Induction of Intestinal Graft - versus - host Disease and son évaluation endoscopique Mini souris vivantes

Summary

Nous présentons ici un protocole qui décrit l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permet répétitives évaluations mini-endoscopique du côlon distal in situ pour la présence, les caractéristiques et gravité de l’inflammation du côlon dans live souris souffrant d’intestinal graft - versus - host disease.

Abstract

Aiguë graft - versus - host disease (GvHD) représente la complication la plus sévère que les patients subissant déjà visage (allo-HCT) la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques et est souvent associée à un mauvais pronostic clinique. Certain temps, par exemple, des manifestations de greffon contre l’hôte de la peau sont généralement sensibles aux traitements immunitaire-suppressive reconnus et, par conséquent, ne prennent un cours fatal, la présence et l’intensité de la GVH intestinale, en particulier des pièces milieu-à-bas du tube digestif, fortement influencer le résultat et globalement la survie des patients atteints aiguë GvHD. options thérapeutiques sont essentiellement limitées aux agents immunitaire-suppressive classiques produisant seulement des effets modérés-atténuer les maladies. Ainsi, une connaissance détaillée sur la cascade immunitaire tissu-résident, les changements dans le microbiote intestinal et la réaction stromale avant, après et après l’apparition de GVH intestinale sont nécessaires d’urgence pour comprendre les événements et les mécanismes qui sous-tendent sa pathogénie et d’élaborer des options thérapeutiques innovantes. Modèles murins de greffon contre l’hôte sont souvent employées pour identifier et évaluer fonctionnellement les molécules et les voies présumément conduite GVH intestinale. Cependant, moyens spécifiquement, surveiller et évaluer l’inflammation intestinale dans le temps ne manquent essentiellement puisque les scores établis pour évaluer et GVH aiguë de grade sont systématiquement composées de divers paramètres qui reflètent plutôt la GvHD systémique manifestations. L’évaluation détaillée de la GVH intestinale a été limitée aux études en utilisant des souris euthanasiés, excluant ainsi essentiellement longitudinal (c.-à-d., cinétique) analyses du compartiment colique sous une condition expérimentale donnée (p. ex., médiée par les anticorps blocage d’une cytokine pro-inflammatoire) à des souris vivantes (c.-à-d. in vivo). L’évaluation in situe mini-endoscopique du côlon distal des souris traitées allo-HCT décrite ici permet une) une évaluation macroscopique détaillée des différents aspects de l’inflammation intestinale et b) la possibilité de recueillir des échantillons de tissus pour des analyses en aval à divers moments au cours de la période d’observation. Globalement, l’approche endoscopique mini fournit une avancée majeure dans le suivi non invasif préclinique et évaluation de GVH intestinale.

Introduction

Malignités hématopoïétiques qui résultent directement du compartiment de cellules souches hématopoïétiques et incontrôlée, progresse rapidement et graves troubles immunitaire sont souvent des indications pour effectuer des allo-HCT^1,2. Cependant, bien que représentant l’apparition de la réponse de graft-versus-tumeur bénéfique pronostique, lymphocytes du donneur sont fréquemment induisant et promouvoir une attaque immunitaire indésirable des composants des tissus sains dans le destinataire allo-HCT , un processus qui est appelé graft - versus - host disease³. Manifestations dans le tube digestif, le soi-disant GVH intestinale, représentent la complication la plus redoutée du greffon contre l’hôte aiguë, des formes sévères qui sont systématiquement associées à une mortalité élevée^1,2,4.

Modèles dans l’ensemble, murins de allo-HCT sont devenus des outils précieux pour identifier et étudier les mécanismes à médiation immunitaire qui sous-tendent la pathogénie du greffon contre l’hôte⁵. Cependant, cinétique évaluation de, par exemple, les effets bénéfiques de nouvelles interventions thérapeutiques au fil du temps chez les souris vivent régulièrement repose sur la détermination du greffon contre l’hôte clinique scores⁶. Alors que ces scores sont adaptés afin de tenir compte, par exemple, la global de morbidité (c'est-à-dire la GvHD systémique), clinique scores manque la sensibilité en miroir avec fiabilité les manifestations spécifiques d’organes (par exemple, dans le tube digestif). Par conséquent, conclusions, par exemple en ce qui concerne les effets de protection intestinale d’une intervention thérapeutique donnée, qui reposent sur ces notation systèmes habituellement tombent à courtes.

Malgré des avancées importantes grâce à l’invention de nouveaux corps modalités en combinaison avec l’utilisation de deux souris génétique bioluminescent ou fluorescent modèles^7,8, directement et spécifiquement des méthodes d’imagerie évaluer l’intestin manifestation du greffon contre l’hôte chez les souris vivantes font défaut. Par conséquent, la raison d’être du protocole de l’évaluation endoscopique du phénotype GVH intestinale décrit dans la section suivante est de surmonter cet obstacle. En outre, la motivation est également de réduire le nombre de souris expérimental puisque, jusqu'à présent, une évaluation détaillée des caractéristiques morphologiques, cellulaires et moléculaires (p. ex., par histopathologie ou en biologie moléculaire) de GVH intestinale manifestation a finalement exigé le sacrifice de la souris de laboratoire.

Notre institution a précédemment rapporté sur la méthodologie d’une évaluation des mini-endoscopique des manifestations du côlon au cours de colite syngénique modèles⁹. Dans le protocole présenté ici, nous avons affiné et adapté le coloscopique marquant la matrice axée sur l’alloresponse ulcéro-hémorragique dans des souris vivantes avec GVH intestinale après transplantation d’alloréactives HCT et donateurs des lymphocytes dans une MHC classe j’ai totalement incompatibles réglage . Nous avons identifié quatre paramètres appropriés pour tenir compte des lésions coliques intestinales axés sur le greffon contre l’hôte. En outre, nous avons établi un système qui permet un classement affiné de n’importe quel déterminant unique, résultant en une nouvelle partition qui facilement informe le lecteur sur la sévérité de la GVH intestinale présente une souris donnée à un moment donné. Les analyses histopathologiques confirment qu’un score endoscopique dépassant un certain seuil est fiable prédire une inflammation des tissus grade modéré à élevé. Il appert donc qu’évaluation endoscopique mini pour représenter un substitut de travail pour l’histopathologie de l’étalon-or qui exige régulièrement le sacrifice des souris expérimentales. Ce qui est important, ce protocole peut être appliqué à pratiquement n’importe quel moment donné et peut être utilisé à plusieurs reprises au cours de la maladie^10,11. En outre, contrairement à l’utilisation d’approches axées sur la bioluminescence, aucune mesure de travail intense et longue comme intercrossing génétiquement des souris modifiées n’est nécessaires et, par conséquent, la méthodologie peut être appliquée sur pratiquement n’importe quelle lignée de souris de intérêt.

Pris ensemble, étant donné le point de vue clinique néfaste des allo-HCT diabétiques GVH intestinale sévère, progrès scientifique rapide et mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénie immunitaire sont urgent. De même, considérations éthiques importantes exigent que le gain de la connaissance devrait être réalisé avec l’utilisation du nombre minimal des souris de laboratoire. Ainsi, tous les deux reconnu réclamations sur la communauté de recherche explorant la GVH intestinale peuvent être avancées en mettant en œuvre des évaluations endoscopique mini séries du côlon dans la chaîne de travail expérimental pour surveiller et GVH intestinale chez des souris expérimentale direct de grade modèles, tel que décrit et validés dans le protocole présenté ici.

Protocol

Les méthodes expérimentales décrites ici ont été approuvés par le gouvernement de Mittelfranken, Bavière, Allemagne.

1. GvHD induction

1. Jour 0 : Irradiation corporelle totale des souris destinataires
   1. Utiliser des femelles CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c souris qui sont vieux comme bénéficiaires d’au moins 10 semaines.
   2. Pesez et consignez le poids des souris avant induction de greffon contre l’hôte destinataires.
      Remarque : S’assurer que le destinataire a un poids minimal de 20 g. Le poids de corps initial servira de la valeur de référence pour calculer la perte de poids de la souris individuelle au cours de l’induction du greffon contre l’hôte et la progression.
   3. Placez la souris jusqu'à cinq dans le conteneur de l’irradiateur de rayons x.
   4. Irradier les souris par irradiation corporelle totale avec une dose unique de 8 Gy de rayons x. Utiliser Cs¹³⁷ comme une source de rayonnement.
2. Jour 1 : Reconstitution des souris irradiées avec T-cell-appauvri la moelle osseuse
   REMARQUE :La transplantation de cellules de moelle allogénique, comme décrits et détaillés au chapitre 1.2, devrait avoir lieu dans les 24 h après l’irradiation. Effectuer les procédures décrites ci-dessous dans une culture de tissu stérile hotte et utilisent des réactifs filtrées. Utilisation allogénique CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl souris comme donneurs de T-cellule-appauvri la moelle osseuse.
   1. Euthanasier CD45.1/Ly5.1 B6. Souris SJL qui fera don allogénique de moelle osseuse de cellules conformément aux orientations institutionnelles, 12 à 24 h après l’irradiation des souris BALB/c bénéficiaires. Pour ce faire, anesthésier la B6 CD45.1/Ly5.1. Souris SJL par inhalation d’isoflurane 5 %. Continuer avec l’isoflurane exposition pendant 1 min après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale.
   2. Désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
   3. Position de la souris sur un endroit propre travail gaine afin que la souris est dans une position couchée, avec sa croupe face à l’expérimentateur. Soulevez la fourrure avec la pointe d’une pince de Semken avec une longueur de 13 cm avec embouts dentelée courbe le talon d’Achille. Inciser la peau entre la pince et le talon avec des ciseaux fins durci 8,5 cm avec pointes droites.
   4. S’allongent l’incision lutris (c.-à-d. du talon sur la jambe et la cuisse à la région de la hanche). Retirez la peau et la fourrure de la patte à l’aide de la pince.
   5. Effectuez la même procédure sur l’autre patte.
   6. Supprimer les membres postérieurs en sectionnant les articulations de la hanche adjacentes.
   7. Découper les pattes arrière. Couper à travers l’articulation du genou. Stocker la cuisse et la tige de chaque patte ensemble dans une boîte de pétri 92 mm rempli de tamponnée au phosphate (PBS) du sérum physiologique sur la glace.
   8. Nettoyer soigneusement les os du fémur et du tibia en supprimant autant le tissu musculaire que possible de chaque cuisse et la jambe. Transférer les os fémur et tibia dans un tube de 50 mL rempli de milieu RPMI 1640 stérile et de la place sur la glace humide jusqu'à ce que tous les os du tibia et du fémur recueillies à l’étape 1.2.7 sont nettoyés de tissu musculaire.
   9. Pour isoler la moelle osseuse, transférer un os du fémur ou du tibia à la fois (ce qui a été nettoyée comme décrit dans étape 1.2.8) du tube 50 mL pour une boîte de pétri (d’un diamètre de 92 mm) rempli de milieu RPMI 1640. Couper les extrémités du fémur ou du tibia avec un scalpel pour accéder à la cavité de l’OS contenant de la moelle osseuse.
   10. Préparer un tube de prélèvement de 50 mL à 5 mL du milieu RPMI 1640. Insérer une aiguille 26 G attachée à une seringue de 1 mL contenant 1 mL de milieu RPMI 1640 dans la cavité osseuse et rincez la moelle osseuse hors de la cavité dans le tube de prélèvement en poussant le piston.
   11. Répétez l’étape 1.2.10 jusqu'à ce que l’OS semble clair et brillant (c.-à-d., la cavité osseuse est visiblement dépourvue de rougeâtre de la moelle osseuse). Jeter l’OS vide.
   12. Répétez les étapes 1.2.9 - 1.2.11, à l’aide de tous les os du fémur et du tibia de l’étape 1.2.8, et collecter toutes les pièces récupérées la moelle osseuse dans le même tube de prélèvement de 50 mL de l’étape 1.2.10. Maintenir le tube de prélèvement sur la glace humide jusqu'à ce que tous les os de l’étape 1.2.8 ont été traitées en conséquence.
   13. Créer une suspension de cellules individuelles en doucement pipettant également les pièces de la moelle osseuse rouge, friable, monter et descendre. Filtrer la suspension de cellules individuelles de la moelle osseuse à travers une passoire de cellule d’écran maille de 40 µm placée sur un nouveau tube de prélèvement de 50 mL.
   14. Centrifuger le tube de prélèvement de 50 mL contenant la suspension monocellulaire de moelle osseuse à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
   15. Resuspendre le culot dans 5 mL de tampon de lyse ACK (EDTA 1 mM Na₂10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl ; pH 7,2) pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min à température ambiante. Par la suite, immédiatement ajouter 10 mL de solution de PBS à la suspension cellulaire.
   16. Centrifuger la suspension à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 2 mL de solution de PBS.
   17. Compter les cellules de la moelle osseuse, en utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 6 x 10⁶ cellules pour analyse en cytométrie en flux vérifier la pureté des cellules après purification cellulaire (voir étape 1.2.20).
   18. Pour l’épuisement de cellules de T de la suspension de cellules individuelles de la moelle osseuse, utiliser un kit de purification de cellules disponibles dans le commerce. Magnétiquement appauvrissent les cellules CD90.2⁺ (c.-à-d., lymphocytes) par les cellules de moelle totale, suivant le protocole du fabricant.
   19. Compter les cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse qui ont été isolés comme indiqué au point 1.2.18, utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 1 x 10⁶ cellules pour analyse en cytométrie en flux à exécuter plus tard, on tel que décrit à l’étape 1.2.20.
       Remarque : Le rendement des cellules en moyenne provenant de souris un donateur est généralement de 2 x 10⁷ à 3.4 x 10⁷ cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse.
   20. Confirmer un épuisement de lymphocytes réussi par cytométrie en flux. 1 x 10⁶ cellules, préservé de la marches 1.2.17 (cellules de la moelle osseuse avant la séparation de la cellule magnétique) et 1.2.19 (cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse après la séparation de la cellule magnétique), avec les anticorps suivants : α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 () GK1.5) et α-CD8α (53-6,7). Utilisez le reste des cellules de l’étape 1.2.17 comme un contrôle non coloré et des contrôles de coloration unique, de mettre en place le cytomètre en flux.
       1. 1 x 10⁶ cellules de transfert de chaque échantillon dans un puits d’une plaque de 96 puits avec fond V pour effectuer la cytométrie en flux flux procédure de coloration.
       2. Tournez en bas des cellules dans la plaque à 96 puits (étape 1.2.20.1) à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS (PBS additionné de 3 % filtré sérum bovin).
       3. Centrifuger les cellules à l’intérieur de la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
       4. Ajouter une quantité appropriée de l’anticorps de choix (à comparer avec l’étape 1.2.20) pour les échantillons pour une coloration unique dans 100 µL de tampon de FACS.
       5. Préparer un mélange de tous les anticorps (master mix) contenant les montants appropriés et suffisants pour colorer séparément les aliquotes de cellules de moelle osseuse préservés du prieur (voir étape 1.2.17) et après (voir étape 1.2.19) magnétique épuisement de lymphocytes T. Ajouter 100 µL du mélange maître pour les deux parties aliquotes.
       6. Ajouter 100 µL de tampon de FACS à l’échantillon non coloré.
       7. Incuber les cellules au sein de la plaque à 96 puits pendant 20 min à 4 ° C dans l’obscurité.
       8. Ajouter 100 µL de tampon de FACS et centrifuger des cellules dans la plaque à 96 puits à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 µL de tampon de FACS.
       9. Centrifuger les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules 250 µL de tampon de FACS.
       10. Transférer les échantillons dans un tube à fond rond 5 mL en polystyrène et analysez-les avec un instrument de cytomètre de flux qui est capable de détecter les molécules fluorescentes qui ont été utilisées pour étiqueter les anticorps utilisés pour caractériser les échantillons de cellules (voir étape 1.2.20).
       11. Comparer la composition cellulaire avant et après la séparation de la cellule magnétique.
           Remarque : Une pureté d’environ 95 % CD45.1⁺CD3^– (c.-à-d., T-cell-appauvri la moelle osseuse) cellules à l’intérieur de la porte direct est habituellement obtenue.
   21. Laver les suspensions de cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse 2 x avec la solution de PBS (450 x g pendant 5 min à 4 ° C) et, enfin, remettre en suspension les cellules dans une solution de PBS, ajuster la concentration en cellules à 5 x 10⁷ cellules/mL. Garder les cellules sur la glace humide jusqu'à ce que l’injection.
   22. Injecter des cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse dans les souris bénéficiaires, qui ont été irradiés à la veille (voir section 1.1).
       1. Placez la souris expérimentale dans une enceinte étanche et induire l’anesthésie par inhalation de jusqu'à 4 % isoflurane, jusqu'à ce que la souris est inconsciente. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
       2. Injecter 5 x 10⁶ cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse (c.-à-d. 100 µL de 5 x 10⁷ cellules/mL) contenant une solution de PBS à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille 30 G par voie intraveineuse dans l’espace rétrooculaire contenant le sinus veineux.
3. Jour 2 : Transfert des cellules T
   Remarque : Effectuer les procédures décrites ci-dessous sous une hotte de vitroplants stérile et utilisent des réactifs filtrées. Utilisez CD45.2 C57Bl/6 (sauvage ; Souris WT) comme donneurs de cellules alloréactives T. L’utilisation de systèmes de marqueurs congéniques permet la distinction entre le destinataire (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c souris) et types de donneurs de cellules hématopoïétiques (les cellules de la moelle osseuse : CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. Souris SJL ; les cellules T allogéniques : CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 souris).
   1. Euthanasier les souris C57Bl/6 conformément à l’application des lignes directrices et les autorités. Par conséquent, anesthésier les souris par inhalation à une concentration de 5 % isoflurane. Continuer l’exposition isoflurane jusqu'à 1 min après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale. Désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
   2. Placez une passoire avec un grillage de 40 µm sur un tube de prélèvement de 50 mL. Enlever la rate et le placer sur la crépine.
   3. Avec un piston de la seringue, fragmenter la rate dans la passoire. Laver le filtre et le piston de la seringue avec du PBS pour recueillir tous les splénocytes.
   4. Centrifuger les cellules dans le tube de prélèvement de 50 mL à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant.
   5. Remettre en suspension les splénocytes dans 3 mL de tampon de lyse ACK à lyser les globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 3 min. par la suite, ajouter 10 mL de PBS et centrifuger les cellules à 450 x g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les splénocytes dans du PBS.
   6. Compter les cellules de la rate, utilisant un hémocytomètre. Détourner une partie aliquote de 6 x 10⁶ cellules pour analyse en cytométrie en flux, afin d’évaluer l’ampleur de la purification à l’étape 1.3.9.
   7. Pour un total CD3⁺ lymphocytes indépendamment des splénocytes totales, utiliser un kit de purification de cellules disponibles dans le commerce. Isoler les cellules spléniques de T, suivant le protocole du fabricant.
   8. Compter le CD3 splénique⁺ T cellules isolées comme décrit dans l’étape 1.3.7, utilisant un hémocytomètre. Préserver une partie aliquote de 1 x 10⁶ T cells pour analyse en cytométrie en flux.
      Remarque : Le rendement sur la moyenne de T splénique des cellules par donneur souris isolée par des plages de séparation de cellules magnétiques de 1,3 x 10⁷ 2 x 10⁷ cellules.
   9. Confirmer le succès de l’isolement de cellules T par cytométrie en flux. Pour une description détaillée du protocole de coloration, conférer et suivez les étapes 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Tache 1 x 10⁶ splénocytes des étapes 1.3.6 (avant la séparation de la cellule magnétique) et 1.3.8 (après la séparation de la cellule magnétique) avec les anticorps suivants : α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) et le α-CD8α (53-6,7).
      2. Utiliser le reste des cellules de l’étape 1.3.6 comme un contrôle non colorée et pour une coloration unique avec les anticorps respectives, de mettre en place le cytomètre en flux.
      3. Comparer la composition cellulaire avant et après la séparation des cellules magnétiques.
         Remarque : Une pureté ≥ 95 % de CD45.2⁺CD3⁺ T des cellules à l’intérieur de la porte direct lymphocyte devraient être accomplis.
   10. Laver le T cells 2 x avec PBS (450 x g pendant 5 min à 4 ° C) et, enfin, remettre en suspension les cellules dans une solution de PBS, ajuster la concentration en cellules à 7 x 10⁶ cellules/mL. Conserver les cellules sur la glace jusqu'à l’injection.
   11. Injecter alloréactives, les cellules T spléniques (voir étape 1.3.10) à des souris BALB/c irradiés qui ont déjà reçu CD45.1⁺ des cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse (voir étape 1.2.22).
       1. Induire l’anesthésie en plaçant la souris expérimentale dans une enceinte étanche dans laquelle il est exposé à un maximum de 4 % isoflurane jusqu'à ce qu’il perd de sa conscience. Confirmer l’analgésie et la perte de conscience en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
       2. Injecter de 0,7 x 10⁶ alloréactives CD3⁺ T des cellules à l’aide d’une seringue de 1 mL équipée d’une aiguille 30 G   (c.-à-d., 100 µL de 7 x 10⁶ cellules/mL) contenant une solution de PBS (voir étape 1.3.10), par voie intraveineuse dans le rétrooculaire espace des souris, pour induire la GvHD. désigner ces souris comme le groupe expérimental.
       3. Injecter 100 µL de PBS seul, un autre groupe de souris par voie intraveineuse dans l’espace rétrooculaire et désigner ce groupe comme le groupe de contrôle, par la suite appelé « non-T-cell-transplantés (pas) des souris ».

2. évaluation du greffon contre l’hôte systémique

Remarque : Exécutez cette procédure dans un environnement semi stérile dans une pièce expérimentale sous licence et équipé pour la manutention des souris vivantes au sein de l’animalerie.

1. Suivez l’évolution clinique du greffon contre l’hôte chez les souris individuels ; plus précisément, évaluer et marquer les souris expérimentales 3 x par semaine pour la présence de symptômes cliniques de greffon contre l’hôte, basée sur un système de notation décrite ci-dessous et adapté d’un système de notation établi précédemment par Cook et al.,⁶.
   1. Peser chaque souris individuellement, enregistre le poids et on calcule la perte de poids de corps d’organisation en ce qui concerne le poids du corps qui a été déterminé avant le début de l’expérience (correspondant à 100 %) au jour 0 (étape 1.1.2). Marquer une perte de poids inférieur à 10 % du poids départ avec grade 0, une perte de poids de 10 % à 25 % avec grade 1 et une perte de poids de plus de 25 % avec grade 3.
   2. Marquer le niveau d’activité de chaque souris, souris discriminantes avec un niveau d’activité normal (score = 0) des souris avec un niveau d’activité modérément diminuée (score = 1) et la souris avec un comportement stationnaire sauf s’ils sont stimulés à l’extérieur (score = 2).
   3. Marquer la texture de fourrure, ainsi une discrimination une fourrure normale, brillante et kempt (score = 0) d’une fourrure modérément froissée (score = 1) et la présence de taches chauves (score = 2).
   4. Marquer la texture de la peau, une discrimination peau normale (score = 0) de taches sporadiques de mise à l’échelle de la peau (par exemple, à la queue et les pattes) (score = 1) et évidente mise à l’échelle et les zones de peau sensible (score = 2).
   5. Analyser la cohérence des fractions de selles sécrétées. Marquer des selles avec une normale (c'est-à-dire, consistance dure) avec grade 0, tabouret tabouret déformable et doux avec grade 1 et selles sans aucune cohérence et, par conséquent, avec une diarrhée sévère avec grade 2.
   6. Pour résumer tous les paramètres séparément a reçu un score clinique maximale de 12 par la souris.
2. Examiner et évaluer les critères de cesser l’expérience par le niveau de gravité de la maladie actuelle de la souris individuel, conformément aux orientations institutionnelles s’appliquant et autorisé le protocole animale.

3. Evaluation des GVH intestinale

1. La notation des lésions liées à greffon contre l’hôte par mini-endoscopie de la région distale du côlon
   REMARQUE :Exécutez cette fonction dans un environnement semi-stériles dans une pièce expérimentale sous licence et équipé pour la manutention des souris vivantes au sein de l’animalerie. Utiliser un poste de travail mini-endoscopique qui est approuvé pour l’utilisation de petits animaux.
   1. Préparer le dispositif endoscopique en couvrant le télescope avec (de 1,9 mm de diamètre) et d’une longueur de 10 cm avec la gaine de l’examen endoscopique. Nettoyer et stériliser l’endoscope avec l’eau et l’éthanol.
   2. Allumez l’ordinateur, la source de lumière au xénon ajustable et le module de caméra et définir le focus de façon que les objets à proximité de la lentille donnent une image claire.
   3. Branchez la pompe à air à la gaine endoscopique. Afin de visualiser le flux d’air, trempez l’extrémité de l’endoscope dans un bécher de verre rempli d’eau. Réguler le flux d’air en ajustant la valve entre la pompe à air et la gaine endoscopique. Ajustez-le sur un flux d’air lente et constante, reflété par un petit nombre constamment croissant bulles.
   4. Placez une souris dans une chambre étanche. Induire l’anesthésie par inhalation de jusqu'à 4 % isoflurane jusqu'à ce que la souris est inconsciente. Confirmer l’analgésie et un état absent des réflexes en testant la perte du réflexe de redressement et la perte subséquente de la pédale retirer réflexe.
   5. Utiliser une machine anesthésie vétérinaire approprié, conformément au protocole d’animaux utilisé. Transférer la souris de la chambre à l’espace de travail de la coloscopie. Ici, position de la souris anesthésiée, avec son nez à la pointe (qui est reliée à l’appareil d’anesthésie), sur un endroit propre travail gaine afin que la souris se trouve dans une position couchée, face à l’expérimentateur avec sa croupe.
   6. Pour maintenir l’anesthésie au cours de la coloscopie, réduire la concentration d’isoflurane à environ 2 %. Surveiller la respiration de la souris et de réponse à la stimulation pendant la coloscopie et ajuster la concentration d’isoflurane au vaporisateur si nécessaire. Couvrir les yeux de la souris avec les onguents pour les empêcher de pénétrer sec.
   7. Contrôler l’efficacité de l’anesthésie en pinçant entre les orteils de la souris. Dans le cas d’absence de réactivité, passez à l’étape 3.1.8.
   8. Soulevez la queue juste au-dessus de la racine de la queue d’une main et introduire l’endoscope, placé dans l’autre main, par l’intermédiaire de l’anus dans le rectum.
   9. Alors que le flux d’air gonfle le lumen colorectal, lentement et soigneusement passer l’endoscope avec impatience en direction aborale.
   10. Placez l’endoscope dans le milieu de la lumière colique et maintenir cette position afin de minimiser le contact avec la paroi du côlon et d’éviter de faire des rayures plus profondes blessures liées au mur (p. ex., entraînant un saignement), ou même mur de perforation (voir étape 3.1.17) . Contrôler cette étape en regardant en permanence le flux vidéo (c.-à-d. en vertu de visualisation constante du compartiment du côlon).
   11. Si les selles contractent la vue, retirer l’endoscope et effectuer un lavement par le rinçage par voie rectale avec jusqu'à 2 mL de solution saline, à l’aide d’une pipette Pasteur douce. Utiliser comme peu de liquide que possible, pour éviter une dilution involontaire des matières fécales et d’autres effets secondaires une incidence négative sur les caractéristiques de la surface de la muqueuse et, finalement, les résultats de notation.
   12. Essayez de placer régulièrement l’endoscope dans un sens (p. ex., distinctes) site anatomique dans le côlon distal de standardiser la notation de l’inflammation du côlon et d’optimiser la comparabilité de la notation des résultats entre les souris et à travers des expériences.
       Remarque : Normalement, avec l’endoscope rigide, une profondeur maximale de 4 cm peut être atteint par voie rectale. Entre 2 et 4 cm d’aborally, le côlon régulièrement se transforme en une flexion qui ne peut pas être passée avec le coloscope rigide. La région du côlon distalement adjacente à la flexion comme le score par défaut place d’aménagement.
   13. Commencer à enregistrer le flux vidéo et commencer avec la notation de l’inflammation.
   14. Évaluer l’inflammation liées à greffon contre l’hôte du côlon en marquant les paramètres expliqués et décrits dans le tableau 1 et la Figure 3.
       1. Déplacer l’endoscope à la notation place doucement et légèrement arrière - et vers l’avant pour évaluer les différents paramètres.
       2. Évaluer le paramètre « translucidité », ainsi que la consistance des selles « », en positionnant l’endoscope dans une plus grande distance par rapport à la paroi du côlon.
       3. Évaluer les paramètres « granularité » et « vascularisation » en positionnant l’endoscope à proximité de la paroi colique. Pour cette tâche, soigneusement tendez bien dosé la paroi colique avec l’extrémité de l’endoscope.
   15. Une fois terminé le processus de notation, arrêter l’enregistrement.
       Remarque : Par la suite, le clip vidéo enregistré peut être utilisé au total ou utilisé pour générer des images représentant des critères évalués par mini-endoscopie dans l’ensemble contribuant à l’inflammation du côlon (c'est-à-dire, les captures d’écran).
   16. Retirer délicatement l’endoscope.
   17. Cessez d’isoflurane exposition en transférant la souris dans une cage séparée dans laquelle il est exposé à l’air ambiant. Chauffer la souris avec une lampe de lumière rouge et observez la souris jusqu'à ce qu’il récupère de l’anesthésique et reprend conscience complète.
       Remarque : En raison de l’inflation d’air du côlon au cours de l’endoscopie, la région abdominale de la souris peut sembler soufflée vers le haut directement par la suite. Tandis que ceci est normal et de nature transitoire, prolongée de signes d’inflation massive et même progressive de l’abdomen et l’échec de la récupération de la souris peuvent indiquer une perforation involontaire du côlon (dans ce cas, la souris doit être euthanasié immédiatement).
   18. Lors de la restauration complète, placez votre souris dans sa cage respective.
   19. Démarche facultative : il est également possible de prendre des biopsies tissulaires guidée par vue. Procédez comme suit.
       Remarque : La coloscopie sera effectuée de la même manière comme indiqué aux paragraphes 3.1.1 - 3.1.18, avec les modifications suivantes.
       1. À l’étape 3.1.1, utiliser une gaine d’examen endoscopique avec un canal de travail intégré, au lieu d’une gaine simple examen sans chaînes de travail, destiné à couvrir le télescope. Introduire une pince à biopsie dans le canal de travail jusqu'à ce que sa pointe est visible en face de l’endoscope à l’écran vidéo, parce que cela empêche en grande partie des blessures non intentionnelles à l’intestin.
       2. Procédez comme 3.1.2 - 3.1.11. Introduire l’endoscope dans le côlon et Poussez délicatement vers l’avant à l’endroit d’intérêt.
       3. Employer l’aide d’un second expérimentateur pour la tâche de prendre des biopsies tissulaires du côlon. Poser le second expérimentateur pour naviguer dans l’extrémité de la pince à biopsie à la région du côlon de choix en appuyant sur la pince dans le canal opérateur lentement vers l’avant jusqu'à ce que les mâchoires de la pince peuvent être ouvert. Regarder sans cesse le flux vidéo au cours de cette procédure pour minimiser le risque de blesser la paroi colique.
       4. Récupérer un échantillon de tissu de la paroi colique en ouvrant et en fermant les mâchoires de la pince à biopsie avec soin.
          Remarque : Faites-le avec prudence afin d’éviter la perforation de la paroi colique. Dans les rares cas d’une perforation du côlon, immédiatement sacrifier la souris touchée par l’application des mesures, conformément aux orientations institutionnelles et sous l’administration continue d’anesthésiques.
       5. Tirer vers l’arrière et enlever la pince fermée sur la chaîne de travail. Retirer l’échantillon des mâchoires de la pince à biopsie par trempage et secouant délicatement la pince ouverte en solution de PBS stérile. Par la suite, choisir des conditions de stockage appropriées pour l’échantillon de tissu, selon les analyses prévues en aval. Après la désinfection avec l’éthanol à 70 %, la pince peut être réutilisée pour prendre de nouvelles biopsies.
       6. Après la prise de biopsies, retirer l’endoscope et terminer la colonoscopie comme décrit aux étapes 3.1.16 - 3.1.18.
2. Analyse histopathologique
   1. Entre 26 et 30 après l’irradiation aux rayons x jours, euthanasier les souris de allo-HCT bénéficiaires conformément à l’application des autorités et des lignes directrices. Pour ce faire, anesthésier les souris par inhalation d’isoflurane 5 %. Continuer avec l’exposition isoflurane pendant 1 minute après l’arrêt de la respiration et confirmer l’euthanasie par dislocation cervicale. Bien désinfecter la fourrure et la peau de la souris avec l’éthanol à 70 %.
   2. Ouvrir la cavité abdominale et retirer le côlon. Transférer dans un plat de pétri (d’un diamètre de 92 mm) avec du PBS.
   3. Remplir un bec doseur de 5 mL de PBS. Avec l’aide d’une pince de Semken avec une longueur de 13 cm avec embouts dentelée courbe, glisser la partie distale du côlon (environ 5 mm) sur l’extrémité de la pointe du distributeur. Avec précaution, fixer le côlon avec la pince à l’extrémité du distributeur et vider le colon avec du PBS en appuyant sur le piston de la pointe du distributeur pour enlever les matières fécales dans l’intestin.
   4. Découper un segment du côlon situé à environ 5 mm de l’anus, à l’aide d’un scalpel.
   5. Difficulté le spécimen d’intestin réséquée en formaldéhyde de 4,5 % du jour au lendemain. Avant d’embarquer dans la paraffine, placez le tissu en position verticale.
   6. Couper 3 µm coupes de tissus inclus en paraffine côlon et tacher les à l’hématoxyline et éosine (HE), à l’aide de protocoles standards de coloration.
   7. Préparer les coupes colorées HE des échantillons de tissus de colon.
   8. Adapté de la matrice de notation rapportée par Kaplan et al.¹², score histopathologique l’activité inflammatoire selon une méthode semi-quantitative, avec des scores de 0-3 : aucune inflammation (score = 0), légère inflammation (score = 1), modèrent l’inflammation (score = 2), et une inflammation sévère (score = 3).
      Remarque : Idéalement, utiliser pour cette tâche l’expertise d’un pathologiste expérimenté dans l’évaluation de GVH intestinale murine et aveugle de la nature de l’expérimental et les groupes témoins.

Representative Results

Le protocole actuel, qui décrit l’évaluation mini-endoscopique des lésions intestinales de greffon contre l’hôte associée à du côlon distal, a été établi et validé chez la souris préalablement soumis à l’induction systémique d’un modèle de greffon contre l’hôte aiguë sévère. Dans cette étude, nous avons utilisé un CMH de classe j’ai totalement incompatibles système modèle dans lesquelles BALB/c souris ont été mortellement irradiés, suivie par la transplantation de moelle allogénique T-cell-appauvri et par l’administration de la GvHD induisant alloréactives CD3 C57BL/6⁺ Lymphocytes T. Les cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse et les cellules spléniques de T pour l’induction du greffon contre l’hôte ont été purifiées par séparation magnétique. La pureté de ces populations de cellules a été déterminée par cytométrie en flux, et les résultats représentatifs du processus de purification sont affichés dans la Figure 1, montrant un épuisement suffisant de lymphocytes T de cellules de moelle totale et un enrichissement cohérent de rate-dérivé CD3⁺ T cells avant leur transfert au précédemment souris irradiées. L’évolution clinique affichée à la Figure 2 illustre l’induction de façon reproductible robuste du phénotype clinique systémique GvHD sur allo-HCT en présence (WT, en noir) vs absence (pas gris) alloréactives T de lymphocytes du donneur. Le système de notation précédemment rapporté par Cooke et al. représente un noyau de somme dans laquelle six paramètres sont évalués et classés : texture de peau et fourrure, activité, posture, poids du corps, et⁶de la consistance des selles. Le contrôle souris expérimentés seul, début survenant pic du score clinique, entre 5 et 10, jour qui a été observée de la même façon chez les souris de T-cellule-réception et est donc en grande partie en raison de la réponse inflammatoire systémique associée à l’irradiation. Malgré tout, les scores cliniques de souris T-cell-réception donneur a commencé à se lever plus tôt, a montré un pic total plus élevé, seulement une diminution transitoirement après avoir culminé au début et ensuite, essentiellement augmenté encore une fois, sans interruption, sur la durée restante de la Faites des essais. Dans l’ensemble, ces résultats sont en accord avec l’interprétation qui T-cell-réception souris montrent plus forts et les signes plus progressistes du greffon contre l’hôte systémique par rapport à pas de souris.

Les souris de allo-HCT donneur T-lymphocytes-réception montraient différents aiguës manifestations GvHD liées à l’orgue et systémiques, entraînant dans l’ensemble des scores de haute somme, tandis que les souris témoins n’avaient pas les affections modérées à sévères, en particulier à des points plus tard. Toutefois, signe de GVH intestinale est sous-représentées dans la GvHD systémique notation système, où le seul paramètre évalué axés sur le tube digestif est de consistance des selles. Comme indiqué dans le tableau 1, mini-endoscopie évaluables critères ont été définis, conçus spécialement pour la description précise, marquant et le classement des lésions intestinales associées au greffon contre l’hôte, en adaptant les critères précédemment rapportées pour l’évaluation de colite syngénique au contexte de colite axée sur l’alloresponse⁹. La figure 3 affiche des exemples typiques pour chaque critère individuel, illustrant le type et l’étendue des lésions intestinales de greffon contre l’hôte associée, ainsi visualiser la matrice classement appliquée lors de l’évaluation mini-endoscopique du côlon distal de La souris sujettes à greffon contre l’hôte après greffe de CMH de classe j’ai entièrement incompatibles lymphocytes du donneur.

Figure 4 A montre que les résultats de score de somme GVH intestinales qui reposent sur des critères définis dans le tableau 1 et affiché à la Figure 2 facilement permettent l’expérimentateur de discriminer les souris récepteur lymphocytaire donneurs avec des signes graves de l’intestin inflammation des souris de contrôle qui sont essentiellement dépourvue de greffon contre l’hôte. Pour valider le système de classement par mini-endoscopie basé, études histopathologiques ont été effectuées en utilisant un microscopique système classement¹²rapportées antérieurement. Les données à la Figure 4B confirment que le côlon des souris durement touchées par l’inflammation liées à greffon contre l’hôte, comme en témoignent les scores de la haute somme coloscopique, affichage de même fort signes histopathologiques de l’inflammation, donné un histopathologiques résumé de score de ≥2 post-mortem. En revanche, les tissus du côlon des souris témoins affichent no (score 0) ou, tout au plus, légère (note 1) signes histopathologiques d’inflammation, conformément à la quasi-absence de mini-endoscopie détectables signes de colite. En outre, tel qu’illustré en Figure 4C, D, études de corrélation entre mini-endoscopie et examen histopathologique évalué activité de colite et systémique GvHD scores ont été réalisés. Ce qui est important, ces études ont montré que des dizaines de la somme déterminée par mini-endoscopie de ≤3 prédisent de façon fiable l’absence de milieu-à-grade supérieur (p. ex., ≥2) intestinale greffon contre l’hôte associée à une inflammation du côlon notes obtenues de classification histopathologique. Enfin, la sévérité de la GVH intestinale mises en recouvrement par voie endoscopique montre une corrélation avec l’activité systémique du greffon contre l’hôte.

Figure 1 : Flux d’évaluation de la qualité par cytométrie en flux de magnétiquement purifiée T-cell-appauvri la moelle osseuse des cellules et CD3 splénique allogéniques⁺ T cellules. (A) l’appauvrissement des cellules de la moelle osseuse CD90.2⁺ obtenu par séparation magnétique, à l’aide d’un kit de purification disponible dans le commerce. La pureté des cellules de T-cellule-appauvri la moelle osseuse a été déterminée par cytométrie en flux, par coloration des cellules avant et après déplétion des cellules T avec anti-CD45.1 et anti-CD3. Résultats d’une expérience représentative sont indiqués. Cellules (B) T splénique furent purifiés par magnétisme, employant un kit de purification disponible dans le commerce. La pureté a été déterminée par cytométrie en flux, en comparant les fréquences des CD45.2 et CD3 costaining d’échantillons provenant d’avant et après l’isolement des cellules T. Résultats d’une expérience représentative sont indiqués. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’évolution clinique du greffon contre l’hôte, qui emploient un CMH de classe j’ai totalement incompatibles modèle. Pour induire la GVH aiguë, chez des souris BALB/c ont été confiné irradié au jour 0. Les souris ont reçu de T-cellule-appauvri la moelle osseuse, cellules 24 h plus tard (d1). Jour 2, les souris ont été injectés avec CD3 splénique allogéniques⁺ T cells (sauvage [WT] ; n = 9). Comme contrôle, certaines souris ont reçu T-cell-appauvri la moelle osseuse seule (pas ; n = 9). Les souris ont été évalués plus précisément trois fois par semaine pour la présence et la gravité des symptômes cliniques du greffon contre l’hôte. Les données affichées représentent des valeurs moyennes ± SEM des scores cliniques obtenues de souris individuels du groupe traitement indiqué de deux expériences représentatives. Les données ont été analysées par ANOVA bidirectionnelle, suivie de post-test de comparaisons multiples de Bonferroni. p < 0,0001 a été considéré comme significatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Représentant des images illustrant des exemples classement qui sous-tendent la matrice de notation des altérations intestinales liées à greffon contre l’hôte du côlon évaluée par une évaluation endoscopique mini des colons des souris vivantes, allo-HCT-traités. Pour compléter et illustrer la description détaillée du système dans le tableau 1et classement notation utilisés, images mini-endoscopique représentatives des niveaux de gravité évaluée (classement) pour tous les paramètres individuellement dans le côlon d’anesthésiés, des souris vivantes subissant allo-HCT entre 26 et 30 avant comme décrit à la Figure 1 jour sont affichés ici. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Mini-endoscopique notation et le classement de l’inflammation intestinale du côlon, axés sur le greffon contre l’hôte prévision fiable de la présence de qualité supérieure colite évaluée en marquant histopathologiques. (A) entre les jours 26 et 29 après l’induction du greffon contre l’hôte tel que décrit à la Figure 1, la manifestation de GVH intestinale a été évaluée par endoscopie mini souris vivants, anesthésiés. Altérations du côlon ont été marquées et classées selon le système de notation et classement représenté dans le tableau 1 et Figure 2. Des images endoscopiques représentatives du contrôle (aucune cellule de T ; non) et sauvage (WT), T-récepteur de cellules de souris et le score mini-endoscopie mises en recouvrement (en haut) sont indiquées. (B) les souris ont été euthanasiées 12 h après l’évaluation endoscopique mini, et la partie distale du côlon ont été traitée et évaluée examen histopathologique. L’activité inflammatoire des coupes transversales-coloration hématoxyline et éosine le côlon distal a été classée. Sections du côlon distal de pas chez les souris traitées allo-HCT lymphocytes et WT T cellule-récepteurs et l’histologie correspondante figurent les scores droites représentant l’hématoxyline et éosine-colorés. Les données dans les groupes A et B ont été analysées par de Student t-test et sont affichés sous forme de moyenne ± SEM. ***p < 0,0001 était considérée comme significative. WT : n = 15 ; Pas : n = 15. Les données représentent les données regroupées de quatre expériences individuelles. (C) interdépendance de notation de la coloscopie et score histologique. Les données sont montrées comme boîte de parcelles. Chaque tache affiche la médiane (ligne noire au sein de chaque zone), la gamme des données (min max) et les quartiles (zones de chaque boîte). WT : n = 15 ; Pas : n = 15. Les données représentent les données regroupées de quatre expériences individuelles. (D) corrélation entre coloscopie notation et notation clinique. Les témoins et les souris de T-cellule-réception de type sauvage sont inclus dans l’analyse de corrélation. La ligne continue représente la courbe de régression linéaire. Coefficient de corrélation de Spearman (r-value) et p-valeur sont affichés. WT : n = 12 ; Pas : n = 13. Les données représentent les données regroupées de trois expériences individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Score	0	1	2	3
Translucidité de la paroi colique	Organes extra-intestinaux, intérieurs (p. ex. rate) bien visibles	Réduction discrète de la visibilité des organes extra-intestinaux en raison de l’opacité bénigne de la paroi colique	Réduction modérée de la visibilité des organes extra-intestinaux en raison de l’opacité significative de la paroi colique	Manque de visibilité des organes extra-intestinaux, c'est-à-dire non transparent paroi colique
Granularité	Aspect surface muqueuse lisse, pas affectée ; modèle de colique crypte visible	Apparence discrète de grattage et pavées de la surface de la muqueuse	Apparence de grattage et pavées modérée de la surface de la muqueuse	Cratérisation sévère et l’aspect de la surface de la muqueuse ; coussin-comme l’aspect de la muqueuse
Vascularisation	Inaltéré modèle vasculaire affichant le réseau communicant de grands et petits navires	Discrètes modifications du modèle vasculaire ; modèle de navire semble s’effilocher	Certains navires sont invisible ; réseau bateau discontinu	Communiquez avec saignements induits ; dot-comme le modèle des navires
Consistance des selles	Normal ; selles sont dures ; fils fins de mucus entre les matières fécales et la paroi du côlon peuvent être observés	Selles est toujours en forme, mais peut contenir des bords déchiquetés ; déformable avec l’extrémité de l’endoscope	Selles sont molles et non façonnés selles est visiblement plus lumineux (teneur en eau plus élevée)	Selles est lâche, liquide ; diarrhée aqueuse. Selles peut être étalée au hasard sur la surface de la muqueuse du côlon

Tableau 1 : Mini-endoscopique notation et le classement de matrice des lésions intestinales d’axés sur le greffon contre l’hôte dans le côlon de souris vivantes traitées allo-HCT. Modifications de la morphologie du côlon endoluminale et transmurale chez des souris de allo-HCT prétraité ont été évaluées par une coloscopie du rectum et du côlon distal des souris anesthésiés, direct, en utilisant un système d’endoscopie mini murine. Lésions du côlon ont été classées à l’aide du système de notation endoscopique (mis à jour le murin endoscopique indice de gravité de la colite [MEICS]) qui est déduite de l’original MEICS notation système rapporté par Becker et coll.⁹ et adaptée au contexte de Allo-HCT. Le côlon distal est évalué visuellement la présence et l’ampleur des quatre paramètres suivants : 1. la transmittance de lumière endoscopique (translucidité) à travers la paroi intestinale du côlon comme un épaississement de la paroi ; 2. la surface des muqueuses affichant une aspect (granularité) la surface des muqueuses endoluminal orienté ; 3. un modèle de vascularisation altérée (vascularisation) ; 4. par voie endoscopique évalué apparition de selles in situe (consistance des selles). Chaque paramètre est un indice de 0 (aucun signe) à 3 (phénotype plus sévère), ajoutant jusqu'à une vingtaine de montant maximum de 12 par la souris.

Discussion

Le protocole décrit la méthode d’induction et évaluation mini-endoscopique du côlon phénotype observé au cours de la GVH intestinale. Il a pour objectif plus large de permettre aux scientifiques d’étudier la GVH intestinale longitudinalement et non invasive au cours de toute maladie (c'est-à-dire, dès le début de la manifestation du côlon et de la progression jusqu'à l’activité maximale de la maladie).

Cependant, il y a certaines étapes critiques et des limitations importantes inhérentes aux méthodes présentées que l’expérimentateur doit connaître avant d’appliquer les technologies dans le contexte scientifique respectif. Tout d’abord, bien que nous avons utilisé avec succès l’évaluation mini-endoscopique des lésions colique intestinale axés sur le greffon contre l’hôte dans un système de mineur d’histocompatibilité-incompatibles modèle¹¹, le protocole fourni ici est actuellement exclusivement applicable au MHC J’ai la classe complètement dépareillées modèles de greffon contre l’hôte aiguës. Le CMH de classe j’ai totalement incompatibles GvHD modèle est commun et fréquemment utilisé⁵, il est bien établi que les caractéristiques de la manifestation du greffon contre l’hôte sont fortement tributaires des souris utilisé sous-souches puisque cela fortement produit des effets, par exemple, la sensibilité à l’irradiation. En outre, la source de souris expérimentales avec, par exemple, une composition variable du microbiote intestinal et les numéros utilisés des cellules de T allogéniques transférés peut affecter gravement la cinétique et la dynamique du greffon contre l’hôte manifestation intestinal¹². Par conséquent, une étape cruciale doit soigneusement tester et valider les mesures indiquées pour leur capacité à induire avec succès GVH intestinale comme indiqué.

Concernant la mise en œuvre réussie de l’évaluation endoscopique mini direct de GVH intestinale aiguë, nous tenons à souligner que, tout en manipulant l’endoscope est simple, qu'elle peut exiger une formation, afin de minimiser le risque d’éprouver le plus redouté complication (c.-à-d., pour perforer la paroi intestinale avec l’instrument rigide en combinaison avec le besoin d’air-gonfler le colon). En raison d’une vulnérabilité accrue induite par l’inflammation et une diminution de souplesse des tissus du côlon, l’intégrité de paroi du tube digestif peut être plus à risque durant la phase de récupération postradiation (i.e.,until jour 10) et sur la pleine manifestation d’intestinale Colite ulcéreuse axés sur le greffon contre l’hôte (c'est-à-dire après environ 25 jours). Ce qui est important, cependant, nous n'avons pas observé taux de complications significativement accrue dépend du moment de l’endoscopie, aussi longtemps que l’endoscope est avancé doucement sous une visibilité suffisante. En revanche, nous avons identifié médicaments sous-optimaux dosage pour être un facteur de risque car une profondeur insuffisante de l’anesthésie peut entraîner l’apparition de mouvements non désirés de la souris expérimentale et, consécutivement, événements de perforation de la paroi colique. Deuxièmement, l’étape la plus critique au cours du processus de notation représente restrictions dans cette affaire en raison de la présence indésirable de solide ou selles liquides (p. ex., diarrhée) à la lumière du tube digestif que l’expérimentateur met l’endoscope en position de marquer. Dans ce cas, rincer la région colorectal avec du sérum physiologique à l’aide d’une pipette en plastique souple est souvent nécessaire. Toutefois, étant donné que cette procédure pourrait compromettre l’exactitude et la spécificité de plusieurs paramètres (p. ex., consistance des selles) notation, cette mise en garde doit soigneusement être pris en considération lors de scoring.

Il y a plusieurs limites restreignant l’interprétation et les conclusions tirées de cette approche endoscopique. Tout d’abord, intrinsèque à une méthodologie à l’aide d’un endoscope rigide par voie rectale, évaluations sont limitées à la dernière 3 à 4 cm de l’appareil digestif (c.-à-d., le rectum et le côlon distal). Par conséquent, le greffon contre l’hôte associée à des affections du côlon proximal et même l’intestin grêle sont par défaut exclus de l’évaluation, indiquant que les questions scientifiques en se concentrant sur le phénotype petit intestinal du greffon contre l’hôte ne bénéficiera pas de cette approche. Deuxièmement, bien que l’inflammation est l’une des caractéristiques morphologiques caractéristique de GVH intestinale, des caractéristiques supplémentaires, comme un taux d’augmentation de l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et une perte de l’architecture des cryptes intestinales, sont souvent trouvés et inclus dans le flux de travail histopathologique sous-jacent GVH intestinale notation et classement des pathologistes chez allo-HCT. Ici, nous limitée une corrélation entre les scores de GVH intestinales mini-endoscopie mises en recouvrement avec examen histopathologique des signes d’inflammation. Adoptant cette approche, nous sommes arrivés à la conclusion qu’inflammation colique dépassant un certain seuil dans la notation coloscopique est prévision fiable de la présence d’inflammation de grade modéré à élevé, tels qu’évalués par les analyses post-mortem histopathologiques. Cependant, les études futures doivent étudier comment, par exemple, taux d’apoptose examen histopathologique évalués se rapportent à la mini-endoscopique total des scores de somme ou, par exemple, l’un des quatre paramètres individuels intégrés dans le score de la somme. En troisième lieu, tandis que les souris souffrant d’examen histopathologique modéré-à-haute teneur greffon contre l’hôte peuvent être facilement identifiés par l’approche endoscopique de la notation, souris avec plusieurs signes subtils de l’inflammation intestinale peuvent être manquées par l’approche décrite, compte tenu du fait que score histopathologique révèle la présence de légers signes d’inflammation dans le groupe des pas de souris subissant allo-HCT seul, sans la transplantation alloréactives de lymphocytes du donneur. Biologiquement, cette découverte pourrait être réalisable, puisque pas de souris ont été allotransplanted et colite minime peut, en effet, reflètent la présence de faibles concentrations de greffon contre l’hôte en raison d’une évacuation incomplète des cellules T de la fraction de cellules de moelle osseuse ou la reconstitution de cellules alloréactives T de la moelle osseuse au fil du temps. Les études à venir doivent répondre à ces questions plus en détail. Quatrièmement, formellement, ce protocole met l’accent sur la colite associée aux GVH intestinale entièrement établie. Cependant, comme illustré et publié précédemment, l’apparition d’une colite autour de 15 jours peut être détectée par voie endoscopique et quantifié¹¹. Ici, les souris sujettes à greffon contre l’hôte pourraient être clairement distingués de pas des souris dont le phénotype du côlon pourrait être uniquement à cause de signes résiduels des lésions tissulaires induites par l’irradiation ou, plutôt, miroir de la réponse de la muqueuse de recouvrement après irradiation¹¹. Cependant, les études futures doivent corréler évaluations endoscopiques et visent à des analyses détaillées et histopathologiques de souris sujettes à greffon contre l’hôte par rapport aux souris témoins aux périodes antérieures.

Enfin, une application complémentaire intéressant, utile de la notation endoscopique de GVH intestinale est l’utilisation de la chaîne de travail endoscopique pour diriger une pince à biopsie réduite à la structure anatomique de choix dans le côlon. Cette fonctionnalité fournit, comme une sorte de built-in-option, la possibilité de prendre des biopsies de tissus vue guidées qui peuvent être analysées plus loin par une série de techniques en aval comme histopathologie, immunofluorescence souillant et analyses PCR en temps réel des gènes de intérêt. Cependant, les études futures doivent évaluer formellement si, par exemple, histopathologiques de notation et de classement des biopsies prises par voie endoscopique sont équivalentes aux résultats histopathologiques fondées sur des échantillons pris conventionnellement (c'est-à-dired’euthanasié souris).

Dans l’ensemble, ce protocole décrivant l’induction et son évaluation endoscopique mini de GVH intestinale, nous fournissons une méthodologie pour évaluer, marquer et GVH intestinale dans un système pertinent du modèle GvHD murin d’allo-HCT de grade. L’évaluation endoscopique peut être répétée dans la même souris à plusieurs moments au fil du temps, éliminant le besoin d’euthanasier la souris afin d’évaluer successivement les pathologie de tissu intestinal associée à greffon contre l’hôte (par exemple, dans un cadre thérapeutique). Les résultats de notation mini-endoscopique s’est avérée comparable aux résultats obtenus par l’évaluation histopathologique de l’inflammation intestinale dans le côlon et corrélation avec l’activité systémique greffon contre l’hôte. En outre, cette procédure peut être associée à des biopsies guidées vue via le canal opérateur de l’endoscope. En fin de compte, cependant, les études à venir ont évaluer dans quelle mesure les caractéristiques morphologiques examen histopathologique déterminés autre que l’inflammation, que l'on retrouvent fréquemment dans les lésions intestinales touchées par greffon contre l’hôte, se rapportent aux résultats obtenus avec ce mini-endoscopique évaluation et notation approche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456