Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto - versus - host disease.

Abstract

Agudo injerto - versus - host disease (GvHD) representa la complicación más severa que los pacientes previamente sometidos a cara de (allo-HCT) del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y se asocia frecuentemente con un resultado clínico pobre. Mientras que, por ejemplo, GvHD manifestaciones de la piel generalmente responden a terapias inmune supresora establecidas y, por lo tanto, no tienen un curso fatal, la presencia y la intensidad de la GvHD intestinal, especialmente de las partes de la mitad inferior del intestino, influir fuertemente en el resultado y en general la supervivencia de pacientes con agudo GvHD. opciones terapéuticas son esencialmente se limita a los clásicos agentes inmune supresora rendimiento sólo moderados efectos atenuantes de la enfermedad. Por lo tanto, un conocimiento detallado sobre la cascada inmune reside en el tejido, cambios en la microbiota intestinal y la respuesta estromal anterior, sobre y después de la aparición de EICH intestinal se necesitan urgentemente para entender los acontecimientos y los mecanismos que subyacen a su patogenesia y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras. Modelos murinos de GvHD se emplean con frecuencia para identificar y evaluar funcionalmente las moléculas y vías de conducción supuestamente GvHD intestinal. Sin embargo, significa específicamente monitorear y evaluar inflamación intestinal con el tiempo esencialmente faltan desde puntuaciones establecidas para evaluar grado de EICH aguda habitualmente se componen de diversos parámetros que reflejan más bien sistémica GvHD manifestaciones. La evaluación detallada de GvHD intestinal ha sido restringida a estudios utilizando ratones eutanasia, exclusión de tal modo esencialmente longitudinal (es decir, cinética) análisis del compartimiento del colon bajo una determinada condición experimental (por ejemplo, anticuerpo-mediada bloqueo de una citocina proinflamatoria) en ratones vivos (es decir, en vivo). La evaluación in situ mini-endoscópica del colon distal de ratones tratados con HCT de allo que se describe aquí permite a) una evaluación macroscópica detallada de diferentes aspectos de la inflamación intestinal y b) la opción de recoger muestras de tejido para análisis posteriores en diferentes momentos a lo largo del período de observación. En general, el enfoque endoscópico mini proporciona un gran avance en evaluación de GvHD intestinal y monitoreo no invasivo preclínico.

Introduction

Malignidades hematopoyéticas derivadas directamente del compartimento de células madre hematopoyéticas y descontrolada, progresando rápidamente y graves desordenes inmune-mediados suelen ser indicaciones para HCT allo^1,2. Sin embargo, aunque son responsables de la ocurrencia de la respuesta de injerto contra tumor beneficio pronóstica, los linfocitos del donante con frecuencia inducir y promover un ataque inmune-mediado no deseado de los componentes de tejido sano en el recipiente allo-HCT , un proceso que se llama injerto - versus - host disease³. En el intestino, el supuesto GvHD intestinal, las manifestaciones representan la complicación más temida de la GvHD aguda, formas graves de que son habitualmente asociadas con una alta mortalidad^1,2,4.

General modelos murinos de allo-HCT han surgido como herramientas muy valiosas para identificar y estudiar mecanismos inmune-mediados subyacente a la patogenesia de GvHD⁵. Sin embargo, la evaluación cinética de, por ejemplo, efectos beneficiosos de las intervenciones terapéuticas novedosas con el tiempo en vivo ratones rutinariamente basa en la determinación de GvHD clínico puntuaciones⁶. Mientras que estos puntajes son convenientes reflejar, por ejemplo, la carga total de enfermedad (es decir, la GvHD sistémica), clínica puntuaciones falta la sensibilidad para reflejar confiablemente manifestaciones órgano específicas (por ejemplo,, en el intestino). Por lo tanto, conclusiones, por ejemplo con respecto a los efectos de gut-protección de una determinada intervención terapéutica, que se basan estos sistemas de puntuación generalmente se quedan cortas.

A pesar de los avances importantes a través de la invención de la novela todo el cuerpo la proyección de imagen modalidades en combinación con el uso de cualquier modelos de ratón genético bioluminiscente o fluorescente^7,8, metodologías directamente y específicamente evaluar la intestinal carecen de manifestación de GvHD en ratones vivos. Por lo tanto, la razón de ser del Protocolo de la evaluación endoscópica de fenotipo GvHD intestinal que se describe en la sección siguiente es superar este obstáculo. Además, la motivación debe también reducir el número de ratones experimentales ya que, hasta ahora, una evaluación detallada de las características celulares, morfológicas y moleculares (e.g., por histopatología o biología molecular) de GvHD intestinal manifestación en última instancia ha requerido el sacrificio del ratón experimental.

Nuestra institución ha divulgado previamente en la metodología de la evaluación mini-endoscópica de colon manifestaciones en el curso de colitis syngeneic modelos⁹. En el protocolo que presentamos, hemos refinado y adaptado el colonoscopic puntuación matrix para la colitis alloresponse-conducido en vivo ratones con EICH intestinal sobre trasplante de alloreactive HCT y donante de linfocitos en un MHC de clase totalmente unida mal ajuste . Se identificaron cuatro parámetros adecuados para reflejar lesiones colónicas relacionadas con el EICH intestinales. Además, establecimos un sistema que permite una clasificación ajustada de cualquier factor individual, dando lugar a una nueva escala que fácilmente informa al lector acerca de la severidad de GvHD intestinal presente en un ratón dado en un momento dado. Los análisis histopatológicos confirmaron que una puntuación endoscópica por encima de cierto umbral es predecir confiablemente moderado a alto grado inflamación de los tejidos. Por lo tanto, la evaluación endoscópica mini parece representar un sustituto del trabajo de la histopatología de patrón oro que habitualmente requiere el sacrificio de los ratones experimentales. Importante, este protocolo puede ser aplicado en prácticamente cualquier punto de tiempo dado y puede ser utilizado repetidamente durante el curso de la enfermedad^10,11. Además, en contraste con el uso de enfoques dependientes de bioluminiscencia, ninguna medida laboral intensa y laboriosa como entrecruzar genéticamente modificado ratones se requieren y, por lo tanto, la metodología puede ser aplicada en prácticamente cualquier línea de ratón de interés.

Tomados en conjunto, dado el punto de vista clínico perjudicial de pacientes allo-HCT con GvHD intestinal severo, rápido progreso científico y una visión más clara en los mecanismos moleculares subyacentes la patogenesia inmune están urgente. Asimismo, importantes consideraciones éticas exigen que el aumento de los conocimientos debe lograrse con el uso de la mínima cantidad de ratones experimentales. Por lo tanto, ambos reconocieron reclamaciones en la comunidad de investigación explorando GvHD intestinal se pueden avanzar mediante la aplicación de evaluaciones seriales mini-endoscópica del colon en la cadena de trabajo experimental para supervisar y GvHD intestinal en vivo ratón experimental del grado modelos, descrito y validado en el protocolo presentado aquí.

Protocol

Los métodos experimentales descritos aquí han sido aprobados por el gobierno de Mittelfranken, Baviera, Alemania.

1. EICH inducción

1. Día 0: Total irradiación de cuerpo entero de los ratones receptores
   1. Uso femenino CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c los ratones que son al menos 10 semanas de edad como beneficiarios.
   2. Pesar y registrar el peso de los ratones receptores antes de la inducción de la EICH.
      Nota: Asegúrese de que el destinatario tiene un peso corporal mínimo de 20 g. El peso inicial del cuerpo será el valor de referencia para calcular la pérdida de peso del ratón individual sobre el curso de inducción de la EICH y la progresión.
   3. Coloque cinco ratones en el recipiente del Irradiador de rayos x.
   4. Irradiar los ratones por la irradiación corporal total con una dosis única de 8 Gy de rayos x. Utilice Cs¹³⁷ como fuente de radiación.
2. Día 1: Reconstitución de los ratones irradiados con médula ósea t-célula-agotado
   NOTA:El trasplante de células allogeneic de la médula, como se describe y detallada en la sección 1.2, debe ocurrir dentro de 24 h después de la irradiación. Realizar los procedimientos descritos a continuación en un cultivo de tejido estéril campana y utilizar reactivos filtrados. Uso alogénico CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ Ratones BoyCrl como donantes de médula ósea t-célula-agotado.
   1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 B6. Ratones SJL que donarán a las células de la médula de allogeneic conformidad con las directrices institucionales, 12-24 h después de la irradiación de los ratones BALB/c receptores. Para ello, anestesiar la B6 CD45.1/Ly5.1. Ratones SJL por la inhalación de 5% de isoflurano. Continuar con la exposición del isoflurano sobre 1 min después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical.
   2. Desinfectar la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   3. Posición del ratón sobre un trabajo vaina para que el ratón está en una posición prona, con sus cuartos traseros hacia al experimentador. Levante la piel en el talón de Aquiles con la punta de una pinza Semken con una longitud de 13 cm y puntas curvas serradas. Haga una incisión en la piel entre el fórceps y el talón con una tijera fina endurecido 8.5 cm con puntas rectas.
   4. Alargar la incisión cranially (es decir, desde el talón sobre la parte inferior la pierna y del muslo hasta la región de la cadera). Quitar la piel y el pelaje de las extremidades con la ayuda de las pinzas.
   5. Realizar el mismo procedimiento en las extremidades.
   6. Quite los miembros posteriores por corte a través de los empalmes adyacentes de cadera.
   7. Corte las patas traseras. Corte a través de la articulación de la rodilla. Almacenar el muslo y la caña de cada extremidades en una 92 mm placa Petri con tampón fosfato (PBS) una solución salina en el hielo.
   8. Limpiar cuidadosamente los huesos fémur y tibia retirando tanto tejido muscular como sea posible de cada muslo y la caña. Transferir los huesos fémur y tibia a un tubo de 50 mL con Medio RPMI 1640 estéril y lugar en hielo húmedo hasta que todos los huesos de tibia y fémur recogidos en el paso 1.2.7 se limpian de tejido muscular.
   9. Para aislar de la médula ósea, transferir un hueso de fémur o tibia a la vez (que ha sido limpiada como se describe en paso 1.2.8) del tubo de 50 mL a una placa de Petri (con un diámetro de 92 mm) con Medio RPMI 1640. Cortar los extremos del fémur o tibia con un bisturí para obtener acceso a la cavidad del hueso que contiene la médula ósea.
   10. Preparar un tubo de recogida de 50 mL con 5 mL de Medio RPMI 1640. Inserte una aguja de 26 G conectada a una jeringa de 1 mL llenada con 1 mL de Medio RPMI 1640 en la cavidad ósea y lavar la médula ósea de la cavidad en el tubo de colección empujando el émbolo.
   11. Repetir el punto 1.2.10 hasta que el hueso aparece luz y brillante (es decir, la cavidad ósea carece visiblemente rojizas de la médula). Deseche el hueso vacío.
   12. Repita los pasos 1.2.9 - 1.2.11, utilizando todos los huesos fémur y tibia del paso 1.2.8 y recoger todas las piezas recuperadas de la médula en el mismo tubo de la colección de 50 mL de paso 1.2.10. Mantenga el tubo de la colección en hielo húmedo hasta que todos los huesos del paso 1.2.8 han sido procesados por consiguiente.
   13. Pipeteando suavemente las piezas de la médula ósea roja, desmenuzable hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión unicelular. Filtrar la suspensión de la sola célula de la médula ósea a través de un colador de 40 μm malla pantalla celular a un tubo nuevo de la colección de 50 mL.
   14. Centrifugar el tubo de la colección de 50 mL que contiene la suspensión de la sola célula de médula ósea en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   15. Resuspender el precipitado en 5 mL de buffer lisis ACK (1 mM Na₂EDTA 10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl; pH 7.2) para lisis de glóbulos rojos. Incubar la suspensión celular por 3 min a temperatura ambiente. Después, añadir 10 mL de PBS solución a la suspensión de células.
   16. Centrifugar la suspensión a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 2 mL de solución de PBS.
   17. Contar las células de la médula ósea, utilizando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo comprobar la pureza de las células después de la purificación de la célula (ver paso 1.2.20).
   18. Para el agotamiento de las células T de la suspensión de la sola célula de la médula ósea, utilice un kit de purificación de células disponibles comercialmente. Magnéticamente agotan CD90.2⁺ las células (es decir, linfocitos) de la médula ósea total, siguiendo el protocolo del fabricante.
   19. Contar las células de médula ósea t-célula-agotado que se han aislado como se describe en paso 1.2.18, usando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 1 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo llevar a cabo más tarde como se describe en el paso 1.2.20.
       Nota: El rendimiento celular en promedio derivado de ratón de un donante es generalmente de 2 x 10⁷ a 3.4 x 10⁷ células de médula ósea t-célula-agotado.
   20. Confirmar una depleción de células T exitosa mediante citometría de flujo. Mancha 1 x 10⁶ células, de pasos 1.2.17 (células de la médula ósea antes de la separación magnética de células) y 1.2.19 (células de la médula ósea t-célula-agotado después de la separación magnética de células), con los siguientes anticuerpos: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), () α-CD4 GK1.5) y α-CD8α (53-6.7). Utilice las células restantes del paso 1.2.17 como control sin manchas y para los controles solo manchas, para configurar el citómetro de flujo.
       1. Transferencia de 1 x 10⁶ células de cada muestra en un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo de V para llevar a cabo el procedimiento de tinción de citometría de flujo.
       2. Desactivación de las células dentro de la placa de 96 pocillos (paso 1.2.20.1) 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de tampón FACS (filtrado de PBS suplementado con 3% de suero bovino).
       3. Centrifugar las células dentro de la placa de 96 pocillos en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
       4. Añadir una cantidad adecuada de anticuerpos de elección (Comparar con paso 1.2.20) a las muestras para tinción solo en 100 μl de tampón FACS.
       5. Preparar una mezcla de todos los anticuerpos (mezcla principal) que contiene las cantidades apropiadas y suficientes para teñir por separado las alícuotas de células de médula ósea conservadas desde antes de (ver paso 1.2.17) y después (ver paso 1.2.19) magnético agotamiento del T-cell. Añadir 100 μl de la mezcla principal a ambas alícuotas.
       6. Añadir 100 μl de tampón FACS para la muestra sin manchas.
       7. Incube las células dentro de la placa de 96 pocillos por 20 min a 4 ° C en la oscuridad.
       8. Añada 100 μl de tampón FACS y centrifugar las células dentro de la placa de 96 pocillos en 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 100 μl de tampón FACS.
       9. Centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 250 μl de tampón FACS.
       10. Transferir las muestras a un tubo de fondo redondo poliestireno de 5 mL y analizarlos con un instrumento de citómetro de flujo que es capaz de detectar las moléculas fluorescentes que se utilizaron para identificar los anticuerpos empleados para caracterizar las muestras de células (ver paso 1.2.20).
       11. Comparar la composición de la célula antes y después de la separación magnética de células.
           Nota: Una pureza de aproximadamente el 95% CD45.1⁺CD3^– (es decir,-célula-agotado T de la médula) células dentro de la puerta vivo se logra.
   21. Lavar las suspensiones de células de médula ósea t-célula-agotado 2 x con solución de PBS (450 x g durante 5 min a 4 ° C) y, finalmente, resuspender las células en solución de PBS, ajuste la concentración celular a 5 x 10⁷ células/mL. Mantener las células en hielo húmedo hasta la inyección.
   22. Inyectar células de médula ósea t-célula-agotado en los ratones receptores, que se irradiaron el día anterior (véase sección 1.1).
       1. Coloque el ratón experimental en una cámara de prueba de fugas e inducir la anestesia por inhalación de hasta 4% isoflurano, hasta que el ratón está inconsciente. Confirmar la analgesia y pérdida de la conciencia por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
       2. Inyectar las células 5 x 10⁶ -célula-agotado T de la médula (es decir, 100 μl de 5 x 10⁷ células/mL) con solución de PBS utilizando una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 30 G por vía intravenosa en el espacio retrobulbar que contiene el seno venoso.
3. Día 2: Transferencia de células T
   Nota: Los procedimientos descritos a continuación en una campana de cultivo estériles para tejidos y reactivos filtrados. Utilizar CD45.2 C57Bl/6 (tipo salvaje; Ratones como donantes las células aloreactivas T en peso). El uso de sistemas de marcador Congénicos permite el distinguishability entre receptor (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c mice) y tipos de donantes de células hematopoyéticas (células de médula ósea: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. Ratones SJL; alogénicas células T: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 ratones).
   1. Eutanasia a ratones C57Bl/6 con arreglo a la aplicación de las directrices y las autoridades. Por lo tanto, anestesiar ratones por inhalación con una concentración de 5% de isoflurano. Continuar la exposición de isoflurano hasta 1 min después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Desinfectar la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Coloque un colador con una malla de 40 μm en un tubo de recogida de 50 mL. Extirpar el bazo y coloque en el colador.
   3. Con un émbolo de la jeringa, dilacerar el bazo en el colador. Lave el filtro y el émbolo de la jeringa con PBS para recoger todos los esplenocitos.
   4. Centrifugar las células dentro del tubo de la colección de 50 mL a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
   5. Resuspender los esplenocitos en 3 mL de buffer lisis ACK lyse células de sangre rojas. Incubar la suspensión de células de 3 minutos después, añadir 10 mL de PBS y centrifugar las células a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante y resuspender los esplenocitos en PBS.
   6. Contar las células de bazo, usando un hemocitómetro. Desviar una parte alícuota de 6 x 10⁶ células para el análisis de citometría de flujo, para evaluar la magnitud de la purificación en el paso 1.3.9.
   7. Para un total CD3⁺ T-cell aislamiento de esplenocitos totales, utilice un kit de purificación de células disponibles comercialmente. Aislar las células de T esplénicas, siguiendo el protocolo del fabricante.
   8. Cuenta el CD3 esplénico⁺ T células aisladas como se describe en paso 1.3.7, usando un hemocitómetro. Conservar una alícuota de 1 x 10⁶ T células para el análisis de citometría de flujo.
      Nota: El rendimiento sobre la media de T esplénico de las células por donantes de ratón aislado por rangos de separación de celdas magnéticas de 1.3 x 10⁷ 2 x 10⁷ células.
   9. Confirman el éxito del aislamiento de células T por citometría de flujo. Para una descripción detallada del Protocolo de tinción, conferir y siga pasos 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Mancha 1 x 10⁶ esplenocitos de pasos 1.3.6 (antes de la separación magnética de células) y 1.3.8 (después de la separación magnética de la célula) con los siguientes anticuerpos: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) y α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilice las células restantes del paso 1.3.6 como control sin manchas y para sola tinción con los anticuerpos respectivos, para configurar el citómetro de flujo.
      3. Comparar la composición de la célula antes y después de la separación magnética de células.
         Nota: Una pureza ≥ 95% de CD45.2⁺CD3⁺ T deben lograr células dentro de la puerta en linfocitos.
   10. Células de lavado la T x 2 con PBS (450 x g durante 5 min a 4 ° C) y, finalmente, resuspender las células en solución de PBS, ajuste la concentración celular a 7 x 10⁶ células/mL. Mantener las células en hielo hasta la inyección.
   11. Inyecte aloreactivas, esplénicas células T (ver paso 1.3.10) en ratones BALB/c irradiados que han recibido previamente CD45.1⁺ -célula-agotado T de la médula las células (ver paso 1.2.22).
       1. Inducen anestesia colocando el ratón experimental en una cámara hermética en la que se expone hasta el 4% de isoflurano hasta que pierde su sentido. Confirmar la analgesia y pérdida de la conciencia por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
       2. Inyecte 0.7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T las células utilizando una jeringa de 1 mL, equipada con una aguja de 30 G   (es decir, 100 μl de 7 x 10⁶ células/mL) con solución de PBS (ver paso 1.3.10), por vía intravenosa en la retrobulbar espacio de los ratones para inducir GvHD. denominar estos ratones como el grupo experimental.
       3. Inyectar un grupo diferente de ratones con 100 μl de PBS solo, por vía intravenosa en el espacio retrobulbar, y denominar a este grupo como el grupo de control, posteriormente llamado "trasplantados de células T no (no) ratones".

2. evaluación de GvHD sistémica

Nota: Realizar este procedimiento en un entorno semi estériles en una sala experimental con licencia y equipado para el manejo de ratones vivos dentro de las instalaciones animales.

1. Seguir el curso clínico de la GvHD en ratones individuales; en concreto, evaluar y anotar los ratones experimentales 3 x por semana para detectar la presencia de síntomas clínicos de la GvHD, basado en un sistema de puntuación se describe a continuación y adaptado de un sistema de puntuación establecido previamente por Cook et al.⁶.
   1. Pesar cada ratón individualmente, registrar el peso y calcular thespecific pérdida de peso en relación con el peso del cuerpo que fue determinada antes del inicio del experimento (correspondiente al 100%) en el día 0 (paso 1.1.2). Anotar una pérdida de peso de menos del 10% del peso inicial con una pérdida de peso de más del 25% con grado 3, grado 0 y una pérdida de peso entre 10% y 25% con grado 1.
   2. Anotar el nivel de actividad de cada ratón, ratones exigentes con un nivel de actividad normal (puntuación = 0) de los ratones con un nivel de actividad moderadamente disminuida (puntuación = 1) y ratones con comportamientos fijos a menos que estén estimulados externamente (puntuación = 2).
   3. Marcar la textura de la piel, tal modo discriminar un pelaje normal, brillante y moderno (puntuación = 0) de un pelaje rizado moderado (puntuación = 1) y la presencia de calvas (puntuación = 2).
   4. Marcar la textura de la piel, piel normal que discrimina (puntuación = 0) de puntos esporádicos de descamación de la piel (por ejemplo, en la cola y las patas) (puntuación = 1) y escala obvio y áreas de la piel dolor (puntuación = 2).
   5. Analizar la consistencia de las fracciones de heces secretadas. Puntuación de taburete con una normal (es decir, consistencia dura) con el grado 0, taburete con taburete blando y deformable con grado 1 y sin ninguna consistencia y por lo tanto, con diarrea severa con grado 2 en las heces.
   6. En Resumen todos los parámetros por separado anotados a una máxima puntuación clínica de 12 por ratón.
2. Considerar y evaluar los criterios del Cesar el experimento de debido al nivel de gravedad de la enfermedad actual del ratón individual, con arreglo a las directrices institucionales aplicando y autorizado protocolo animal.

3. evaluación de GvHD Intestinal

1. Puntuación de las lesiones relacionadas con el EICH por mini-endoscopia de la región colorrectal distal
   NOTA:Realizar esto en un entorno semisterile en una sala experimental con licencia y equipado para el manejo de ratones vivos dentro de las instalaciones animales. Usar una plataforma mini-endoscópica que es aprobado para el uso de pequeños animales.
   1. Prepare el dispositivo endoscópico al cubrir el telescopio con (1,9 mm de diámetro) y una longitud de 10 cm con la vaina de la examinación endoscópica. Limpiar y esterilizar el endoscopio con agua y etanol.
   2. Encender el ordenador, la fuente de luz de xenón ajustable y el módulo de la cámara y ajustar el enfoque de forma que los objetos cerca de la lente dan una imagen clara.
   3. Conecte la bomba de aire a la vaina endoscópica. Para visualizar la corriente de aire, sumergir la punta del endoscopio en un vaso de vaso de precipitados llenado de agua. Regular la corriente de aire mediante el ajuste de la válvula entre la bomba de aire y la vaina endoscópica. Ajustar a una corriente de aire lenta y constante, reflejada en unos continuamente ascendente burbujas.
   4. Coloque un ratón en una cámara de prueba de fugas. Inducir la anestesia por inhalación de hasta 4% isoflurano hasta que el ratón está inconsciente. Confirmar la analgesia y un estado ausente de los reflejos por la prueba de la pérdida del reflejo del adrizamiento y la consiguiente pérdida del pedal retirar reflejo.
   5. Use una máquina de anestesia veterinaria apropiada según el protocolo animal utilizado. Transferir el ratón de la cámara en el espacio de trabajo de la colonoscopia. Aquí, posición del ratón anestesiado, con su nariz en la nariz (que está conectada al aparato de anestesia), en un limpio trabajo vaina para que el ratón está en una posición propensa, que enfrenta al experimentador con sus cuartos traseros.
   6. Para mantener la anestesia durante el procedimiento de colonoscopia, reducir la concentración de isoflurano a aproximadamente el 2%. Controlar respiración y respuesta a la estimulación durante la colonoscopia el mouse y ajustar la concentración de isoflurano en el vaporizador, si es necesario. Cubrir los ojos del ratón con ungüento para evitar que se seca.
   7. Control de la eficacia de la anestesia pellizcando entre los dedos del ratón. En el caso de ausencia de reactividad, proceda al paso 3.1.8.
   8. Levante la cola justo por encima de la raíz de la cola con una mano y con cuidado Introduzca el endoscopio, colocado en el otro lado, a través del ano en el recto.
   9. Mientras que la corriente de aire infla el lumen del colon, lentamente y con cuidado pasar el endoscopio hacia adelante en dirección aboral.
   10. Colocar el endoscopio en el lumen colónico y mantener esta posición con el fin de minimizar el contacto con la pared colónica y a evitar los arañazos, lesiones relacionadas con la pared más profunda (por ejemplo, dando por resultado la sangría), o incluso perforación de la pared (ver paso 3.1.17) . Este paso de control permanentemente observando la secuencia de vídeo (es decir, bajo la constante visualización del compartimiento del colon).
   11. Si las heces constricción la vista, retire el endoscopio y realizar un enema por vía rectal de lavado con hasta 2 mL de solución salina, utilizando una pipeta Pasteur suave. Utilice como poco líquido como sea posible, para evitar una dilución involuntaria de las heces y otros efectos secundarios afectando negativamente las características de la superficie de la mucosa y, en definitiva, los resultados de puntuación.
   12. Trate de colocar regularmente el endoscopio en un definido (es decir,, distintos) sitio anatómico en el colon distal para estandarizar el marcador de inflamación colónica y optimizar la comparabilidad de resultados entre ratones y a través de experimentos con calificaciones.
       Nota: Normalmente, con el endoscopio rígido, una profundidad máxima de 4 cm puede llegar por la vía rectal. Entre 2 y 4 cm de aborally, el colon regularmente se convierte en una flexión que no se puede pasar con el colonoscopio rígido. Uso de la región del colon distal adyacente a la flexión como el marcador predeterminado punto.
   13. Empezar a grabar la secuencia de vídeo y empezar con el marcador de la inflamación.
   14. Evaluar la inflamación relacionada con la EICH de los dos puntos al anotar los parámetros explicados y descritos en la tabla 1 y figura 3.
       1. Mover el endoscopio en la puntuación punto suavemente y ligeramente detrás y hacia adelante para evaluar los diferentes parámetros.
       2. Evaluar el parámetro de "transparencia", así como la "consistencia de las heces", colocando el endoscopio en una distancia más amplia en lo referente a la pared colónica.
       3. Evaluar los parámetros "granularidad" y "vascularización" colocando el endoscopio en proximidad cercana a la pared colónica. Para esta tarea, aplique tensión bien dosificada cuidadosamente a la pared colónica con la punta del endoscopio.
   15. Al finalizar el proceso de calificación, detener la grabación.
       Nota: Después, el clip de video grabado puede ser utilizado en total o para generar imágenes representativas (es decir, imágenes) de los criterios evaluados endoscópicamente mini en general contribuyendo a los inflamación colónica.
   16. Retire con cuidado el endoscopio.
   17. Deje de exposición de isoflurano al transferir el ratón a una jaula separada en la que se expone a aire ambiente. Caliente el ratón con una lámpara de luz roja y observar el ratón hasta que se recupera de la anestesia y recupera el sentido completo.
       Nota: Debido a la inflación del aire del colon durante la endoscopia, la región abdominal del ratón puede aparecer sopló para arriba directamente después. Mientras que esto es normal y de naturaleza transitoria, prolongadas signos de inflación masiva e incluso progresiva del abdomen y la falta de recuperación del ratón pueden indicar una perforación accidental de los dos puntos (en este caso, el ratón deben ser sacrificados ««««inmediatamente).
   18. Recuperación completa, coloque el ratón en su jaula correspondiente.
   19. Método opcional: también es posible tomar biopsias de tejido guiado por la vista. Seguir los siguientes pasos.
       Nota: La colonoscopia se realizará de la misma manera como se describe en pasos 3.1.1 - 3.1.18, con las siguientes modificaciones.
       1. En el paso 3.1.1, utilice una vaina de Examen endoscópico con un canal de trabajo integrado, en lugar de una vaina simple examen sin canales de trabajo, para cubrir el telescopio. Introducir un fórceps de biopsia en el canal de trabajo hasta que su punta es apenas visible delante del endoscopio en la pantalla porque esto evita en gran medida lesiones no intencionales en el intestino.
       2. Proceder con pasos 3.1.2 - 3.1.11. Insertar el endoscopio en el colon y empuje cuidadosamente hacia adelante al punto de interés.
       3. Emplear la ayuda de un segundo experimentador para la tarea de tomar biopsias de tejido colónico. Pedir el segundo experimentador para navegar por la punta de las pinzas de biopsia para la región colónica de elección empujando las pinzas dentro del canal de trabajo lentamente hacia adelante hasta que las mordazas de las pinzas se pueden abrir. Ver constantemente la secuencia de vídeo durante este procedimiento para minimizar el riesgo de lesionar la pared colónica.
       4. Recuperar una muestra de tejido de la pared colónica con cuidado abriendo y cerrando las mandíbulas de las pinzas de biopsia.
          Nota: Hacerlo con precaución para evitar la perforación de la pared colónica. En el raro caso de una perforación colónica, sacrificar inmediatamente el ratón afectado mediante la aplicación de medidas de conformidad con las directrices institucionales y bajo la administración continua de anestésicos.
       5. Tire y retire las pinzas cerradas fuera del canal de trabajo. Retire a la muestra de las mordazas de las pinzas de biopsia por inmersión y agitación con cuidado las pinzas abiertas en solución de PBS estéril. Después, seleccione las condiciones de almacenamiento adecuada para la muestra de tejido, según los análisis posteriores previstos. Después de la desinfección con etanol al 70%, el fórceps puede ser reutilizado para tomar otras biopsias.
       6. Después de tomar biopsias, retire el endoscopio y terminar la colonoscopia como se describe en pasos 3.1.16 - 3.1.18.
2. Análisis histopatológico
   1. Entre 26 y 30 días después de la irradiación de rayos x, eutanasia a los ratones receptores allo-HCT según aplicando las autoridades y las directrices. Para ello, anestesiar los ratones por la inhalación de 5% de isoflurano. Continuar con la exposición de isoflurane durante 1 minuto después de la detención de la respiración y confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Desinfectar cuidadosamente la piel y la piel del ratón con etanol al 70%.
   2. Abrir la cavidad abdominal y retire los dos puntos. Transfiéralo a un plato de Petri (con un diámetro de 92 mm) con PBS.
   3. Llene una punta del dosificador de 5 mL con PBS. Con la ayuda de una pinza Semken con una longitud de 13 cm y filo curvadas consejos, deslizar la parte distal del colon (aproximadamente 5 mm) sobre la punta de la punta del dispensador. Fijar los dos puntos con las pinzas en la punta del dispensador y lavar el colon con PBS presionando el émbolo de la punta del dispensador para eliminar las heces del intestino.
   4. Cortar un segmento colónico situado a unos 5 mm del ano, con la ayuda de un bisturí.
   5. Fijar a la muestra de intestino resecado en 4,5% de formaldehído durante la noche. Antes de inclusión en parafina, coloque el tejido en posición vertical.
   6. Corte 3 μm cortes del tejido parafina-encajado dos puntos transversales y tinción con hematoxilina y eosina (HE), utilizando protocolos de tinción.
   7. Preparar el teñido él secciones transversales de las muestras de tejido del colon.
   8. Adaptado de la matriz de puntuación por Kaplan et al¹², histopathologically puntuación de la actividad inflamatoria semiquantitatively, con puntuaciones de 0-3: sin inflamación (puntuación = 0), inflamación leve (puntuación = 1), moderada inflamación (puntuación = 2), y la inflamación severa (puntuación = 3).
      Nota: Lo ideal sería emplear para esta tarea la experiencia de un patólogo experimentado en la evaluación de GvHD intestinal murino y ciego a la naturaleza experimental y grupos de control.

Representative Results

El protocolo actual, describir la evaluación mini-endoscópica de lesiones asociadas de GvHD intestinales del colon distal, ha sido establecido y validado en ratones sometidos previamente a la inducción sistémica de un modelo de GvHD aguda severa. En este estudio, usamos una clase de MHC unió completamente mal sistema modelo en que BALB/c ratones fueron irradiados letalmente, seguida por el trasplante de médula alogénico t-célula-agotado y por la administración de inducir GvHD alloreactive C57BL/6 CD3⁺ Linfocitos T. Células de médula ósea t-célula-agotado y esplénicas células T para la inducción de la EICH se purificaron por separación magnética. Se determinó la pureza de estas poblaciones celulares por citometría de flujo y resultados representativos del proceso de purificación se muestran en la figura 1, mostrando una reducción suficiente de las células de médula ósea total y un enriquecimiento constante de derivados de bazo CD3⁺ T las células antes de su traslado a previamente ratones irradiados. El curso clínico que se muestra en la figura 2 muestra la inducción reproducible robusta del fenotipo GvHD sistémico clínico sobre allo-HCT en la presencia (WT, en negro) vs ausencia (no gris) de linfocitos de donante T alloreactive. El sistema de puntuación previamente reportado por Cooke et al. representa una base de suma en la que seis parámetros son evaluados y clasificados: postura, actividad, peso, textura de la piel del cuerpo, y heces de consistencia⁶. El control ratones experimentados sola, temprana que ocurre pico de la puntuación clínica, entre los días 5 y 10, se observó igualmente en los receptores de células T de ratones y es, por tanto, en gran parte debido a la respuesta inflamatoria sistémica asociado a irradiación. Cueste lo que cueste, puntuaciones clínicas de ratones de receptores de células T del donante comenzaron a subir antes, mostraron un mayor pico total, sólo disminuyó transitoriamente después de inicialmente un pico y luego, esencialmente aumentó otra vez, continuamente, durante el período restante de la experimento. En general, estos resultados están de acuerdo con la interpretación que los ratones receptores de células T muestran más fuertes y más progresivos signos de GvHD sistémica en comparación con ratones no.

Los ratones de allo-HCT de donante receptor de linfocitos T mostraban varios signos de relacionadas con órganos y sistémicas GvHD manifestaciones agudas, en general dando por resultado cuentas alta suma, mientras que los ratones control carecían de afecto moderada a severa, especialmente en momentos posteriores. Sin embargo, signos de GvHD intestinal están subrepresentados en la GvHD sistémica puntuación sistema, donde el único parámetro evaluado relacionados con la tripa es la consistencia de las heces. Como se muestra en la tabla 1, mini-endoscópicamente evaluables se definieron criterios, especialmente diseñado para la descripción precisa, calificación y clasificación de lesiones asociadas a GvHD intestinales, adaptando los criterios divulgados previamente para la evaluación de la colitis syngeneic al contexto de colitis basada en alloresponse⁹. Figura 3 muestra ejemplos típicos de cada criterio individual, ilustrando el tipo y grado de lesiones asociadas de GvHD intestinales, visualizando así la matriz de clasificación aplicada durante la evaluación mini-endoscópica del colon distal de Ratones propensos a GvHD sobre trasplante de MHC de clase totalmente unió mal los linfocitos del donante.

Figura 4 A muestra que intestinal GvHD suma puntaje resultados basados en criterios definidos en la tabla 1 y aparece en la figura 2 fácilmente habilitar el experimentador discriminar ratones receptores de linfocitos de donantes con signos severos de intestinal inflamación de los ratones de control que son esencialmente desprovisto de GvHD. Para validar el sistema de clasificación basado en mini-endoscópicamente, los estudios histopatológicos se realizaron usando un sistema clasificación microscópica previamente divulgados¹². Los datos en la figura 4B confirman que el colon de los ratones afectados por inflamación relacionada con la EICH, como lo demuestran los resultados de la alta suma colonoscopic, pantalla semejantemente fuerte signos histopatológicos de inflamación, dado un histopatológico suma la puntuación de ≥ 2 post mortem. En contraste, los tejidos del colon de los ratones de control Mostrar no (puntuación 0) o, en el más leve (score 1) signos histopatológicos de inflamación, en consonancia con la virtual ausencia de mini-endoscópicamente perceptibles signos de colitis. Además, como se muestra en la figura 4C, D, estudios de correlación entre mini-endoscópicamente e histopathologically evaluaron actividad de colitis y GvHD sistémica puntuaciones fueron realizadas. Lo importante, estos estudios demostraron que mini-endoscópicamente determinada suma decenas de ≤3 confiablemente predicen la ausencia de grado medio a superior (es decir, ≥2) intestinal asociada a GvHD inflamación colónica puntuaciones obtenidas de clasificación histopatológica. Finalmente, la severidad de GvHD intestinal evaluado endoscópicamente muestra una correlación con la actividad sistémica de la GvHD.

Figura 1 : Flujo cytometric evaluación de la calidad de las células magnéticamente purificada-célula-agotado T de la médula y trasplante allogeneic CD3 esplénico⁺ T células. (A) agotamiento de las células de la médula CD90.2⁺ logrado por la separación magnética, utilizando un kit de purificación disponibles comercialmente. La pureza de las células de la médula ósea t-célula-agotado fue determinada por citometría de flujo, por tinción de las células antes y después del agotamiento de la célula de T con anti-CD45.1 y anti-CD3. Se muestran los resultados de un experimento representativo. (B) T esplénico células magnéticamente se purificaron, empleando un kit de purificación disponibles comercialmente. La pureza fue determinada por citometría de flujo, comparando las frecuencias de CD45.2 y CD3 costaining de muestras de derivados antes y después del aislamiento de células T. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Curso clínico de la GvHD, empleando un MHC de clase totalmente unida mal modelo. Para inducir GvHD agudo, ratones BALB/c fueron irradiado en el día 0 de cuerpo entero. Los ratones recibieron células de médula ósea t-célula-agotado 24 h más tarde (d1). En el día 2, los ratones fueron inyectados con CD3 esplénicas alogénicas⁺ T las células (tipo salvaje [WT]; n = 9). Como control, algunos ratones recibieron-célula-agotado T de la médula solo (no; n = 9). Los ratones se evaluaron específicamente tres veces por semana para la presencia y severidad de los síntomas clínicos de GvHD. Los datos mostrados representan valores medios ± SEM de los resultados clínicos obtenidos de los ratones del grupo de tratamiento indicado de dos experimentos representativos. Los datos fueron analizados por ANOVA de dos vías, seguido de postest de comparaciones múltiples de Bonferroni. p < 0.0001 se consideró significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Representante imágenes ilustrando ejemplos de clasificación subyacente a la matriz de puntuación de las alteraciones del colon relacionada con la EICH intestinal determinada por una evaluación mini-endoscópica de los dos puntos de ratones vivos, allo-HCT-tratados. Para complementar e ilustrar la descripción detallada de la clasificación de puntuación utilizado y el sistema en la tabla 1, imágenes endoscópicas mini representativas de los niveles de severidad evaluados (clasificación) para todos los parámetros individualmente en el colon de anestesiados, energizados ratones sometidos a allo-HCT entre los días 26 y 30 antes y como se describe en la figura 1 se muestran aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Mini-endoscópica puntuación y clasificación de la inflamación relacionada con la EICH intestinal del colon, predecir con fiabilidad la presencia de colitis práctica evaluada por puntaje histopatológica. (A) entre los días 26 y 29 después de la inducción de la EICH como se describe en la figura 1, la manifestación de GvHD intestinal fue evaluada por endoscopia mini en ratones vivos, anestesiados. Alteraciones colónicas se anotó y clasificados según el sistema de puntuación y clasificación en la tabla 1 y figura 2. Imágenes endoscópicas representante de control (no T cell; no) y tipo salvaje (WT), receptores de células T de ratones y la puntuación mini-endoscópicamente cuotas (arriba) se muestran. (B) los ratones fueron sacrificados 12 h después de la evaluación mini-endoscópica, y la parte distal del colon fue procesada y evaluada histopatológicamente. La corrección de la actividad inflamatoria de secciones hematoxylin y eosina-manchadas del colon distal. Representante de hematoxilina y eosina-manchadas cruzar secciones del colon distal de los ratones tratados con HCT de allo no receptores de células T y WT T celular y la histología correspondiente se muestran puntuaciones. Se analizaron los datos en paneles A y B del estudiante t-pruebas y se muestran como media ± SEM. ***p < 0.0001 se consideró significativo. PESO: n = 15; No: n = 15. Los datos representan los datos agrupados de los cuatro experimentos individuales. (C) interdependencia de colonoscopia calificación y puntuación histológica. Los datos se presentan como diagramas de caja. Cada mancha muestra la mediana (línea negra dentro de cada cuadro), la gama de los datos (de min a max) y cuartiles (áreas de cada caja). PESO: n = 15; No: n = 15. Los datos representan los datos agrupados de los cuatro experimentos individuales. (D) correlación entre la puntuación de colonoscopia y puntuación clínica. Control y receptor de célula T ratones de tipo salvaje se incluyen en el análisis de correlación. La línea sólida representa la línea de regresión lineal. Coeficiente de correlación de Spearman (r-valor) y p-valor se muestran. PESO: n = 12; No: n = 13. Los datos representan los datos agrupados de los tres experimentos individuales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Puntuación	0	1	2	3
Translucidez de la pared colónica	Extra intestinales internos órganos (por ejemplo, bazo) bien visibles	Discreta reducción de la visibilidad de los órganos extra intestinales debido a la opacidad leve de la pared colónica	Moderada reducción de la visibilidad de los órganos extra intestinales debido a la opacidad significativa de la pared colónica	Falta de visibilidad de los órganos extraintestinales, la pared colónica, es decir no transparente
Nivel de detalle	Aspecto superficial mucosa lisa, inafectada; patrón de cripta colónica visible	Discreto aspecto aspereza y empedrado de la superficie de la mucosa	Moderada aspecto aspereza y empedrado de la superficie de la mucosa	Grave aspereza y aspecto empedrado de la superficie mucosa; amortiguador-como aspecto de la mucosa
Vascularidad	Patrón vascular inalterado mostrando la red de comunicación de grandes y pequeños vasos	Discretas alteraciones del patrón vascular; patrón vascular parece que fray	Algunos recipientes son invisibles; red de vasos discontinuo	Contacta con sangrado inducido; punto-como el patrón de los vasos
Consistencia de las heces	Normal; heces son difícil; hilos de rosca finos de moco entre las heces y la pared colónica se observa	Heces se forma todavía pero pueden tener bordes irregulares; deformable con la punta del endoscopio	Materia fecal es suave y no conformados heces son visiblemente más brillante (mayor contenido de agua)	Heces son sueltas, el líquido; diarrea acuosa. Taburete se puede diseminar al azar sobre la superficie mucosa del colon

Tabla 1: Mini-endoscópica puntuación y clasificación matriz de lesiones relacionadas con el EICH intestinales en el colon de ratones tratados con HCT de allo vivo. Alteraciones de la morfología endoluminal y transmural de colon en ratones pretratado allo-HCT fueron evaluados por una colonoscopia del recto y el colon distal de ratones anestesiados, vivo, utilizando un sistema de endoscopia mini murino. Lesiones colónicas fueron clasificadas con la ayuda del sistema de puntuación endoscópica (índice modificado de murino endoscópica de la severidad de la colitis [MEICS]) que se deduce de la original MEICS sistema reportado por Becker et al⁹ y adaptado al contexto de allo-HCT. El colon distal se evaluó visualmente la presencia y magnitud de los siguientes cuatro parámetros: 1. la transmisión de luz endoscópica (translucidez) a través de la pared intestinal colónica como engrosamiento de la pared; 2. la superficie de la mucosa muestra un aspecto de empedrado (granularidad) de la superficie mucosa endoluminal-orientado; 3. un patrón de vascularización alterada (vascularidad); 4. endoscópicamente evaluó la aparición de heces in situ (consistencia de las heces). Cada parámetro se calcula el puntaje de 0 (sin signos) a 3 (fenotipo más severo), agregando hasta un puntaje máximo suma de 12 por ratón.

Discussion

El protocolo describe la metodología de la inducción y evaluación mini-endoscópica del colon fenotipo observado en el curso de GvHD intestinal. Sirve el mayor propósito de permitir a los científicos estudiar GvHD intestinal longitudinalmente y de forma no invasiva en el transcurso de toda enfermedad (es decir, desde el inicio de la manifestación colónica y la progresión hasta la actividad máxima de la enfermedad).

Sin embargo, hay algunos pasos críticos y limitaciones importantes inherentes a la metodología presentada que el experimentador debe tener en cuenta antes de aplicar las tecnologías en el contexto científico correspondiente. En primer lugar, aunque hemos utilizado con éxito la evaluación mini-endoscópica de lesiones de colon relacionados con GvHD intestinales en un modelo no coincidentes de histocompatibilidad menor system¹¹, el protocolo proporcionado aquí actualmente es exclusivamente aplicable a MHC clase I totalmente desiguales modelos de GvHD agudos. Mientras que el MHC de clase totalmente unida mal modelo de GvHD es común y frecuente⁵, está bien establecido que las características de la manifestación de GvHD dependen mucho los substrains de ratón usado ya que esto incide fuertemente, por ejemplo, la sensibilidad a la irradiación. Además, la fuente del ratón experimental con, por ejemplo, una diferente composición de la microbiota intestinal y utilizados números transferidos alogénicos de células de T puede afectar críticamente la cinética y la dinámica de la GvHD intestinal manifestación¹². Por lo tanto, un paso crítico es a prueba y validar las medidas indicadas por su capacidad inducir con éxito el GvHD intestinal como se muestra.

Con respecto a la implementación exitosa de la evaluación endoscópica mini vivo de GvHD agudo intestinal, queremos destacar que, durante la manipulación del endoscopio es sencillo, puede ser necesario cierto entrenamiento, para minimizar el riesgo de experimentar el más temido complicación (es decir, perforar la pared intestinal con el instrumento rígido en combinación con la necesidad de inflar de aire el colon). Debido a una mayor vulnerabilidad inducida por la inflamación y menor flexibilidad del tejido del colon, la integridad de la pared intestinal podría ser mayor riesgo durante la fase de recuperación después de la radiación (i.e.,until día 10) y a la plena manifestación de intestinal Colitis relacionada con la EICH (es decir, después de unos día 25). Lo importante, sin embargo, no hemos observado las tasas de complicaciones significativamente mayor dependiente en el momento de la endoscopia, como el endoscopio se avanza suavemente con suficiente visibilidad. En cambio, se identificaron dosificación subóptima de drogas para ser un factor de riesgo ya que una insuficiente profundidad de la anestesia puede provocar la aparición de movimientos no deseados del cuerpo del ratón experimental y, consecutivamente, eventos de perforación de la pared colónica. En segundo lugar, el paso más crítico durante el proceso de puntuación representa las restricciones en esta materia debido a la presencia no deseada de sólido o líquido (por ejemplo, diarrea) heces en el lumen del intestino como el experimentador mueve el endoscopio en posición de anotar. En esta situación, a menudo es necesario lavar la región colorrectal con solución salina usando una pipeta de plástico flexible. Sin embargo, puesto que este procedimiento pueda comprometer la precisión y especificidad de varios parámetros (por ejemplo, consistencia de las heces), esta advertencia con cuidado debe tenerse en cuenta al anotar.

Hay varias limitaciones que restringen la interpretación y conclusiones de este acercamiento endoscópico. En primer lugar, intrínseco a una metodología de uso de un endoscopio flexible por vía rectal, las evaluaciones se limitan a lo últimos 3-4 cm del tracto gastrointestinal (es decir, el recto y el colon distal). Por lo tanto, asociados de GvHD afecciones de colon proximal y el incluso el intestino son excluidos de la evaluación, lo que indica que cuestiones científicas centrándose en el fenotipo intestinal pequeño de GvHD no se beneficiarán de este enfoque de forma predeterminada. En segundo lugar, aunque la inflamación es una de las características morfológicas de la seña de identidad de GvHD intestinal, características adicionales, como una tasa de aumento de la apoptosis de las células epiteliales intestinales y pérdida de la arquitectura de la cripta intestinal, a menudo se encuentran y incluido en el flujo de trabajo histopatológica subyacentes GvHD intestinal puntuación y clasificación por los patólogos en pacientes allo-HCT. Aquí, restringida correlacionamos las puntuaciones de GvHD intestinales mini-endoscópicamente evaluaron histopatológicamente los signos de inflamación. Tomando este enfoque, llegó a la conclusión que inflamación colónica por encima de un cierto umbral en el marcador colonoscopic es predecir confiablemente la presencia de inflamación de grado moderado a alto, según lo determinado por análisis histopatológicos de post mortem. Sin embargo, los estudios futuros deben investigar cómo, por ejemplo, las tasas de apoptosis histopathologically evaluados se relacionan con mini-endoscópica total puntuaciones suma o, por ejemplo, uno de los cuatro parámetros individuales integrados en la puntuación de la suma. En tercer lugar, mientras que ratones sufren GvHD histopathologically moderado-a-alto grado pueden identificarse fácilmente por el método de puntuación endoscópico, ratones con signos más sutiles de la inflamación intestinal pueden perderse por el enfoque descrito, teniendo en cuenta el hecho de que puntuación histopatológico reveló la presencia de signos leves de inflamación en el grupo de ratones no sometidos a sola, sin el trasplante de los linfocitos del donante alloreactive allo-HCT. Biológicamente, este hallazgo podría ser factible, ya que ratones no han sido allotransplanted y colitis mínimo puede, en efecto, reflejar la presencia de niveles bajos de GvHD debido a una extirpación incompleta de células T de la fracción de células de médula ósea o la reconstitución de células aloreactivas T de la médula ósea con el tiempo. Estudios futuros deben abordar estas cuestiones con más detalle. En cuarto lugar, formalmente, este protocolo se centra en la colitis asociada con GvHD intestinal completamente establecida. Sin embargo, como se muestra y publicado previamente, el inicio de la colitis alrededor del día 15 puede ser detectado endoscópicamente y cuantificaron¹¹. Aquí, ratones propensos a la GvHD pueden distinguirse claramente de no de ratones en los que el fenotipo colónico podría deberse únicamente signos residuales del daño tisular inducido por irradiación o, espejo más bien, la respuesta de la mucosa de la recuperación después de la irradiación¹¹. Sin embargo, estudios futuros necesitan correlacionar las evaluaciones endoscópicas y objetivo análisis histopatológicos detallados de ratones propensos a GvHD en comparación con ratones control en momentos anteriores.

Por último, una aplicación interesante y útil Add-on de puntuación endoscópica de GvHD intestinal es el uso del canal de trabajo endoscópico para dirigir una pinzas para biopsias minimizadas a la estructura anatómica de la opción en el colon. Esta característica proporciona, como una especie de built-in-opción, la posibilidad de tomar biopsias de tejido guiado por la vista que pueden analizarse más por una serie de técnicas aguas abajo como histopatología, inmunofluorescencia tinción y análisis en tiempo real de PCR de genes de interés. Sin embargo, estudios futuros deben evaluar formalmente si, por ejemplo, puntuación y clasificación de biopsias tomadas vía endoscópica histopatológica equivalen a resultados histopatológicos basados en muestras tomadas convencionalmente (es decir, de la eutanasia ratones).

En general, con este protocolo que describe la inducción y su evaluación mini-endoscópica de GvHD intestinal, proporcionamos una metodología para evaluar, puntuación y grado de EICH intestinal en un relevante sistema murino de modelo de GvHD de allo-HCT. La evaluación endoscópica se puede repetir en el mismo ratón en varios puntos del tiempo con el tiempo, eliminando la necesidad de eutanasia ratones evaluar secuencialmente patología de tejido asociado a GvHD intestinal (por ejemplo, en un ambiente terapéutico). Los resultados de puntuación endoscópica mini resultaron para ser comparable a los resultados obtenidos por la evaluación histopatológica de la inflamación intestinal en el colon y correlación con actividad sistémica de la GvHD. Además, este procedimiento puede combinarse con biopsias guiadas por visión a través del canal de trabajo del endoscopio. En última instancia, sin embargo, estudios futuros deben evaluar hasta qué punto determinadas histopathologically rasgos morfológicos distintos de inflamación, que se encuentran con frecuencia en lesiones intestinales afectadas por GvHD, se refieren a los resultados obtenidos con este Mini-endoscópica evaluación y puntuación de enfoque.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456