Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Summary

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Abstract

Acute graft - versus - host-ziekte (GVGH) vertegenwoordigt de meest ernstige complicatie dat patiënten eerder ondergaan Allogene hematopoietische stamcel transplantatie (allo-HCT) gezicht en wordt vaak geassocieerd met een slechte klinische uitkomst. Terwijl, bijvoorbeeld, GVGH uitingen van de huid zijn meestal inspelen op gevestigde immuun-onderdrukkende therapieën en, vandaar, niet nemen een fatale cursus, de aanwezigheid en de intensiteit van intestinale GVGH, vooral van de medio-aan-onderste delen van de darm, sterk beïnvloeden het resultaat en algehele overleving van patiënten met acute GVGH. therapeutische opties zijn in wezen beperkt tot de klassieke immuun-onderdrukkende agenten slechts matig ziekte-beperkende effecten oplevert. Vandaar, gedetailleerde kennis over de weefsel-ingezeten immuun cascade, veranderingen in de intestinale microbiota, en het voorafgaande, op en na intestinale GVGH begin stromale antwoord dringend nodig zijn om te begrijpen van de gebeurtenissen en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese en het ontwikkelen van innovatieve therapeutische opties. Lymfkliertest modellen van GVGH zijn vaak aangewend om te kunnen bepalen en beoordelen functioneel moleculen en trajecten vermeende rijden intestinale GVGH. Echter, kunnen specifiek monitoren en evalueren van intestinale ontsteking na verloop van tijd in wezen ontbreken aangezien gevestigde scores te beoordelen en rang van acute GVGH routinematig bestaan uit verschillende parameters die eerder systemische GVGH weerspiegelen manifestaties. De gedetailleerde evaluatie van intestinale GVGH is beperkt met behulp van euthanized muizen, waardoor in wezen exclusief longitudinale studies (dat wil zeggen, kinetische) analyses van het Colon compartiment onder een bepaalde experimentele voorwaarde (bijvoorbeeld antilichaam-gemedieerde blokkade van een cytokine proinflammatoire) in levende muizen (dat wil zeggen, in vivo). De mini-Endoscopische in situ evaluatie van de distale dikke darm van allo-HCT-testgroep muizen hier beschreven staat a) een gedetailleerde macroscopische evaluatie van verschillende aspecten van darmontstekingen en b) de mogelijkheid om het verzamelen van weefselmonsters voor downstream analyses op verschillende tijdstippen in de loop van de waarnemingsperiode. De mini-Endoscopische benadering biedt over het algemeen een grote stap vooruit in de preklinische noninvasive monitoring en evaluatie van intestinale GVGH.

Introduction

Hematopoietische maligniteiten die rechtstreeks voortvloeien uit het compartiment hematopoietische stamcellen en ongecontroleerde, zijn snel vordert, en ernstige immuun-gemedieerde aandoeningen vaak aanwijzingen voor het uitvoeren van allo-HCT^1,2. Hoewel boekhouding voor het vóórkomen van de prognostische gunstig graft-versus-tumor reactie, zijn donor lymfocyten echter vaak inducerende en bevordering van een ongewenste immuun-gemedieerde aanval van gezond weefsel componenten binnen de allo-HCT-ontvanger , een proces dat graft - versus - host-ziekte^{3 heet}. Uitingen in de darm, de zogenaamde intestinale GVGH, vertegenwoordigen de meest gevreesde complicatie van acute GVGH, ernstige vormen van die routinematig geassocieerd met een hoge mortaliteit^{1,2,4 worden}.

Algemene, lymfkliertest modellen van allo-HCT opgedoken als waardevolle instrumenten te identificeren en immuun-gemedieerde mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathogenese van GVGH⁵te bestuderen. Echter, kinetische beoordeling van, bijvoorbeeld, gunstige effecten van nieuwe therapeutische ingrepen na verloop van tijd in levende muizen routinematig berust op de vaststelling van klinische GVGH scoort⁶. Terwijl deze scores geschikt om na te denken zijn, bijvoorbeeld, de totale ziektelast (dat wil zeggen, de systemische GVGH), klinische scoort ontbreken de gevoeligheid betrouwbaar gespiegeld orgel-specifieke manifestaties (b.v., in de darm). Vandaar, conclusies, bijvoorbeeld met betrekking tot de gut-beschermende effecten van een bepaalde therapeutische interventie, die zijn gebaseerd op deze systemen meestal scoren tekortkomen.

Ondanks de grote vooruitgang door de uitvinding van nieuwe gehele lichaam imaging modaliteiten in combinatie met het gebruik van beide bioluminescente of TL genetische muis modellen^7,8, methodologieën om rechtstreeks en specifiek beoordelen de intestinale manifestatie van GVGH in levende muizen ontbreken. Vandaar, de grondgedachte achter het protocol van de Endoscopische beoordelingvan de intestinale GVGH fenotype beschreven in de volgende sectie is het overwinnen van deze hindernis. Bovendien, de motivatie ook is om experimentele muizen nummers sinds, tot nu toe een gedetailleerde evaluatie van de moleculaire, cellulaire en morfologische kenmerken (bijvoorbeeld, door histopathologie of moleculaire biologie) voor intestinale GVGH manifestatie heeft uiteindelijk het offer van de experimentele muis nodig.

Onze instelling heeft eerder gerapporteerd over de methodologie van een mini-Endoscopische beoordeling van Colon manifestaties in de loop van syngeneic ulcerosa modellen⁹. In het protocol hier gepresenteerd, hebben we verfijnd en aangepast de colonoscopic matrix scoren voor alloresponse-gedreven colitis in levende muizen met intestinale GVGH na transplantatie van alloreactive HCT en donor lymfocyten in een MHC klasse ik volledig verkeerde instelling . We geïdentificeerd vier parameters geschikt om na te denken van intestinale GVGH-gerelateerde Colon laesies. Bovendien vastgesteld we een systeem dat toelaat een verfijnd sortering van enkele determinant, resulterend in een nieuwe stand die gemakkelijk de lezer over de ernst van intestinale GVGH aanwezig in een bepaalde muis op een bepaald tijdstip informeert. Histopathologische analyses bevestigd dat een Endoscopische score boven een bepaalde drempel is betrouwbaar het voorspellen van matige tot hoge rang weefsel ontsteking. Vandaar, mini-Endoscopische evaluatie lijkt te vertegenwoordigen invaller werken voor de goudstandaard histopathologisch onderzoek waarvoor routinematig het offer van de experimentele muizen. Bovenal dit protocol kan worden toegepast op vrijwel elk punt gegeven moment en kan herhaaldelijk worden gebruikt in de loop van de ziekte^10,11. Bovendien, in tegenstelling tot het gebruik van bioluminescentie-afhankelijke benaderingen, geen arbeid-intensieve en tijdrovende maatregelen zoals intercrossing genetisch muizen gemodificeerde zijn vereist en, vandaar, de methodologie kan worden toegepast op vrijwel elke regel van de muis van de belang.

Tezamen, gegeven het schadelijk klinische perspectief van allo-HCT patiënten met ernstige intestinale GVGH, zijn snelle wetenschappelijke vooruitgang en meer inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de immuun pathogenese dringend noodzakelijk. Evenzo eisen belangrijk, ethische overwegingen dat de winst van kennis moet worden bereikt met het gebruik van het minimale aantal experimentele muizen. Vandaar, zowel erkende vorderingen op de onderzoekgemeenschap verkennen van intestinale GVGH kunnen worden gevorderd door de uitvoering van seriële mini-Endoscopische evaluaties van de dikke darm in de experimenteel werk-keten te controleren en rang van intestinale GVGH in levende experimentele muis modellen, als beschreven en gevalideerde in het protocol hier gepresenteerd.

Protocol

De experimentele methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de regering van Oberbayern, Beieren, Duitsland.

1. GVGH-inductie

1. Dag 0: Totale lichaam bestraling van de ontvangende muizen
   1. Gebruik van de vrouwelijke CD45.2⁺ H2kd⁺ BALB/c muizen die ten minste 10 oud als ontvangers weken.
   2. Wegen en het gewicht van de ontvangende muizen voorafgaand aan GVGH-inductie.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de ontvanger een minimale lichaamsgewicht van 20 g. Het basisgewicht van lichaam zal dienen als de referentiewaarde voor de berekening van het verlies van het gewicht van de afzonderlijke muis in de loop van GVGH inductie en progressie.
   3. Plaats maximaal vijf muizen in de container van de irradiator van de X-ray.
   4. De muizen door totale lichaam bestraling met een enkelvoudige dosis van 8 Gy van X-ray bestralen. Cs-¹³⁷ gebruiken als een stralingsbron.
2. Dag 1: Reconstructie van de bestraalde muizen met beenmerg T-cel-uitgeput
   OPMERKING:De transplantatie van cellen van allogene beenmerg, als zijn geschetst, alsmede gedetailleerde onder punt 1.2, moet plaatsvinden binnen de 24 uur na bestraling. Uitvoeren van de procedures die hieronder worden beschreven in een steriele weefselkweek kap en gebruik van gefilterde reagentia. Gebruik allogene CD45.1/Ly5.1 B6. SJL-Ptprca Pepcb/ BoyCrl muizen als donor voor beenmerg T-cel-uitgeput.
   1. Euthanaseren CD45.1/Ly5.1 B6. SJL muizen die allogene beenmergcellen overeenkomstig de institutionele richtsnoeren, 12-24 uur na de bestraling van de ontvangende BALB/c muizen zal schenken. Anesthetize, de CD45.1/Ly5.1 B6. SJL muizen door inhalatie van 5% Isofluraan. Doorgaan met de Isofluraan blootstelling meer dan 1 min na arrestatie ademhaling en bevestigen van euthanasie door cervicale dislocatie.
   2. Desinfecteer de vacht en huid van de muis grondig met 70% ethanol.
   3. Plaats de muis op een schone werken schede, zodat de muis is in een liggend, met haar achtervoeten geconfronteerd met de experimentator. Til de vacht op de achilleshiel met het puntje van een Semken Tang met een lengte van 13 cm en gekartelde gebogen tips. Incise van de huid tussen de Tang en de hiel met geharde 8,5 cm fijne schaar met rechte tips.
   4. Elongate cranially de incisie (dat wil zeggen, van de hiel op de onderste been en de dij aan de hip regio). Verwijder de huid en de vacht van de hind-limb met de hulp van de verlostang.
   5. Het uitvoeren van dezelfde procedure op de andere hind-limb.
   6. Verwijder de achterste ledematen door doorsnijden de aangrenzende heupgewrichten.
   7. Knippen weg de achterste poten. Het kniegewricht doorsnijden. Bewaar de dij en de schacht van elke samen in een 92 mm petrischaal gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing op ijs hind-limb.
   8. Het bovenbeen en onderbeen botten zorgvuldig schoon door het verwijderen van zo veel spierweefsel mogelijk vanaf elke dijen en Schenkel. Het bovenbeen en onderbeen botten overbrengen in een tube van 50 mL gevuld met steriele RPMI 1640 medium en plaats het op nat ijs totdat alle scheenbeen en het dijbeen botten verzameld in stap 1.2.7 worden schoongemaakt van spierweefsel.
   9. Gevuld met RPMI 1640 medium te isoleren van het beenmerg, een dijbeen of tibia bot tegelijk (die is schoongemaakt zoals beschreven in stap 1.2.8) van de tube 50 mL overbrengen naar een petrischaal (met een diameter van 92 mm). De uiteinden van het dijbeen of tibia met een scalpel toegang te krijgen tot de holte van de bone met het beenmerg afgesneden.
   10. Een tube van 50 mL collectie met 5 mL van RPMI 1640 medium voor te bereiden. Invoegen van een naald van de 26 G gekoppeld aan een 1 mL spuit gevuld met 1 mL van RPMI 1640 medium in de holte van het bot en spoelen van het beenmerg uit de holte in de collectie buis door het indrukken van de zuiger.
   11. Herhaal stap 1.2.10 tot het bot wordt weergegeven van licht en glanzend (dat wil zeggen, de bot holte zichtbaar verstoken is roodachtig beenmerg). Gooi het lege bot.
   12. Herhaal stap 1.2.9 - 1.2.11, met behulp van alle bovenbeen en onderbeen botten uit stap 1.2.8, en het verzamelen van alle herstelde beenmerg stukken in de dezelfde collectie-tube van 50 mL uit stap 1.2.10. Houd de buis van de collectie op nat ijs totdat alle botten uit stap 1.2.8 dienovereenkomstig zijn verwerkt.
   13. Maak een suspensie van eencellige zachtjes op en neer waarbij de gespoeld, kruimelig beenmerg stukken. Filtreer het beenmerg eencellige schorsing door een 40 µm mesh scherm cel zeef geplaatst op een nieuwe collectie-tube van 50 mL.
   14. Centrifugeer de collectie-tube van 50 mL met het beenmerg eencellige schorsing bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
   15. Resuspendeer de pellet in 5 mL ACK lysing buffer (1 mM nb₂EDTA 10 mM KHCO₃144 mM NH₄Cl; pH 7,2) voor lysis van de rode bloedcellen. Incubeer de celsuspensie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Daarna onmiddellijk vergroten met 10 mL PBS oplossing de celsuspensie.
   16. Centrifugeer de schorsing bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 mL PBS oplossing.
   17. Tellen de beenmergcellen, met behulp van een hemocytometer. Behoud van een aliquoot gedeelte van 6 x 10⁶ cellen voor stroom cytometry analyse om te controleren de zuiverheid van de cellen na zuivering van de cel (zie stap 1.2.20).
   18. Gebruik voor de uitputting van de T-cellen van het beenmerg eencellige schorsing, een commercieel beschikbare cel zuivering kit. Magnetisch uitputten CD90.2⁺ cellen (dat wil zeggen, lymfocyten) van de totale beenmergcellen, volgens protocol van de fabrikant.
   19. Tellen de T-cel-verarmd beenmergcellen die geïsoleerd werden zoals beschreven in stap 1.2.18, met behulp van een hemocytometer. Het behoud van een aliquoot deel van 1 x 10⁶ cellen voor stroom cytometry analyse moet later worden uitgevoerd zoals beschreven in stap 1.2.20.
       Opmerking: Het rendement van de op het gemiddelde cel afgeleid van een donor muis is gewoonlijk van 2 x 10⁷ aan 3.4 x 10⁷ T-cel-verarmd beenmergcellen.
   20. Bevestig een succesvolle T-cel depletie door stroom cytometry. 1 x 10⁶ cellen, behouden van stappen 1.2.17 (beenmergcellen voordat magnetische cel scheiding) en 1.2.19 (T-cel-verarmd beenmergcellen na scheiding van de magnetische cel), met de volgende antistoffen vlekken: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 () GK1.5), en α-CD8α (53-6,7). Gebruik de resterende cellen uit stap 1.2.17 als een onbevlekt besturingselement en voor single-kleuring besturingselementen, instellen van de cytometer van de stroom.
       1. 1 x 10⁶ cellen van elk monster overbrengen naar een waterput van een 96-wells-plaat met een V-bodem voor het uitvoeren van de cytometrische van de stroom kleuring van de procedure.
       2. Spin down de cellen binnen de 96-wells-plaat (stap 1.2.20.1) bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS buffer (PBS aangevuld met 3% gefilterd runderserum).
       3. Centrifugeer de cellen binnen de 96-wells-plaat bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
       4. Een passend bedrag van het antilichaam van keus (vergelijk met stap 1.2.20) aan de monsters voor enkele vlekken in 100 µL van FACS buffer toevoegen.
       5. Bereiden een mengsel van alle antilichamen (master mix) met de juiste bedragen voldoende om apart vlek het beenmerg cel aliquots van voorafgaande bewaard (zie stap 1.2.17) en na (zie stap 1.2.19) magnetische T-cel depletie. Voeg 100 µL van de master mix aan beide aliquots.
       6. Voeg slechts 100 µL van FACS buffer aan het Onbevlekt monster.
       7. Incubeer de cellen binnen de 96-wells-plaat voor 20 min bij 4 ° C in het donker.
       8. Voeg 100 µL van FACS buffer en centrifugeer de cellen binnen de 96-wells-plaat bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 100 µL van FACS buffer.
       9. Centrifugeer de cellen bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 250 µL van FACS buffer.
       10. De monsters overbrengen in een polystyreen ronde-bodem-tube van 5 mL en analyseren met een stroom cytometer instrument dat kan ontdekken de fluorescerende moleculen die werden gebruikt voor het label van de antilichamen werkzaam te karakteriseren de celsteekproeven (zie stap 1.2.20).
       11. Vergelijk de samenstelling van de cel van vóór en na de scheiding van de magnetische cel.
           Opmerking: Een zuiverheid van circa 95% CD45.1⁺CD3^- (d.w.z., T-cel-verarmd beenmerg) cellen binnen de levende poort wordt gewoonlijk bereikt.
   21. Wassen van de T-cel-verarmd beenmerg cel schorsingen 2 x met PBS oplossing (450 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C) en, ten slotte, resuspendeer de cellen in PBS oplossing, aanpassen van de concentratie van de cel tot 5 x 10⁷ cellen/mL. Houd de cellen op nat ijs tot de injectie.
   22. T-cel-verarmd beenmergcellen te injecteren in de ontvangende muizen, die waren bestraald eergisteren (zie punt 1.1).
       1. Plaats de experimentele muis in een lekvrije kamer en anesthesie veroorzaken bij inademing van maximaal 4% Isofluraan, totdat de muis bewusteloos is. Bevestig analgesie en verlies van bewustzijn door het verlies van de restarmen reflex testen en het daaropvolgende verlies van het pedaal trekken reflex.
       2. Injecteren van 5 x 10⁶ T-cel-verarmd beenmergcellen (d.w.z. 100 µL van 5 x 10⁷ cellen/mL) met PBS oplossing met behulp van een spuit van 1 mL uitgerust met een naald 30 G intraveneus in de retrobulbaire ruimte met de veneuze sinus.
3. Dag 2: Overdracht van T cellen
   Opmerking: Uitvoeren van de beschreven procedures onder in een steriele weefselkweek kap en gebruik van gefilterde reagentia. Gebruik CD45.2 C57Bl/6 (wild-type; WT) muizen als donor voor alloreactive T cellen. Het gebruik van congenisch marker systemen mogelijk de distinguishability tussen ontvanger (CD45.2⁺ H2kd⁺ Balb/c muizen) en donor hematopoietische celtypes (beenmergcellen: CD45.1⁺ H2kb⁺ B6. SJL muizen; allogene T cellen: CD45.2⁺ H2kb⁺ C57/Bl6 muizen).
   1. Euthanaseren C57Bl/6 muizen overeenkomstig de toepassing van institutionele richtsnoeren en autoriteiten. Daarom, anesthetize muizen met een concentratie van 5% Isofluraan na inademing. Blijven de Isofluraan blootstelling tot 1 min na arrestatie ademhaling en bevestigen van euthanasie door cervicale dislocatie. Desinfecteer de vacht en huid van de muis grondig met 70% ethanol.
   2. Plaats een zeef met een gaas-scherm van 40 µm op een tube van 50 mL collectie. Verwijder de milt en plaats het op de zeef.
   3. Met een zuiger van de spuit, Vermaal de milt in de zeef. Was de zeef en de plunjer van de injectiespuit met PBS voor het verzamelen van alle splenocytes.
   4. Centrifugeer de cellen binnen de collectie tube van 50 mL bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
   5. Resuspendeer de splenocytes in 3 mL ACK lysing buffer lyse van rode bloedcellen. Incubeer de celsuspensie voor 3 min. daarna, voeg toe 10 mL PBS en centrifugeer de cellen bij 450 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de splenocytes in PBS.
   6. De cellen van de milt, met behulp van een hemocytometer tellen. Doorschakelen van een aliquoot gedeelte van 6 x 10⁶ cellen voor stroom cytometry analysemethodes, voor een evaluatie van de omvang van de zuivering in stap 1.3.9.
   7. Voor een totale CD3⁺ T-cel los van totale splenocytes, een commercieel beschikbare cel zuivering kit gebruiken. Isoleren van de milt T-cellen, volgens protocol van de fabrikant.
   8. Tellen de milt CD3⁺ T cellen geïsoleerd zoals beschreven in stap 1.3.7, met behulp van een hemocytometer. Het behouden van een aliquoot deel van 1 x 10⁶ T cellen voor stroom cytometry analyse.
      Opmerking: Het rendement op het gemiddelde van milt T cellen per donor muis geïsoleerd door magnetische scheiding de celbereiken van 1.3 x 10⁷ tot en met 2 x 10⁷ cellen.
   9. Bevestig het succes van de T-cel-isolatie door stroom cytometry. Voor een gedetailleerde beschrijving van de kleuring protocol, verlenen en stappen 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. 1 x 10⁶ splenocytes stappen 1.3.6 (vóór de scheiding van de magnetische cel) en 1.3.8 vlek (na scheiding van de magnetische cel) met de volgende antistoffen: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) en α-CD8α (53-6,7).
      2. Gebruik de resterende cellen uit stap 1.3.6 als een onbevlekt besturingselement en voor één kleuring met de respectieve antilichamen, instellen van de cytometer van de stroom.
      3. Vergelijk de samenstelling van de cel voor en na de scheiding van de magnetische cel.
         Opmerking: Een zuiverheid van ≥95% van CD45.2⁺CD3⁺ T cellen binnen de lymfocyt live poort moeten worden bereikt.
   10. Wash de T cellen 2 x met PBS (450 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C) en, ten slotte, resuspendeer de cellen in PBS oplossing, aanpassen van de concentratie van de cel tot 7 x 10⁶ cellen/mL. Houden van de cellen op ijs totdat de injectie.
   11. Injecteren alloreactive, milt T cellen (zie stap 1.3.10) bestraalde BALB/c muizen die eerder CD45.1⁺ T-cel-verarmd beenmergcellen ontvangen al (zie stap 1.2.22).
       1. Induceren verdoving door het plaatsen van de experimentele muis in een lekvrije kamer waarin het is blootgesteld aan de maximaal 4% Isofluraan totdat het haar bewustzijn verliest. Bevestig analgesie en verlies van bewustzijn door het verlies van de restarmen reflex testen en het daaropvolgende verlies van het pedaal trekken reflex.
       2. Injecteren van 0.7 x 10⁶ alloreactive CD3⁺ T cellen met behulp van een spuit van 1 mL uitgerust met een naald 30 G   (d.w.z., 100 µL van 7 x 10⁶ cellen/mL) met PBS oplossing (zie stap 1.3.10), intraveneus in de retrobulbaire ruimte voor de muizen, ertoe GVGH. Denominate deze muizen als de experimentele groep.
       3. Injecteren van een andere groep van muizen met 100 µL van PBS alleen intraveneus in de retrobulbaire ruimte, en deze groep als de controlegroep, later genaamd denominate "neen-T-cel-getransplanteerd (niet) muizen".

2. beoordeling van systemische GVGH

Opmerking: Deze procedure uitvoeren in een semi-steriele omgeving in een laboratoriumruimte licentie en uitgerust voor het afhandelen van levende muizen binnen het dier faciliteit.

1. Volg het klinische verloop van GVGH in afzonderlijke muizen; specifiek, beoordelen en de experimentele muizen 3 x per week voor de aanwezigheid van klinische symptomen van het GVGH, op basis van een scoresysteem hieronder beschreven en aangepast van een scoresysteem eerder ingestelde Cook et al.⁶score.
   1. Elke muis afzonderlijk wegen, het gewicht en het berekenen van verlies van het gewicht van de instantie van het thespecific met betrekking tot het lichaamsgewicht dat werd vastgesteld voor de aanvang van het experiment (overeenkomend met 100%) op dag 0 (stap 1.1.2). Score van een gewichtsverlies van minder dan 10% van het basisgewicht met rang 0, een verlies van het gewicht tussen de 10 tot 25 procent met graad 1 en een gewichtsverlies van meer dan 25 procent met graad 3.
   2. Score van het activiteitenniveau van elke muis, discriminerende muizen met een normale activiteitenniveau (score = 0) van muizen met een matig verminderde activiteitenniveau (score = 1) en muizen met stationaire gedrag tenzij ze extern gestimuleerd (score = 2).
   3. Score van de textuur van de vacht, waardoor het discrimineren van een normale, glanzend en onderhouden vacht (score = 0) van een matig gegolfde bont (score = 1) en de aanwezigheid van kale plekken (score = 2).
   4. Score van de huidtextuur, discrimineren van de normale huid (score = 0) van sporadische plekken van de huid (bijvoorbeeld op de staart en de poten) schalen (score = 1) en voor de hand liggende schalen en pijnlijke huid gebieden (score = 2).
   5. Het analyseren van de consistentie van secreted kruk breuken. Score kruk met een normale (d.w.z., harde consistentie) met cijfer 0, kruk met vervormbare en zachte ontlasting met rang 1 en ontlasting zonder enige consistentie en, vandaar, met ernstige diarree met cijfer 2.
   6. Kortom alle afzonderlijk scoorde parameters aan een maximale klinische score van 12 per muis.
2. Overwegen en evalueren van de criteria van het experiment als gevolg van het huidige niveau van de ernst van de ziekte van de individuele muis, overeenkomstig de geldende institutionele richtsnoeren ophouden en dierlijke protocol toegestaan.

3. beoordeling van intestinale GVGH

1. Scoren van GVGH-gerelateerde letsels door Mini endoscopie van de distale colorectal regio
   OPMERKING:Voer dit in een semisterile omgeving in een laboratoriumruimte licentie en uitgerust voor het afhandelen van levende muizen binnen het dier faciliteit. Gebruik een mini-Endoscopische werkstation dat is goedgekeurd voor het gebruik van kleine dieren.
   1. Bereid de Endoscopische apparaat door die betrekking hebben op de telescoop met (een diameter van 1.9 mm) en een lengte van 10 cm met de Endoscopische onderzoek schede. Reinigen en steriliseren van de endoscoop met water en ethanol.
   2. Ga op de computer, de verstelbare xenon lichtbron en de module van de camera en de focus instellen op een manier dat objecten dicht bij de lens een duidelijk beeld geven.
   3. De luchtpomp verbinden met de Endoscopische schede. Visualiseren van de luchtstroom, het uiteinde van de endoscoop duik in een bekerglas van glas gevuld met water. Regelen de luchtstroom door de afsluiter tussen de pomp en de Endoscopische schede aan te passen. Aanpassen aan een langzame, constante luchtstroom, gevolg door een paar voortdurend oplopende bubbels.
   4. Plaats een muis in een lekvrije kamer. Anesthesie veroorzaken bij inademing van maximaal 4% Isofluraan totdat de muis bewusteloos is. Analgesie en een afwezig staat van de reflexen bevestigen door het verlies van de restarmen reflex testen en het daaropvolgende verlies van het pedaal trekken reflex.
   5. Gebruik een passende veterinaire anesthesie machine overeenkomstig het dierlijke protocol gebruikt. De muis van de zaal overbrengen naar de werkruimte colonoscopie. Hier werken positie de narcose muis, met haar neus in de neuskegel (die is verbonden met het instrument van de verdoving), op een schone schede zodat de muis in een liggend is, geconfronteerd met de experimentator met haar achtervoeten.
   6. Om te handhaven verdoving tijdens de colonoscopie procedure, verminderen de Isofluraan concentratie tot ongeveer 2%. Volgen van de ademhaling en de respons op stimulatie tijdens de colonoscopie van de muis en de Isofluraan concentratie op de vaporizer aan te passen indien nodig. Dekking van de muis met zalf om te voorkomen dat het krijgen van droge ogen.
   7. Controle van de werkzaamheid van de narcose door te knijpen tussen de tenen van de muis. In het geval van afwezige reactiviteit, ga naar stap 3.1.8.
   8. Til de staart direct boven de hoofdmap van de staart met de ene hand en schuif voorzichtig de endoscoop, gepositioneerd in de andere hand, via de anus in de endeldarm.
   9. Terwijl de luchtstroom wordt opgeblazen de colorectale lumen, langzaam en zorgvuldig de endoscoop voorwaarts in aboral richting gaan.
   10. Plaats de endoscoop in het midden van het Colon lumen en deze positie handhaven om Minimaliseer contact met de Colon wand en te voorkomen krassen, diepere muur-gerelateerde verwondingen te maken (bijvoorbeeld, wat resulteert in bloeden), of zelfs muur perforatie (zie stap 3.1.17) . Deze stap controle door het permanent kijken naar de video-stream (dat wil zeggen, onder constante visualisatie van het Colon compartiment).
   11. Als ontlasting de weergave vernauwen, de endoscoop te verwijderen en het uitvoeren van een klysma door te rectally met maximaal 2 mL zoutoplossing, met behulp van een precisiepipet Pasteur zachte spoelen. Gebruik als weinig vloeistof mogelijk, om te voorkomen dat een onbedoelde verdunning van de ontlasting en andere secundaire gevolgen negatief beïnvloeden de kenmerken van de mucosal oppervlakte en, uiteindelijk, de scoren resultaten.
   12. Probeer regelmatig de endoscoop om bij te plaatsen een gedefinieerd (dat wil zeggen, verschillende) anatomische site binnen de distale dikke darm om te standaardiseren het scoren van Colon ontsteking en voor het optimaliseren van de vergelijkbaarheid van de resultaten tussen muizen en over experimenten te scoren.
       Opmerking: Normaal gesproken met de starre endoscoop, is een maximale diepte van 4 cm bereikbaar via de rectale route. Tussen 2 en 4 cm aborally, verandert de dikke darm regelmatig in een flexure die niet worden doorgegeven met de stijve colonoscope. Gebruik van de dubbelpunt regio distally grenzend aan de flexure als de standaard scoren plek.
   13. Start de video-stream opnemen en beginnen met het scoren van ontsteking.
   14. Evalueer de GVGH-gerelateerde ontsteking van de dikke darm door de parameters beschreven en afgebeeld in tabel 1 en Figuur 3te scoren.
       1. Verplaats de endoscoop op de vlek voorzichtig te scoren en lichtjes rug - en toekomen om te evalueren van de verschillende parameters.
       2. De parameter "translucentie", evenals de "kruk consistentie", door de positionering van de endoscoop in een bredere afstand ten opzichte van het Colon wand te beoordelen.
       3. Beoordeling van de parameters "granulariteit" en "vasculariteit" door de endoscoop positionering dicht bij de Colon muur. Voor deze taak moet u goed gedoseerd spanning zorgvuldig toepassen in het Colon muur met het uiteinde van de endoscoop.
   15. Na voltooiing van het proces scoren, stop de opname.
       Opmerking: Daarna, kan de opgenomen video clip worden gebruikt in totaal of gebruikt voor het genereren van representatieve beelden (bijvoorbeeld screenshots) van de mini-endoscopically beoordeelde criteria globaal bij te dragen tot Colon ontsteking.
   16. Verwijder voorzichtig de endoscoop.
   17. Staken Isofluraan expositie door de muis te hevelen naar een aparte kooi waarin het wordt blootgesteld aan de lucht. De muis warm met een rood-licht lamp en observeren van de muis totdat het herstelt van de verdoving en volledig bewustzijn herwint.
       Opmerking: Als gevolg van de inflatie op de lucht van de dikke darm tijdens de endoscopie, kan de abdominale regio van de muis verschijnen gepofte omhoog direct daarna. Terwijl dit normaal is en van voorbijgaande aard, kunnen langdurige tekenen van massale en zelfs progressieve inflatie van de buik en gebrek aan herstel van de muis wijzen op een onbedoelde perforatie van de dikke darm (in dit geval, de muis moet worden euthanized onmiddellijk).
   18. Op volledig herstel, plaatst u de muisaanwijzer weer in zijn respectieve kooi.
   19. Optionele benadering: het is ook mogelijk om weergave-geleide weefsel biopsieën. Voer de volgende stappen uit.
       Opmerking: De colonoscopie zal worden uitgevoerd op dezelfde manier zoals beschreven in stappen 3.1.1 - 3.1.18, met de volgende wijzigingen.
       1. In stap 3.1.1, gebruikt u een Endoscopische onderzoek schede met een ingebouwde kanaal werken, in plaats van een eenvoudig onderzoek schede zonder werkende kanalen, voor de dekking van de telescoop. Een biopsie pincet in het kanaal werken introduceren tot de tip net zichtbaar voor de endoscoop op het videoscherm is omdat hierdoor grotendeels onbedoelde schade aan de darm.
       2. Verder met stappen 3.1.2 - 3.1.11. Plaats de endoscoop in de dubbelpunt en duw het zorgvuldig doorsturen naar de plek van belang.
       3. Dienst de hulp van een tweede experimentator voor de taak van het nemen van biopsieën Colon weefsel. Vraag de tweede experimentator te navigeren het topje van de biopsie Tang aan de Colon regio van keuze door het indrukken van de verlostang binnen het kanaal werken langzaam naar voren totdat de kaken van de verlostang kunnen worden geopend. Bekijk de videostream voortdurend tijdens deze procedure tot een minimum beperken van het risico van de Colon muur verwonden.
       4. Een steekproef van Colon muur weefsel herstellen door zorgvuldig openen en sluiten van de kaken van de verlostang biopsie.
          Opmerking: Doe dit behoedzaam om te voorkomen dat de perforatie van de Colon muur. In het zeldzame geval van een Colon perforatie, onmiddellijk de getroffen muis te offeren door metingen overeenkomstig de institutionele richtsnoeren en onder het continue beheer van verdoving toe te passen.
       5. Trek terug en verwijder de gesloten tang uit het kanaal werken. Verwijder het specimen uit de klauwen van de biopsie verlostang door dompelen en zorgvuldig schudden de geopende verlostang in steriele PBS oplossing. Daarna, kies correcte opslagcondities voor het weefsel monster, overeenkomstig de geplande downstream analyses. Na ontsmetting met 70% ethanol, de verlostang kan opnieuw worden gebruikt voor verdere nemen van biopsieën.
       6. Na het nemen van biopsieën, verwijder de endoscoop en afwerking van de colonoscopie zoals beschreven in stappen 3.1.16 - 3.1.18.
2. Histopathologisch analyse
   1. Tussen dagen 26 en 30 na de bestraling X-ray, euthanaseren de muizen allo-HCT geadresseerde overeenkomstig de toepassing van institutionele richtsnoeren en autoriteiten. Anesthetize de muizen door inhalatie van 5% Isofluraan hiervoor. Doorgaan met de Isofluraan blootstelling voor 1 min na arrestatie ademhaling en bevestigen van euthanasie door cervicale dislocatie. Grondig ontsmetten de vacht en huid van de muis met 70% ethanol.
   2. Open de buikholte en de dikke darm te verwijderen. Het overbrengen in een petrischaal (met een diameter van 92 mm) met PBS.
   3. Vul een tip 5 mL dispenser met PBS. Met behulp van een verlostang Semken met een lengte van 13 cm en gekartelde gebogen tips, slip het distale deel van de dikke darm (ongeveer 5 mm) over het puntje van de dispenser-tip. Zorgvuldig herstellen van de dikke darm met de Tang aan het uiteinde van de dispenser en spoelen van de dikke darm met PBS door te drukken van de zuiger van de dispenser tip om te verwijderen van ontlasting uit de darm.
   4. Knip een Colon segment gelegen ongeveer 5 mm van de anus, met behulp van een scalpel.
   5. Corrigeer het specimen gereseceerd gut's nachts in 4,5% formaldehyde. Vóór het sluiten in paraffine, plaats het weefsel in een verticale positie.
   6. Knippen 3 µm Kruis secties van paraffine-ingebedde dubbelpunt weefsel en vlek met haematoxyline en eosine (HE), met behulp van kleuring standaardprotocollen.
   7. HE gebeitste kruissecties van weefselmonsters van de dikke darm voor te bereiden.
   8. Aangepast uit de scoren matrix gerapporteerd door Kaplan et al.¹², histopathologically score de inflammatoire activiteit semiquantitatively, met scores van 0-3: geen ontsteking (score = 0), milde ontsteking (score = 1), matige ontsteking (score = 2), en ernstige ontstekingen (score = 3).
      Opmerking: In het ideale geval gebruiken voor deze taak de expertise van een patholoog die wordt ervaren bij de evaluatie van lymfkliertest intestinale GVGH en verblind de aard van de experimentele en controlegroepen.

Representative Results

Het huidige protocol, met een beschrijving van de mini-Endoscopische evaluatie van intestinale GVGH-geassocieerde letsels van het distale dikke darm, is gevestigd en gevalideerd in muizen eerder onderworpen aan de systemische inductie van een ernstige acute GVGH model. In deze studie, gebruikten we een MHC klasse ik volledig modelsysteem in welke BALB/c muizen waren dodelijk bestraald verkeerde, gevolgd door transplantatie van allogene beenmerg T-cel-uitgeput en het beheer van GVGH-inducerende alloreactive C57BL/6 CD3⁺ T-lymfocyten. T-cel-verarmd beenmergcellen en milt T-cellen voor GVGH inductie werden gezuiverd door magnetische scheiding. De zuiverheid van de populaties van deze cel werd bepaald door stroom cytometry en representatieve resultaten van het zuiveringsproces worden weergegeven in Figuur 1, met een voldoende uitputting van T cellen van totale beenmergcellen en een consistente verrijking van milt afkomstige CD3⁺ T cellen vóór hun overdracht naar eerder bestraald muizen. De klinische cursus weergegeven in Figuur 2 demonstreert de reproducibly robuuste inductie van de klinische systemische GVGH fenotype bij allo-HCT in de aanwezigheid (WT, in het zwart) vs. afwezigheid (niet grijs) van alloreactive donor T lymfocyten. Het scoresysteem eerder gerapporteerd door Cooke et al. Hiermee geeft u een som kern waarin zes parameters worden beoordeeld en gesorteerd: lichamelijke gewicht, houding, activiteit, Pelsbereiderijen en bontwerkerijen structuur, en consistentie⁶kruk. Het besturingselement muizen ervaren slechts één, vroege voorkomende hoogtepunt van de klinische score, tussen dagen 5 en 10, dat werd ook waargenomen in T-cel-ontvangst muizen en daarom grotendeels te wijten aan de bestraling-geassocieerde systemische inflammatoire respons. Ongeacht, klinische scores van donor T-cel-ontvangst muizen is begonnen te stijgen eerder, toonde een hogere totale piek, alleen Transient daalde na aanvankelijk piek en, in wezen steeg vervolgens weer, voortdurend, over de resterende looptijd van de experiment. Deze resultaten zijn over het geheel genomen in overeenstemming met de interpretatie die T-cel-ontvangst muizen sterker tonen en meer progressieve tekenen van systemische GVGH vergeleken met geen muizen.

De donor T-lymfocyten-ontvangst allo-HCT muizen toonde verschillende tekenen van acute orgel-gerelateerde en systemische GVGH manifestaties, over het algemeen wat resulteert in hoge scores, terwijl de controle-muizen ontbrak matige tot ernstige affecties, vooral op latere tijdstippen. Symptomen van intestinale GVGH zijn echter ondervertegenwoordigd in de systemische GVGH scoring systeem, waar de enige beoordeeld gut-gerelateerde parameter is consistentie van de ontlasting. Zoals blijkt uit tabel 1, mini-endoscopically verifieerbare criteria waren vastgesteld, bedoeld specifiek voor de precieze omschrijving, scoren, en de sortering van intestinale GVGH-geassocieerde letsels, door aanpassing van de criteria eerder gemeld voor de evaluatie van syngeneic ulcerosa op de context van alloresponse gestuurde colitis⁹. Figuur 3 toont de typische voorbeelden voor elk afzonderlijk criterium, ter illustratie van de aard en omvang van intestinale GVGH-geassocieerde letsels, waardoor het visualiseren van de indeling matrix toegepast tijdens de mini-Endoscopische evaluatie van de distale dikke darm van GVGH-naar voren gebogen muizen op transplantatie van MHC klasse ik volledig verkeerde donor lymfocyten.

Figuur 4 A toont dat intestinale GVGH som score resultaten die zijn gebaseerd op de criteria omschreven in tabel 1 en weergegeven in Figuur 2 gemakkelijk in staat de experimentator stellen te discrimineren donor lymfocyt-ontvangst muizen met ernstige symptomen van intestinale ontsteking van controle muizen die in wezen verstoken van GVGH zijn. Voor het valideren van het mini-endoscopically op basis van de indeling systeem, werden histopathologisch studies uitgevoerd met behulp van een eerder gemelde microscopische indeling systeem¹². De gegevens in Figuur 4B bevestigen dat de dikke darm van muizen zwaar door een GVGH-gerelateerde ontsteking getroffen, zoals blijkt uit de hoge colonoscopic som scores, weergave ook sterke histopathologisch tekenen van ontsteking, gegeven een histopathologisch score van ≥2 postmortem optellen. In tegenstelling, dubbelpunt weefsels van controle muizen nee weergeven (score 0) of, bij de meeste, mild (score 1) histopathologisch tekenen van ontsteking, in overeenstemming met de virtuele afwezigheid van mini-endoscopically opspoorbaar tekenen van colitis. Bovendien, zoals weergegeven in Figuur 4C, D, correlatie studies tussen mini-endoscopically en histopathologically beoordeeld ulcerosa activiteit en systemische GVGH scores werden uitgevoerd. Nog belangrijker is, deze studies aangetoond dat mini-endoscopically vastberaden som scores van ≤3 op betrouwbare wijze de afwezigheid van Midden-tot-hogere rang (dat wil zeggen, ≥2) intestinale GVGH-geassocieerde Colon ontsteking scores verkregen histopathologisch sortering voorspellen. Tot slot, de ernst van endoscopically beoordeeld intestinale GVGH toont een correlatie met de systemische GVGH-activiteit.

Figuur 1 : Flow cytometrische kwaliteitsbeoordeling van magnetisch gezuiverde T-cel-verarmd beenmergcellen en allogene milt CD3⁺ T cellen. (A) uitputting van CD90.2⁺ beenmergcellen bereikt door magnetische scheiding, met behulp van een commercieel beschikbare zuivering kit. De zuiverheid van T-cel-verarmd beenmergcellen werd bepaald door stroom cytometry, door cellen voorafgaand aan en na T-cel depletie met anti-CD45.1 en anti-CD3 kleuring. Resultaten van een representatieve experiment worden weergegeven. (B) milt T cellen werden magnetisch gezuiverd is, wat een verkrijgbare zuivering kit in dienst. De zuiverheid werd bepaald door stroom cytometry, vergelijking van de frequenties van CD45.2 en CD3 costaining van monsters afkomstig van vóór en na T cel isolatie. Resultaten van een representatieve experiment worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Klinische cursus van GVGH, met een MHC klasse ik volledig verkeerde model. Om acute GVGH, waren BALB/c muizen hele lichaam bestraald op dag 0. De muizen ontvangen T-cel-verarmd beenmergcellen 24 h later (d1). Op dag 2, de muizen werden ingespoten met allogene milt CD3⁺ T cellen (wild-type [WT]; n = 9). Als een besturingselement ontvingen sommige muizen T-cel-verarmd beenmerg alleen (niet; n = 9). De muizen waren specifiek beoordeeld op drie keer per week voor de aanwezigheid en ernst van de klinische symptomen van GVGH. De weergegeven gegevens vertegenwoordigen gemiddelden ± SEM van de klinische scores verkregen afzonderlijke muizen van de groep aangegeven behandeling uit twee representatieve experimenten. De gegevens werden geanalyseerd door two-way ANOVA, gevolgd door Bonferroni van meerdere vergelijkingen post-test. p < 0,0001 werd beschouwd als belangrijke. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Vertegenwoordiger beelden ter illustratie sorteren voorbeelden ten grondslag liggen aan de scoren matrix van de wijzigingen van de intestinale GVGH-gerelateerde dubbelpunt beoordeeld door een mini-Endoscopische evaluatie van de dubbele punten van live, allo-HCT-testgroep muizen. Als aanvulling op en illustreren de gedetailleerde beschrijving van de gebruikte scoren sortering en systeem in tabel 1, representatieve mini-Endoscopische beelden van de geëvalueerde prioriteitsniveaus (sortering) voor alle parameters individueel in de dikke darm van verdoofd, levende muizen ondergaan allo-HCT tussen 26 en 30 vóór zoals beschreven in Figuur 1 dagen worden hier weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Mini-Endoscopische scoren en de sortering van intestinale GVGH-gerelateerde ontsteking van de dikke darm, betrouwbaar het voorspellen van de aanwezigheid van hoogwaardigere colitis beoordeeld door histopathologisch scoren. (A) tussen dagen 26 en 29 na de inductie van GVGH zoals beschreven in Figuur 1, de manifestatie van intestinale GVGH werd beoordeeld door Mini endoscopie in live, narcose muizen. Colon aanpassingen werden gescoord en ingedeeld volgens het systeem van het scoren en sorteren afgebeeld in tabel 1 en Figuur 2. Representatieve Endoscopische beelden van controle (geen T-cel; niet) en wild-type (WT), T-cel-ontvangst muizen en de mini-endoscopically beoordeelde score (boven) worden weergegeven. (B) de muizen werden opgeofferd 12u na de mini-Endoscopische evaluatie, en het distale deel van de dikke darm was verwerkt en histopathologically beoordeeld. De inflammatoire activiteit van haematoxyline en eosine-gebeitste cross-secties van de distale dubbelpunt werd ingedeeld. Vertegenwoordiger haematoxyline en eosine-gebeitste cross secties van de distale dikke darm geen T-cel - en WT T-cel-ontvangst allo-HCT-testgroep muizen en de bijbehorende histologie scores worden weergegeven. De gegevens in de panelen A en B werden geanalyseerd door de Student t-test en worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. ***p < 0,0001 werd beschouwd als een belangrijke. WT: n = 15; Niet: n = 15. De gegevens vertegenwoordigen gegroepeerde gegevens uit vier afzonderlijke experimenten. (C) onderlinge afhankelijkheid van de colonoscopie scoren en histologische scoren. De gegevens worden weergegeven als vak percelen. Elke vlek geeft de mediaan (zwarte lijn binnen elk vak), het bereik van de gegevens (min max) en kwartielen (gebieden van elk vak). WT: n = 15; Niet: n = 15. De gegevens vertegenwoordigen gegroepeerde gegevens uit vier afzonderlijke experimenten. (D) correlatie tussen colonoscopie scoren en klinische scoren. Zowel controle als wild-type T-cel-ontvangst muizen zijn opgenomen in de analyse van de correlatie. De ononderbroken lijn vertegenwoordigt een lineaire regressielijn. Spearman correlatiecoëfficiënt (r-waarde) en p-waarde worden weergegeven. WT: n = 12; Niet: n = 13. De gegevens vertegenwoordigen gegroepeerde gegevens uit drie afzonderlijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Score	0	1	2	3
Doorschijnendheid van het Colon muur	Extra-intestinale, innerlijke organen (bijvoorbeeld milt) grondig zichtbaar	Discrete vermindering van de zichtbaarheid van extra-intestinale organen als gevolg van milde dekking van de Colon muur	Gematigde vermindering van de zichtbaarheid van extra-intestinale organen als gevolg van aanzienlijke dekking van de Colon muur	Gebrek aan de zichtbaarheid van extra-intestinale organen, dat wil zeggen niet-transparante Colon muur
Granulariteit	Gladde, onaangetast mucosal oppervlakte uiterlijk; Colon crypt patroon zichtbaar	Discrete opruwen en geplaveide verschijning van de mucosal oppervlakte	Matige opruwen en geplaveide verschijning van de mucosal oppervlakte	Ernstige opruwen en geplaveide uiterlijk van de mucosal oppervlakte; kussen-achtige uiterlijk van de mucosa
Vasculariteit	Ongewijzigde vasculaire patroon worden getoond van de communicerende netwerk van grote en kleine vaartuigen	Discrete wijzigingen van de vasculaire patroon; vaartuig patroon lijkt te rafelen	Sommige vaartuigen zijn onzichtbaar; discontinue vaartuig netwerk	Neem contact op met geïnduceerde verbloeden; stip-achtig patroon van de vaartuigen
Consistentie van de ontlasting	Normaal; kruk is hard; fijne draden van slijm tussen ontlasting en Colon muur waarneembaar	Ontlasting wordt nog steeds gevormd maar kan bevatten ragged edges; met het uiteinde van de endoscoop vervormbare	Kruk is zacht en unshaped kruk is zichtbaar meer schijnt (hoger watergehalte)	Kruk is losse, liquide zijn; waterige diarree. Ontlasting kan willekeurig worden gespreid over de mucosal oppervlakte van de dikke darm

Tabel 1: Mini-Endoscopische scoren en de sortering van de matrix van intestinale GVGH-gerelateerde letsels in de dikke darm van levende muizen van allo-HCT-testgroep. Wijzigingen van de endoluminal en Transmurale morfologie van de dikke darm bij allo-HCT voorbehandeld muizen werden beoordeeld door een colonoscopie van het rectum en de distale dubbele punt van narcose, levende muizen, met behulp van een lymfkliertest mini endoscopie systeem. Colon laesies zijn ingedeeld met behulp van de Endoscopische scoresysteem (gemodificeerde lymfkliertest Endoscopische index van colitis Ernst [MEICS]), die wordt afgeleid uit de originele MEICS scoring systeem gemeld door Becker et al.⁹ en aangepast aan de context van Allo-HCT. De distale dubbele punt wordt visueel beoordeeld voor de aanwezigheid en omvang van de volgende vier parameters: 1. de lichtdoorlatendheid van Endoscopische licht (translucentie) door de Colon darm wand als verdikking van de muur; 2. de mucosal oppervlakte weergeven een geplaveide verschijning (granulariteit) van de endoluminal-georiënteerde mucosal oppervlakte; 3. een gewijzigde vascularisatie patroon (vasculariteit); 4. endoscopically beoordeeld kruk uiterlijk ter plaatse (de consistentie van de ontlasting). Elke parameter is georkestreerd van 0 (geen borden) tot 3 (meest ernstige fenotype), toe te voegen tot een score van de maximale som van 12 per muis.

Discussion

Het protocol beschrijft de methodologie van inductie en mini-Endoscopische beoordeling van het Colon fenotype waargenomen in de loop van intestinale GVGH. Het serveert het bredere doel van het toelaten van wetenschappers die het bestuderen van intestinale GVGH lengterichting en noninvasively in de gehele ziekte loop (dat wil zeggen, vanaf het begin van het Colon manifestatie en de progressie tot maximale ziekte-activiteit).

Er zijn echter enkele kritische stappen en belangrijke beperkingen die inherent zijn aan de gepresenteerde methoden die de experimentator zich bewust zijn van moet vóór toepassing van de technologieën in de respectieve wetenschappelijke context. Ten eerste, hoewel we de mini-Endoscopische beoordeling van intestinale GVGH-gerelateerde Colon laesies met succes in een kleine comptabiliteit-mismatched model systeem^{11 gebruikt hebben}, het verstrekte protocol hier is momenteel uitsluitend van toepassing op MHC klasse I volledig niet-overeenkomende acute GVGH modellen. Terwijl de MHC klasse ik volledig verkeerde GVGH model gemeenschappelijk en gebruikte^{5 is}, het is reeds lang gevestigd dat de kenmerken van GVGH manifestatie sterk afhankelijk van de gebruikte muis substrains zijn omdat dit sterk heeft gevolgen, bijvoorbeeld, de gevoeligheid voor bestraling. Bovendien kan de bron van de experimentele muis met, bijvoorbeeld, een variërende samenstelling van intestinale microbiota en gebruikte aantal overgebrachte allogene T-cellen de kinetiek en de dynamiek van de intestinale GVGH manifestatie¹²kritisch beïnvloeden. Vandaar, een cruciale stap is om zorgvuldig te testen en valideren van de aangegeven maatregelen om hun vermogen om met succes het induceren van intestinale GVGH zoals.

Met betrekking tot de succesvolle implementatie van de live mini-Endoscopische beoordeling van acute intestinale GVGH, wij willen benadrukken dat, tijdens het verwerken van de endoscoop is eenvoudig, dat kan zij eisen wat opleiding, tot een minimum beperken van het risico van het ervaren van de meest gevreesde complicatie (dat wil zeggen, aan de darmwand perforate met het starre instrument in combinatie met de noodzaak om lucht-opblazen van de dikke darm). Als gevolg van een grotere ontsteking geïnduceerde kwetsbaarheid en verminderde flexibiliteit van het Colon weefsel, misschien de integriteit van de muur gut wel meer risico tijdens de postradiation herstelfase (i.e.,until dag 10) en op de volledige manifestatie van intestinale GVGH-gerelateerde colitis (dat wil zeggen, na ongeveer dag 25). Nog belangrijker is, echter, we niet in acht genomen aanzienlijk verhoogde complicatie tarieven afhankelijk van het tijdstip van endoscopie, zolang de endoscoop voorzichtig onder voldoende zichtbaarheid is gevorderd. In tegenstelling, we geïdentificeerd suboptimaal drug dosering om een risicofactor aangezien een onvoldoende diepte van de verdoving leiden het voorkomen van ongewenste lichaamsbewegingen van de experimentele muis tot kan en opeenvolgend, Colon muur perforatie gebeurtenissen. Ten tweede, de meest kritische stap tijdens het scoren vertegenwoordigt beperkingen in deze zaak als gevolg van de ongewenste aanwezigheid van vaste stof of vloeistof (bijvoorbeeld diarree) ontlasting in de darm lumen naarmate de experimentator de endoscoop in de scoringspositie. In deze situatie wordt de colorectale regio spoelen met zoutoplossing met behulp van een flexibel plastic pipet vaak vereist. Aangezien deze procedure in het gevaar zou kunnen brengen, de scoren nauwkeurigheid en specificiteit van diverse parameters (bijvoorbeeld kruk consistentie), moet deze waarschuwing zorgvuldig echter rekening gehouden bij het scoren.

Er zijn verschillende beperkingen beperken de interpretatie en de conclusies uit deze endoscopische benadering. Eerst, inherent is aan een methodologie die met behulp van een starre endoscoop via de rectale route, evaluaties zijn beperkt tot de laatste 3-4 cm van het maag-darmkanaal (dat wil zeggen, het rectum, en het distale colon). Daarom, GVGH-geassocieerde genegenheid van de proximale dikke darm en zelfs de dunne darm worden standaard uitgesloten van de evaluatie, die aangeeft dat de wetenschappelijke vragen zich te concentreren op de kleine intestinale fenotype van GVGH niet van deze aanpak profiteren zal. Ten tweede, hoewel de ontsteking is één van de hallmark morfologische kenmerken van intestinale GVGH, aanvullende kenmerken, zoals een verhoogde apoptosis tarief van de intestinale epitheliale cellen en een verlies van de intestinale crypt-architectuur, worden vaak gevonden en opgenomen in de histopathologische workflow onderliggende intestinale GVGH scoren en de sortering door pathologen in allo-HCT patiënten. Hier, we restrictedly gecorreleerd de mini-endoscopically beoordeelde intestinale GVGH scores met histopathologically beoordeelde tekenen van ontsteking. Nemen van deze aanpak, kwamen we tot de conclusie dat Colon ontsteking boven een bepaalde drempel in het colonoscopic scoren is betrouwbaar het voorspellen van de aanwezigheid van matige tot hoge rang ontsteking, zoals beoordeeld door histopathologisch postmortem analyse. Toekomstige studies moeten echter onderzoeken hoe, bijvoorbeeld, histopathologically beoordeelde apoptosis tarieven betrekking hebben op de mini-Endoscopische totale som scores of om, bijvoorbeeld, een van de vier afzonderlijke parameters ingebed de som-score. Ten derde, terwijl de muizen die lijden aan histopathologically matig-te hoge-grade GVGH kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door de Endoscopische scoren aanpak, muizen met meer subtiele tekenen van darmontstekingen kunnen worden gemist door de beschreven benadering, gezien het feit dat histopathologisch scoren bleek de aanwezigheid van lichte tekenen van ontsteking in de groep van niet muizen ondergaan allo-HCT alleen, zonder de transplantatie van alloreactive donor lymfocyten. Biologisch, wellicht deze bevinding haalbaar, aangezien niet muizen hebben zijn allotransplanted, en minimale colitis inderdaad met de aanwezigheid van lage niveaus van GVGH als gevolg van een onvolledige verwijdering van T-cellen uit het beenmerg cel afvalfractie of de reconstructie van overeen kan alloreactive T cellen uit het beenmerg na verloop van tijd. Toekomstige studies moeten aanpakken van deze kwesties meer in detail. Ten vierde, formeel, dit protocol is gericht op volledig gevestigde intestinale GVGH-geassocieerde colitis. Echter, zoals is aangetoond en eerder gepubliceerd, het begin van colitis rond dag 15 endoscopically kan worden opgespoord en¹¹quantitated. Hier, kunnen GVGH-naar voren gebogen muizen duidelijk worden onderscheiden van niet muizen waarin het Colon fenotype misschien wel uitsluitend toe te schrijven aan de resterende borden van de bestraling-geïnduceerde weefselschade of, liever gezegd, mirror de mucosal herstel reactie na bestraling¹¹. Toekomstige studies moeten echter gericht zijn gedetailleerde histopathologische analyses van GVGH-naar voren gebogen muizen in vergelijking met controle muizen op vroegere tijdstippen te correleren Endoscopische evaluaties.

Ten slotte, is een interessante, nuttige toepassing van de add-on van de Endoscopische scoring van intestinale GVGH het gebruik van de Endoscopische werken kanaal om een geminimaliseerde biopsie pincet met de anatomische structuur van keuze in de dikke darm. Deze functie biedt, als een soort van ingebouwde-in-optie, de mogelijkheid om beeld-geleide weefsel biopsieën die verder kunnen worden geanalyseerd door een reeks van downstream technieken zoals histopathologisch onderzoek, immunofluorescentie kleuring en real-time PCR-analyses van genen van belang. Toekomstige studies moeten echter formeel nagaan, bijvoorbeeld histopathologisch scoren en de sortering van endoscopically genomen biopsieën gelijkwaardig aan histopathologisch resultaten op basis van conventioneel genomen monsters zijn (d.w.z., van euthanized muizen).

Over het geheel genomen met dit protocol dat de inductie en haar mini-Endoscopische evaluatie van intestinale GVGH beschrijven, bieden wij een methodologie om te beoordelen, score en rang van intestinale GVGH in een relevante lymfkliertest GVGH modelsysteem van allo-HCT. De Endoscopische beoordeling kan worden herhaald in de dezelfde muis op meerdere tijdstippen na verloop van tijd, eliminerend de behoefte om te euthanaseren van muizen om te beoordelen sequentieel intestinale GVGH-geassocieerde weefsel pathologie (bijvoorbeeld in een therapeutische setting). De mini-Endoscopische scoren resultaten bleek te zijn vergelijkbaar met resultaten verkregen door de histopathologische beoordeling van intestinale ontsteking in de dikke darm en gecorreleerd met systemische GVGH activiteit. Deze procedure kan bovendien worden gecombineerd met weergave-geleide biopsieën via het kanaal van de werken van de endoscoop. Uiteindelijk, toekomstige studies hebben echter om te beoordelen hoe ver histopathologically vastberaden morfologische kenmerken dan ontsteking, die vaak worden aangetroffen in de intestinale GVGH geteisterde laesies, betrekking hebben op de resultaten van dit Mini-Endoscopische beoordeling en aanpak te scoren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator	Gamma-Service Meical GmbH
Phosphate-buffered saline (PBS )	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips)	Fine Science Tools	11009-13
Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm)	Fine Science Tools	14090-09
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Hypodermic needle (26 G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
1 mL syring	B. Braun Melsungen AG	9166017V
50 mL tube	Sarstedt Ag & Co.KG	62,547,254
Cell strainer with a 40 µm mesh screen	BD Falcon	352340
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	11209	ingredient of ACK lysing buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingredient of ACK lysing buffer
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Merck KGaA	1,048,540,500	ingredient of ACK lysing buffer
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-049-101	magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells
Pan T Cell Isolation Kit II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	130-095-130	magnet cell separation to isolate splenic T cells
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731)	Biolegend	109822
Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645)	Biolegend	100214
FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691)	Biolegend	100406
PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168)	Biolegend	110730
APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753)	Biolegend	100714
Filtrated bovine serum	Pan Biotec	P40-47500	ingredient of FACS buffer
96-well polystyrene V-bottom plates	Greiner Bio-One	651201
Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL)	Falcon	352052
BD LSRFortessa II flow cytometer	BD Bioscience Co.
Insulin syringe with sterile interior (30 G)	BD	324826
Oxy Vet Oxymat 3	Eickemeyer		oxygen concentrator  for anesthesia
NarkoVet	Eickemeyer	213062
Plexiglass chamber	Eickemeyer	214620
Straight Forward Telescope	KARL STORZ SE &Co KG	64301 AA	part of the experimental setup for colonoscopy
Protection and Examination Sheath	KARL STORZ SE &Co KG	61029 C	part of the experimental setup for colonoscopy
Examination Sheath with working channel	KARL STORZ SE &Co KG	61029 D	part of the experimental setup for colonoscopy
Biopsy Forceps	KARL STORZ SE &Co KG	61071 ZJ	part of the experimental setup for colonoscopy
175 Watt SCB XenonLight Source	KARL STORZ SE &Co KG	20132120	part of the experimental setup for colonoscopy
Fiber Optic Light Cable	KARL STORZ SE &Co KG	495 NL	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 S3 Camera Head	KARL STORZ SE &Co KG	22220030	part of the experimental setup for colonoscopy
Image 1 SCB Camera Control Unit	KARL STORZ SE &Co KG	22200020	part of the experimental setup for colonoscopy
LCD monitor	Olympus	OEV181H	part of the experimental setup for colonoscopy
Forane / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Formaldehyde solution 37 %	Carl Roth GmbH & Co.KG	7398.1
5.0 mL Dispenser tip	Eppendorf AG	30089456