stemplet med PBS til at indsamle alle splenocytes.
   4. Centrifugeres celler i 50 mL collection tube på 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten.
   5. Resuspend splenocytes i 3 mL af ACK lysing buffer til at lyse røde blodlegemer. Inkuber cellesuspension til 3 min. bagefter, der tilsættes 10 mL PBS og centrifugeres celler ved 450 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend splenocytes i PBS.
   6. Tælle milt celler, ved hjælp af en hemocytometer. Aflede en alikvot af 6 x 10⁶ celler til flow flowcytometri analyse, at vurdere omfanget af rensning i trin 1.3.9.
   7. For en total CD3⁺ T-celle isolation fra total splenocytes, bruge en kommercielt tilgængelig celle rensning kit. Isolere milt T celler, efter producentens protokol.
   8. Tælle milt CD3⁺ T celler isoleres som beskrevet i trin 1.3.7, ved hjælp af en hemocytometer. Bevare en alikvot af 1 x 10⁶ T celler for flow flowcytometri analyse.
      Bemærk: På gennemsnittet udbytte af milt T celler pr. donor mus isoleret af magnetiske celleområder adskillelse fra 1,3 x 10⁷ -2 x 10⁷ celler.
   9. Bekræft succes af T-celle isolation ved flowcytometri. For en detaljeret beskrivelse af farvning protokollen, konferere og følg trin 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Pletten 1 x 10⁶ splenocytes af trin 1.3.6 (før den magnetiske celleseparering) og 1.3.8 (efter magnetiske celleseparering) med følgende antistoffer: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6.7).
      2. Bruge de resterende celler fra trin 1.3.6 som en unstained kontrol og for enkelt farvning med de respektive antistoffer til at konfigurere flow Flowcytometret.
      3. Sammenligne den celle sammensætning før og efter magnetiske celleseparering.
         Bemærk: Renhed ≥95% CD45.2⁺CD3⁺ T celler i lymfocyt live gate bør være fuldført.
   10. Vask af T-celler 2 x med PBS (450 x g i 5 min. ved 4 ° C) og endelig resuspend celler i PBS løsning, justere celle koncentration til 7 x 10⁶ celler/mL. Hold celler på is indtil injektion.
   11. Injicere alloreactive, milt T celler (Se trin 1.3.10) til bestrålede BALB/c mus, der tidligere har modtaget CD45.1⁺ T-celle-forarmet knoglemarv celler (Se trin 1.2.22).
       1. Fremkalde anæstesi ved at placere den eksperimentelle mus i en lækagetætte kammer, hvor det er udsat for op til 4% isofluran, indtil den mister sin bevidsthed. Bekræfte analgesi og tab af bevidsthed ved at teste tabet af den oprettende refleks og efterfølgende tab af pedalen trække refleks.
       2. Injicere 0,7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T celler ved hjælp af en 1 mL sprøjten udstyret med en 30 G nål   (dvs., 100 µL af 7 x 10⁶ celler/mL) der indeholder PBS løsning (Se trin 1.3.10), intravenøst i retrobulbær plads af mus, at inducere GvHD. Denominate disse mus som den eksperimentelle gruppe.
       3. Indsprøjte en anden gruppe af mus med 100 µL af PBS alene, intravenøst i retrobulbær plads, og denominate denne gruppe som kontrolgruppe, senere kaldet "no-T-celle-transplanteret (ikke) mus".

2. vurdering af systemisk GvHD

Bemærk: Udføre denne procedure i en semi-sterile omgivelser i en eksperimentel room licens og udstyret til at håndtere levende mus i animalsk havnefaciliteten.

1. Følg det kliniske forløb af GvHD i individuelle mus; specifikt, vurdere og score de eksperimentelle mus 3 x om ugen for tilstedeværelse af klinisk GvHD symptomer, baseret på et pointsystem, der er beskrevet nedenfor og tilpasset fra et pointsystem, der er oprettet tidligere ved Cook et al.⁶.
   1. Vejer hver mus individuelt, vægten, og beregnes thespecific krop vægttab i forhold til kropsvægten, der blev fastsat inden påbegynder forsøget (svarende til 100%) på dag 0 (trin 1.1.2). Score et vægttab på mindre end 10% af startvægt med grade 0, et vægttab mellem 10% og 25% med grade 1 og et vægttab på mere end 25% med grade 3.
   2. Score aktivitetsniveau i hvert mus, diskriminerende mus med et normalt aktivitetsniveau (score = 0) fra mus med en moderat nedsat aktivitetsniveau (score = 1) og mus med stationær funktionsmåde medmindre de er eksternt stimuleret (score = 2).
   3. Score skind tekstur, dermed diskriminere en normal, skinnende og moderne pels (score = 0) fra en moderat pjusket pels (score = 1) og tilstedeværelsen af skaldede pletter (score = 2).
   4. Score huden tekstur, diskriminerende normal hud (score = 0) fra sporadiske steder af skalering hud (fx på halen og poterne) (score = 1) og indlysende skalering og øm hudområder (score = 2).
   5. Analysere sammenhængen mellem udskilles afføring fraktioner. Score Taburet med en normal (dvs., hårde konsistens) med grade 0, Taburet med deformerbare og blød Taburet med grade 1 og afføringen uden nogen sammenhæng og dermed, med svær diarré med klasse 2.
   6. Opsummere alle separat scorede parametre til en maksimal kliniske score 12 / mus.
2. Overveje og evaluere kriterier af ophører eksperiment på grund af den aktuelle sygdom alvorsgraden af den individuelle mus, i overensstemmelse med de gældende institutionelle retningslinjer og autoriseret animalske protokol.

3. vurdering af Intestinal GvHD

1. Scoring af GvHD-relaterede læsioner af mini kikkertundersøgelse af den distale kolorektal region
   BEMÆRK:Udfør dette i en semisterile omkring i en eksperimentel room licens og udstyret til at håndtere levende mus i animalsk havnefaciliteten. Bruge en mini-endoskopisk arbejdsstation, der er godkendt til brug for små dyr.
   1. Forberede den endoskopiske enhed ved at dække teleskop (diameter af 1,9 mm) og en længde på 10 cm med endoskopisk undersøgelse kappe. Rengøre og sterilisere endoskop med vand og ethanol.
   2. Tænd computeren, justerbar xenon lyskilde og kameramodul, og sætte fokus på en måde, at genstande tæt på linsen giver et klart billede.
   3. Tilslut luftpumpe til endoskopisk kappe. At visualisere luftstrømmen, dyppe spidsen af endoskopet i et bægerglas glas fyldt med vand. Regulere luftstrømmen ved at justere ventil mellem luftpumpe og endoskopisk kappe. Justere det til en langsom og konstant luftstrøm, afspejles af et par kontinuerligt stigende bobler.
   4. Placere en mus i en lækagetætte kammer. Inducere anæstesi ved inhalation af op til 4% isofluran indtil musen er ubevidste. Bekræfte analgesi og en fraværende stat for reflekser ved at teste tabet af den oprettende refleks og efterfølgende tab af pedalen trække refleks.
   5. Brug en passende veterinære anæstesi maskine i henhold til animalsk protokollen anvendes. Overføre musen fra salen til arbejdsområdet koloskopi. Holdning den bedøvede mus, med sin næse i den nosecone (som er forbundet til anæstesi instrument), på en ren arbejder her, kappe så musen er i en udsat position, vender eksperimentatoren med sin bagfjerdinger.
   6. For at opretholde anesthesia under koloskopi procedure, reducere isofluran koncentration til ca. 2%. Overvåge musens respiration og respons på stimulation under koloskopi og justere isofluran koncentration på vaporizer, hvis nødvendigt. Dække muss øjne med salve til at forhindre dem i at komme tørre.
   7. Kontrollere effekten af anæstesi ved at klemme mellem tæerne af musen. I tilfælde af fraværende reaktivitet, Fortsæt til trin 3.1.8.
   8. Løfte halen lige over hale-roden med den ene hånd og omhyggeligt indsætter endoskopet, placeret i anden hånden, via anus ind i endetarmen.
   9. Mens luftstrømmen puster kolorektal lumen, langsomt og forsigtigt flytte endoskopet frem i aboral retning.
   10. Placer endoskop midt i Colon lumen og opretholde denne position for at minimere kontakt med Colon væggen og undgå at lave ridser, dybere væg-relaterede skader (f.eks., resulterer i blødning), eller endda væg perforation (Se trin 3.1.17) . Styre dette trin ved at permanent se videostream (dvs. under konstant visualisering af Colon rum).
   11. Hvis afføring snøre visningen, skal du fjerne endoskopet og udføre et lavement ved rektalt gennemskylning med op til 2 mL saltvand, ved hjælp af en blød Pasteur pipette. Bruge som lille væske som muligt, for at undgå en utilsigtet fortynding af afføring og andre sekundære virkninger negativt påvirker Karakteristik af slimhinden og i sidste ende de scoring resultater.
   12. Prøv at regelmæssigt placere endoskopet på en defineret (dvs., tydelig) anatomiske websted i den distale colon at standardisere scoring af Colon betændelse og at optimere sammenlignelighed af scoring resultater mellem mus og på tværs af eksperimenter.
       Bemærk: Normalt, med den stive endoskop, kan en maksimal dybde på 4 cm nås via den rektal rute. Mellem 2 og 4 cm aborally, forvandles tyktarmen jævnligt til et flexure, der ikke kan overføres med den stive colonoscope. Bruge kolon regionen distalt støder op til flexure som standard scoring spot.
   13. Begynde at optage video-stream og begynder med scoring af betændelse.
   14. Evaluere GvHD-relaterede betændelse i tyktarmen ved at score parametre beskrevet og afbildet i tabel 1 og figur 3.
       1. Flytte endoskopet på scoring stedet forsigtigt og lidt tilbage - og frem for at vurdere de forskellige parametre.
       2. Vurdere parameteren "gennemskinnelighed", samt "afføringen konsistens", ved at placere endoskopet i en bredere afstand i forhold til Colon væggen.
       3. Vurdere parametre "nøjagtighed" og "vaskularisering" ved at placere endoskopet i tæt nærhed til Colon væggen. Til denne opgave, omhyggeligt gælde godt doseret spænding til Colon væggen med spidsen af endoskopet.
   15. Efter afslutningen af scoring processen, stoppe optagelsen.
       Bemærk: Bagefter, kan den optagede videoklip bruges samlet eller bruges til at generere repræsentative billeder (dvs., screenshots) mini-endoskopisk vurderede kriterier generelt bidrager til Colon betændelse.
   16. Fjern forsigtigt endoskopet.
   17. Afbryde isofluran exposition ved at overføre musen til et separat bur, hvor det er udsat for luftens. Varm musen med et rødt-lys lampe og observere musen, indtil den genindvinder fra narkose og genvinder fuld bevidsthed.
       Bemærk: På grund af luft inflationen af tyktarmen under endoskopi, kan musen maveregionen vises kvældet op direkte bagefter. Mens dette er normalt og af forbigående art, kunne langvarig tegn på massive og selv progressive inflation af maven og manglende inddrivelse af mus indikere en utilsigtet perforation af tyktarmen (i dette tilfælde, at musen skal aflives straks).
   18. Efter fuldstændig genopretning, skal du placere musen tilbage i sit respektive bur.
   19. Valgfri tilgang: det er også muligt at tage view-styrede væv biopsier. Tage følgende skridt.
       Bemærk: Koloskopi vil blive udført på samme måde som beskrevet i trin 3.1.1 - 3.1.18, med følgende ændringer.
       1. I trin 3.1.1, skal du bruge en endoskopisk undersøgelse kappe med en indbygget arbejder kanal, i stedet for en enkel undersøgelse kappe uden arbejde kanaler, til at dække teleskopet. Indføre en biopsi pincet i arbejde-kanal, indtil spidsen er kun synlige foran endoskopet på videoskærmen fordi dette i høj grad forhindrer utilsigtet skade på tarmen.
       2. Fortsæt med trin 3.1.2 - 3.1.11. Indsæt endoskopet ind i tyktarmen og skubbe det nøje frem til stedet af interesse.
       3. Ansætte ved hjælp af en anden eksperimentatoren for opgaven med at tage Colon væv biopsier. Spørg den anden eksperimentatoren at navigere spidsen af biopsi pincet til Colon omkring valg af skubber pincet inden for den arbejdende kanal langsomt fremad indtil kæberne på tang kan åbnes. Hele tiden se video stream under denne procedure til at minimere risikoen for sårede Colon væggen.
       4. Gendanne et kolon væg vævsprøve af forsigtigt åbne og lukke kæberne af biopsi pincet.
          Bemærk: Gøre det med forsigtighed for at forhindre perforation af kolon væg. I de sjældne tilfælde af en Colon perforation, ofre straks den berørte musen ved at anvende målinger i overensstemmelse med retningslinjerne for institutionelle og under den løbende administration af anæstetika.
       5. Trække sig tilbage og fjerne den lukkede pincet ud af arbejde kanal. Tag prøven fra kæberne af biopsi pincet ved dypning og omhyggeligt ryster den åbnede pincet i steril PBS løsning. Bagefter, vælge korrekt opbevaringsforhold for vævsprøve, i overensstemmelse med de planlagte downstream analyser. Efter desinfektion med 70% ethanol, kan pincet genbruges til at træffe yderligere biopsier.
       6. Efter at have taget biopsier, fjerne endoskopet og afslutte koloskopi som beskrevet i trin 3.1.16 - 3.1.18.
2. Histopatologisk analyse
   1. Mellem dage 26 og 30 efter X-ray bestråling, aflive allo-HCT recipient mus i overensstemmelse med anvendelsen af institutionelle retningslinjer og myndigheder. For dette, bedøver mus ved indånding af 5% isofluran. Fortsætte med isofluran eksponering for 1 min efter vejrtrækning anholdelse og bekræfte eutanasi af cervikal dislokation. Grundigt desinficere pels og hud af mus med 70% ethanol.
   2. Åbn i bughulen og fjerne tyktarmen. Overføre det til en petriskål (med en diameter på 92 mm) med PBS.
   3. Fyld en 5 mL dispenser tip med PBS. Ved hjælp af en Semken pincet med en længde på 13 cm og savtakket buede tips, slip den distale del af tyktarmen (ca. 5 mm) over spidsen af dispenser tip. Omhyggeligt fix tyktarmen med pincet i dispenser spidsen og skylle tyktarmen med PBS ved at trykke ned stemplet af dispenser tip til at fjerne afføring fra tarmen.
   4. Skære en Colon segment beliggende omkring 5 mm fra anus, ved hjælp af en skalpel.
   5. Fix resektion gut modellen med 4,5% formaldehyd natten over. Før integrere det i paraffin, skal du placere vævet i en oprejst position.
   6. Snit 3 µm cross dele af paraffin-embedded tyktarmen væv og bejdse dem med hæmatoxylin og eosin (han), ved hjælp af standard farvningsprotokoller.
   7. Forberede han-farvede tværsnit af kolon vævsprøver.
   8. Tilpasset fra matrixen scoring rapporteret af Kaplan et al.¹², histopathologically score den inflammatoriske aktivitet semiquantitatively, med score fra 0-3: ingen betændelse (score = 0), mild betændelse (score = 1), moderat betændelse (score = 2), og svær betændelse (score = 3).
      Bemærk: Ideelt, ansætte for denne opgave ekspertisen af en patolog, der er oplevet i evalueringen af murine intestinal GvHD og blindet til arten af de eksperimentelle og kontrolgrupper.

Representative Results

Den nuværende protokol, der beskriver den mini-endoskopisk evaluering af intestinal GvHD-associeret læsioner af den distale colon, er etableret og godkendt i mus tidligere udsat for systemisk induktion af en svær akut GvHD model. I denne undersøgelse, brugte vi en MHC klasse jeg fuldt uoverensstemmende modelsystem i hvilke BALB/c mus var lethally bestrålet, efterfulgt af transplantation af T-celle-forarmet allogen knoglemarv og administration af GvHD-inducerende alloreactive C57BL/6 CD3⁺ T-lymfocytter. T-celle-forarmet knoglemarv celler og milt T celler for GvHD induktion blev renset af magnetisk separation. Renheden af disse cellepopulationer blev bestemt ved flowcytometri og repræsentative resultater af rensningsprocessen vises i figur 1, viser en tilstrækkelig nedbrydning af T-celler fra samlede knoglemarv celler og en konsekvent berigelse af milt-afledte CD3⁺ T celler før deres overførsel til tidligere bestrålet mus. Det kliniske forløb vises i figur 2 viser reproducerbar robust induktion af kliniske systemisk GvHD fænotype ved allo-HCT i tilstedeværelse (WT, i sort) vs fravær (ikke grå) af alloreactive donor T lymfocytter. Pointsystemet tidligere rapporteret af Cooke et al. repræsenterer en sum kerne, hvor seks parametre vurderes og sorteres: body vægt, kropsholdning, aktivitet, hud og pels tekstur, og afføring konsistens⁶. Control mus erfarne kun én, tidlig forekommende toppen af den kliniske score, mellem dage 5 og 10, der blev ligeledes observeret i T-celle-modtagende mus og er derfor i vid udstrækning den bestråling-associerede systemisk inflammatorisk respons. Uanset, kliniske scoringer af donor T-celle-modtagende mus er begyndt at stige tidligere, viste en højere total peak, kun forbigående faldt efter i første omgang toppede og, hovedsagelig steg derefter igen, løbende, i den resterende periode af den eksperiment. Samlet set er disse resultater enig i den fortolkning, som T-celle-modtagende mus viser stærkere og mere progressive tegn på systemisk GvHD sammenlignet med ikke mus.

Donor T-lymfocytter-modtagende allo-HCT mus viste forskellige tegn på akut Organrelaterede og systemisk GvHD manifestationer, samlet set resulterer i høje sum scores, mens kontrol mus manglede moderat til svær kærlighed, især på senere tidspunkter. Dog er tegn på intestinal GvHD underrepræsenteret i de systemiske GvHD pointsystem, hvor den eneste vurderede gut-relaterede parameter er afføringen konsistens. Som vist i tabel 1, mini-endoskopisk vurderbare kriterier blev defineret, beregnet specielt til præcis beskrivelse, scoring, og klassificering af intestinal GvHD-associeret læsioner, ved at tilpasse kriterierne tidligere rapporteret for evalueringen syngeneic colitis til som led i alloresponse-drevet colitis⁹. Figur 3 viser typiske eksempler for hver enkelt kriterium, illustrerer den type og omfang af intestinal GvHD-associeret læsioner, derved visualisere matrixen klassificering anvendes under mini-endoskopisk evaluering af den distale colon af GvHD-tilbøjelige mus ved transplantation af MHC klasse jeg fuldt uoverensstemmende donor lymfocytter.

Figur 4 A viser, at tarmens GvHD summen score resultater, der er baseret på kriterier fastlagt i tabel 1 og vises i figur 2 let aktivere eksperimentatoren at diskriminere donor lymfocytter-modtagende mus med alvorlige tegn på tarm betændelse fra kontrol mus, der er stort set GvHD. For at validere det mini-endoskopisk baseret klassificeringssystem, blev histopatologiske undersøgelser udført ved hjælp af en tidligere rapporteret mikroskopiske grading system¹². Dataene i figur 4B bekræfte at kolon af mus alvorligt berørt af GvHD-relaterede inflammation, som det fremgår af høj colonoscopic sum scores, display ligeledes stærk histopatologiske tegn på betændelse, givet en histopatologisk opsummere score ≥2 obduktion. Derimod tyktarmen væv af kontrol mus vise nej (score 0) eller på de fleste, mild (score 1) histopatologiske tegn på betændelse i overensstemmelse med de virtuelle fravær af mini-endoskopisk påviselige tegn på colitis. Desuden, som vist i figur 4C, D, vurderet korrelation undersøgelser mellem mini-endoskopisk og histopathologically colitis aktivitet og systemisk GvHD scoringer blev udført. Vigtigere, vist disse undersøgelser, at mini-endoskopisk beslutsomme summen snesevis af ≤3 pålideligt forudsige manglen på midten til højere lønklasse (dvs. ≥2) intestinal GvHD-associerede Colon betændelse scores fremstillet histopatologiske sortering. Endelig, sværhedsgraden af endoskopisk vurderede intestinal GvHD viser en korrelation med den systemiske GvHD aktivitet.

Figur 1 : Flow cytometric kvalitetsvurdering af magnetisk renset T-celle-forarmet knoglemarv celler og allogene milt CD3⁺ T celler. (A) udtømning af CD90.2⁺ knoglemarven cellerne opnået ved magnetisk separation, ved hjælp af en kommercielt tilgængelig rensning kit. Renheden af T-celle-forarmet knoglemarv celler blev bestemt ved flowcytometri, af farvning celler før og efter T-celle nedbrydningen med anti-CD45.1 og anti-CD3. Resultaterne fra et repræsentativt eksperiment er vist. (B) milt T celler var magnetisk renset, ansætte en kommercielt tilgængelig rensning kit. Renheden blev bestemt ved flowcytometri, sammenligne frekvenserne af CD45.2 og CD3 costaining af prøverne stammer fra før og efter T-celle isolation. Resultaterne fra et repræsentativt eksperiment er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Kliniske forløb af GvHD, ansætte en MHC klasse jeg fuldt uoverensstemmende model. For at fremkalde akut GvHD, var BALB/c mus hel-krops bestrålet på dag 0. Musene modtaget T-celle-forarmet knoglemarv celler 24 timer senere (d1). På dag 2, musene blev sprøjtet med allogen milt CD3⁺ T-celler (wild-type [WT]; n = 9). Som kontrol modtaget nogle mus T-celle-forarmet knoglemarv alene (ikke; n = 9). Musene vurderet specifikt tre gange om ugen i forekomsten og sværhedsgraden af kliniske symptomer på GvHD. De viste data repræsenterer middelværdier ± SEM af de kliniske scoringer fra individuelle mus af gruppen angivne behandling fra to repræsentative eksperimenter. Dataene blev analyseret af to-vejs ANOVA, efterfulgt af Bonferronis flere sammenligninger posttest. p < 0,0001 blev betragtet som væsentlig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : Repræsentant billeder illustrerer grading eksempler underliggende matrixen scoring af intestinal GvHD-relaterede kolon ændringer vurderes af en mini-endoskopisk evaluering af koloner i live, allo-HCT-behandlede mus. For at supplere og illustrere den detaljerede beskrivelse af den anvendte scoring sortering og system i tabel 1, repræsentative mini-endoskopisk billeder af de evaluerede prioritetsniveauer (grading) for alle parametre enkeltvis i tyktarmen af bedøvede, levende mus gennemgår allo-HCT mellem dage 26 og 30 før som beskrevet i figur 1 vises her. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4 : Mini-endoskopisk scoring og sortering af intestinal GvHD-relaterede betændelse i tyktarmen, pålideligt forudsige tilstedeværelsen af højere colitis vurderet ved histopatologisk scoring. (A) mellem dage 26 og 29 efter induktion af GvHD som beskrevet i figur 1, manifestation af intestinal GvHD blev evalueret af mini endoskopi i levende, bedøvede mus. Colon ændringer blev scoret og sorteres efter scoring og sortering systemet afbildet i tabel 1 og figur 2. Repræsentative endoskopisk billeder af kontrol (ingen T-celle; ikke) og wild-type (WT), T-celle-modtagende mus og mini-endoskopisk vurderede score (øverst) vises. (B) mus blev ofret 12 timer efter den mini-endoskopiske evaluering, og den distale del af colon blev behandlet og histopathologically vurderes. Hæmatoxylin og eosin farves tværsnit af den distale colon inflammatorisk aktivitet blev gradueret. Repræsentant hæmatoxylin og eosin-sortbejdsede cross dele af den distale colon ingen T-celle - og WT T-celle-modtagende allo-HCT-behandlede mus og den tilsvarende histologi scorer er vist. Dataene i paneler A og B blev analyseret af Student's t-test og er vist som gennemsnit ± SEM. ***p < 0,0001 blev betragtet som væsentlig. WT: n = 15; Ikke: n = 15. Data repræsenterer poolede data fra fire individuelle eksperimenter. (C) indbyrdes afhængighed af koloskopi scoring og histologiske scoring. Tallene vises som boks parceller. Hver skamplet viser median (sort linje inden for hver kasse), vifte af data (min. til max) og kvartiler (områder med hver kasse). WT: n = 15; Ikke: n = 15. Data repræsenterer poolede data fra fire individuelle eksperimenter. (D) korrelation mellem koloskopi scoring og klinisk scoring. Både kontrol og wild-type T-celle-modtagende mus er inkluderet i sammenhæng analysen. Den faste linje repræsenterer en simpel lineær regression. Spearman korrelationskoefficient (r-værdi) og p-værdi er vist. WT: n = 12; Ikke: n = 13. Data repræsenterer poolede data fra tre individuelle eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Score	0	1	2	3
Gennemskinnelighed af Colon væggen	Ekstra tarm, indre organer (fx milten) grundigt synlige	Diskrete reduktion af synligheden af ekstra intestinal organer på grund af mild opacitet af Colon væggen	Moderat reduktion af synligheden af ekstra intestinal organer på grund af betydelig opacitet af Colon væggen	Manglende synlighed af ekstra intestinal organer, dvs. ikke-transparent Colon væg
Granulariteten for	Glat, upåvirket slimhinde overflade udseende; Colon krypt mønster synlige	Diskrete Afslibning og brosten udseende af slimhinden	Moderat ryg og brosten udseende af slimhinden	Svær Afslibning og brostensbelagte udseende af slimhinden; pude-lignende udseende af slimhinden
Vaskularisering	Uforandret vaskulære mønster viser den kommunikerende netværk af små og store fartøjer	Diskrete ændringer af det vaskulære mønster; fartøj mønster synes at kampen	Nogle fartøjer er usynlig; diskontinuerlig fartøj netværk	Kontakt induceret blødning; dot mønster af fartøjer
Afføringen konsistens	Normal; afføringen er hård; fine tråde af slim mellem afføring og Colon væg kan observeres	Afføringen er stadig formet men kan indeholde laset kanter; deformerbare med spidsen af endoskopet	Afføringen er bløde og unshaped afføringen er synligt mere skinnende (højere vandindhold)	Afføringen er løs, flydende; vandig diarré. Afføringen kan blive tilfældigt spredt over slimhinden i tyktarmen

Tabel 1: Mini-endoskopisk scoring og grading matrix intestinal GvHD-relaterede læsioner i tyktarmen af live allo-HCT-behandlede mus. Ændringer af endoluminal og transmural kolon morfologi i allo-HCT forbehandlet mus blev vurderet af en koloskopi af endetarmen og den distale colon bedøvede, levende mus, ved hjælp af en murine mini endoskopi system. Colon læsioner blev klassificeret ved hjælp af endoskopisk pointsystemet (modificeret murine endoskopisk indeks af colitis sværhedsgraden [MEICS]), er udledt fra den oprindelige MEICS pointsystem rapporteret af Becker et al.⁹ og tilpasset som led i Allo-HCT. Den distale colon vurderes visuelt for tilstedeværelsen og omfanget af de følgende fire parametre: 1. transmittans af endoskopisk lys (gennemskinnelighed) gennem Colon tarmvæggen som fortykkelse af væggen; 2. slimhinden viser en cobblestone udseende (nøjagtighed) af endoluminal-orienterede slimhinden; 3. en ændret vascularization mønster (vaskularisering); 4. endoskopisk vurderet taburet udseende på levestedet (afføringen konsistens). Hver parameter er scoret fra 0 (ingen tegn) til 3 (mest alvorlig fænotype), tilføje op til en maksimal sum score 12 / mus.

Discussion

Protokollen beskriver metode til induktion og mini-endoskopisk vurdering af Colon fænotype observeret i løbet af intestinal GvHD. Det tjener det større formål af gør det muligt for forskere at studere intestinal GvHD på langs og noninvasively over det hele sygdomsforløb (dvs. fra starten af Colon manifestation og progression indtil maksimal sygdomsaktivitet).

Der er imidlertid nogle kritiske trin og vigtige begrænsninger iboende at de præsenterede metoder eksperimentatoren skal være klar over, før du installerer teknologier i de respektive videnskabelige sammenhæng. Først, selv om vi har med held brugt mini-endoskopisk vurderingen af intestinal GvHD-relaterede Colon læsioner i en mindre histocompatibility-uoverensstemmende model system¹¹, den angivne protokol her er i øjeblikket udelukkende finder anvendelse på MHC klasse I helt forkerte akut GvHD modeller. Mens MHC klasse jeg fuldt uoverensstemmende GvHD model er almindelige og ofte anvendte⁵, det er veletablerede, at kendetegn GvHD manifestation er meget afhængig af de anvendte mus substrains da det stærkt påvirker, for eksempel, den følsomhed over for bestråling. Eksperimentelle mus kilde med, for eksempel, en varierende sammensætning af tarmens mikrobiota og det anvendte antal overførte allogene T celler kan desuden kritisk påvirke kinetik og dynamik i den intestinale GvHD manifestation¹². Et kritisk trin er derfor til omhyggeligt at teste og validere de angivne foranstaltninger for deres evne til at kunne fremkalde intestinal GvHD som vist.

Med hensyn til en vellykket gennemførelse af de live mini-endoskopisk vurdering af akut intestinal GvHD, vi ønsker at understrege, at mens håndtering endoskopet er ligetil, det kan kræve nogle uddannelse, at minimere risikoen for at opleve de mest frygtede komplikation (dvs., at perforere tarmvæggen med den stive instrument i kombination med behovet for at luft-puste tyktarmen). En øget inflammation-induceret sårbarhed og nedsat fleksibilitet af Colon væv, kan tarm væggen integritet være større risiko under postradiation opvågningsfasen (i.e.,until dag 10) og ved fuld manifestation af tarm GvHD-relaterede colitis (dvs. efter ca dag 25). Vigtigere, men har vi ikke observeret væsentligt øget komplikation priser afhængig af tidspunkt for endoskopi, så længe endoskopet er forsigtigt Avanceret under tilstrækkelig synlighed. Derimod identificerede vi suboptimal drug dosering for at være en risikofaktor, da en utilstrækkelig dybde af anæstesi kan resultere i forekomsten af uønskede organ bevægelser af den eksperimentelle mus og fortløbende, Colon væg perforering begivenheder. For det andet, den mest kritiske trin under scoring processen repræsenterer begrænsninger i denne sag på grund af den uønskede tilstedeværelse af fast eller flydende (f.eks diarré) afføring i tarmen lumen som eksperimentatoren flytter endoskopet ind i scoring position. I denne situation er rødmen kolorektal regionen med saltvand løsning ved hjælp af en fleksibel plastik pipette ofte nødvendig. Da denne procedure kan kompromittere den scoring nøjagtighed og specificitet af flere parametre (fx afføringen konsistens), skal denne advarsel omhyggeligt dog tages i betragtning efter scoring.

Der er flere begrænsninger begrænser fortolkning og konklusioner fra denne endoskopiske tilgang. Først, iboende til en metode ved hjælp af en ufleksibel endoskop via rektal rute, evalueringer er begrænset til de sidste 3-4 cm i mave-tarmkanalen (dvs., endetarmen og distale colon). Derfor er GvHD-associerede kærlighed af den proksimale kolon og endda tyndtarmen som standard udelukket fra den evaluering, der angiver, at videnskabelige spørgsmål med fokus på den lille tarm Fænotypen af GvHD ikke vil drage fordel af denne fremgangsmåde. For det andet, selv om inflammation er en af hallmark morfologiske funktioner af intestinal GvHD, yderligere egenskaber, som en øget apoptose sats af de intestinale epitel celler og et tab af tarm krypt arkitektur, findes ofte og inkluderet i histopatologiske arbejdsgangen underliggende intestinal GvHD scoring og sortering af patologer i allo-HCT patienter. Her, korreleret vi restrictedly de mini-endoskopisk vurderede intestinal GvHD noder med histopathologically vurderet tegn på betændelse. Under denne tilgang, kom vi til den konklusion, at Colon betændelse over en bestemt grænse i den colonoscopic scoring er pålideligt at forudsige tilstedeværelsen af moderat til høj grade inflammation, vurderet ved histopatologisk postmortem analyser. Fremtidige undersøgelser skal imidlertid undersøge hvordan, for eksempel, histopathologically vurderet apoptose priser vedrører mini-endoskopisk samlede sum noder eller, for eksempel, en af de fire individuelle parametre indlejret i den samlede score. For det tredje, mens mus lider histopathologically moderat-til-høj-grade GvHD nemt kan identificeres ved den endoskopiske scoring tilgang, mus med flere subtile tegn på tarmbetændelse kan blive savnet af den beskrevne tilgang, i betragtning af, at histopatologisk scoring afslørede tilstedeværelsen af mild tegn på betændelse i gruppen af ikke mus gennemgår allo-HCT alene, uden transplantation af alloreactive donor lymfocytter. Biologisk, kan denne konstatering være muligt, da ikke mus har været allotransplanted, og minimal colitis kan faktisk afspejler tilstedeværelsen af lave niveauer af GvHD på grund af en ufuldstændig fjernelse af T-celler fra knoglemarven celle brøkdel eller rekonstituering af alloreactive T celler fra knoglemarven over tid. Fremtidige undersøgelser skal behandle disse spørgsmål mere detaljeret. Fjerde, formelt, denne protokol fokuserer på fuldt etablerede intestinal GvHD-associeret colitis. Men som vist og offentliggjort tidligere, udbrud af colitis omkring dag 15 kan påvises endoskopisk og quantitated¹¹. Her, kunne GvHD-tilbøjelige mus være klart adskilt fra ikke mus hvor Colon Fænotypen kan skyldes udelukkende resterende tegn af bestråling-induceret vævsskader eller, snarere, spejl slimhinde opsving svar efter bestråling¹¹. Fremtidige undersøgelser skal dog korrelerer endoskopisk evalueringer og tage sigte på detaljerede histopatologiske analyser af GvHD-tilbøjelige mus i forhold til kontrol mus på tidligere tidspunkter.

Endelig, en interessant og nyttig tilføjelse anvendelse af endoskopisk scoring af intestinal GvHD er brugen af endoskopisk arbejder kanalen til at dirigere en minimeret biopsi pincet til den anatomiske struktur valg i tyktarmen. Denne funktion giver som en form for indbygget-indstilling, muligheden for at tage view-styrede væv biopsier, der kan analyseres yderligere af en række downstream teknikker som histopatologi, immunofluorescens farvning og real-time PCR analyser af gener i interesse. Fremtidige undersøgelser skal dog formelt vurdere, om for eksempel histopatologiske scoring og sortering af endoskopisk taget biopsier, svarer til histopatologisk resultater baseret på konventionelt taget prøver (dvs.fra euthanized mus).

Samlet set med denne protokol beskriver induktion og mini-endoskopisk evaluering af intestinal GvHD, leverer vi en metode til at vurdere, score og grade intestinal GvHD i en relevant murine GvHD modelsystem af allo-HCT. Endoskopisk vurderingen kan gentages i den samme mus på flere tidspunkter over tid, eliminerer behovet for at aflive mus sekventielt vurdere intestinal GvHD-associerede væv patologi (f.eks. i en terapeutisk indstilling). Mini-endoskopisk scoring resultaterne viste sig for at være sammenlignelige med resultater opnået ved histopatologisk vurdering af intestinal betændelse i tyktarmen og korreleret godt med systemisk GvHD aktivitet. Denne procedure kan derudover kombineres med Se-styrede biopsier via arbejde kanal af endoskopet. I sidste ende, men fremtidige undersøgelser har til at vurdere, hvor langt histopathologically bestemmes morfologiske funktioner end betændelse, der ofte findes i tarm GvHD-ramte læsioner, vedrører de opnåede resultater med dette mini-endoskopisk vurdering og score tilgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456