Summary
Этот протокол использует пятно свободный подход для визуализации и изолировать клеток Пуркинье свежемороженые ткани от мозжечка человека посмертные через лазерный захвата microdissection. Цель настоящего Протокола заключается в том, для создания достаточного количества качественных РНК РНК последовательности.
Abstract
Лазерная захвата microdissection (LCM) является выгодным инструментом, который позволяет для коллекции обнаружения и/или фенотипически соответствующих ячеек или регионов из гетерогенных тканей. Захваченные продукт может быть использован в различных молекулярных методов для белков, ДНК или РНК изоляции. Однако сохранение РНК из ткани посмертных человеческого мозга является особенно сложным. Методы стандартных визуализации для LCM требуют гистологического или иммуногистохимическое окрашивание процедур, которые может еще больше ухудшить РНК. Таким образом мы разработали нержавеющей протокол для визуализации в LCM с цель сохранения целостности РНК в ткани мозга человека post-mortem. Клетки Пуркинье мозжечка является хорошим кандидатом для нержавеющей визуализации, благодаря его размер и расположение характерной. Коры мозжечка имеет различные слои, которые отличаются в плотность клеток, что делает их хорошим архетип для идентификации под большим увеличением микроскопии. Клетки Пуркинье являются крупные нейроны, расположенный между гранул слоя клеток, который плотно сотовой сети мелких нейронов, и молекулярный слой, который редкий в клетки тела. Из-за этой архитектуры целесообразно использование нержавеющей визуализации. Подойдет также другие органа или ячейки системы, которые имитируют этот фенотип. Нержавеющая протокол призван исправить свежемороженые ткани с этанолом и удаление липидов с ксилол для улучшения визуализации морфологических под большим увеличением световой микроскопии. Этот протокол не учитывает другие методы фиксации и разработан специально для образцов тканей, свежемороженая, захвачен с помощью ультрафиолетового (УФ)-LCM системы. Здесь мы представляем полный протокол для разрезания и фиксации свежий замороженные посмертные тканей мозжечка человека и Очистка РНК из клеток Пуркинье, изолированные, УФ-НОК, при сохранении качества РНК для последующего РНК последовательности. В наших руках этот протокол производит исключительным уровнем сотовой визуализации без необходимости для окрашивания реагентов и урожаи РНК с большим числом целостности РНК (≥8), необходимые для профилирования транскрипционный анализ экспериментов.
Introduction
Лазерная захвата microdissection (LCM) является ценный исследовательский инструмент, который позволяет разделение патологически соответствующих клеток для последующей оценки молекулярно приводом. Использование молекулярного анализа образцов этих разнородных тканей и корреляции с патологическим и клинических данных является необходимым шагом в оценке трансляционная значение биологических исследований1. При анализе данных выражение гена РНК, использование разделов замороженные ткани очень рекомендуется, так как она позволяет за отличное качество РНК, а также максимальным количеством2. Хорошо известно, что высокое качество и количество РНК необходимы для значимых данных от РНК последовательности3. Однако при использовании РНК из ткани свежий замороженные посмертные для LCM, РНК деградации является серьезной проблемой, как это происходит сразу же после смерти и его степени опосредовано различные факторы, связанные с ткани коллекции метод4,5 . Кроме того РНК деградации усугубляется, когда методы окраски необходимо признать гистологических детали и идентификации клетки. Специализированных пятная методы, такие как гематоксилином и эозином, Ниссль пятно, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии полезны в дифференциации клеток от окружающих стромы, но было показано, снизить РНК и изменить выражение Стенограмма 6профилей. Таким образом наша лаборатория создала нержавеющей протокол, специально предназначенных для сохранения РНК человека мозжечка посмертные для целей РНК последовательности после изоляции LCM Пуркинье нейронов.
В обработке свежий замороженные ткани для LCM, метод фиксации переменно может повлиять на целостность РНК и тканей. Формалин фиксации стандартный морфологический сохранения, но причины cross-linking который может фрагмент РНК и мешать амплификации РНК7. Фиксация этанол является лучшей альтернативой для изоляции РНК, как это коагуляционное фиксатором, который не побудить сшивки1. Для лучшей визуализации тканей морфологии, ксилол является лучшим выбором, как она удаляет липиды из ткани. Однако существуют известные ограничения при использовании ксилола в НОК, как ткани могут высохнуть и стать хрупкими вызывая ткани фрагментации после лазерной захвата7. Ксилол также летучих токсин и должно быть правильно обработаны в зонта. Тем не менее ксилол было показано для улучшения визуализации тканей, сохраняя при этом целостность РНК8. Таким образом наш протокол центров вокруг 70% этанол фиксации и дегидратации этанола, следуют ксилол инкубации для морфологических ясность.
Важно обратить внимание на различные виды microdissection лазерных систем, как они показали отличаются в скорости, точности и качества РНК. Инфракрасный (ИК) лазерный захватить microdissection и ультрафиолетового (УФ) Лазерные Микролучевой microdissection системы были оба романа LCM платформ, которые почти одновременно появились8. IR-LCM система использует «контактной системы» с помощью прозрачная пленка из термопластичного помещены непосредственно на участке ткани, и клетки интереса выборочно придерживаться фильм сосредоточены импульсы от ИК-лазер. Кроме того система УФ-НОК является «система-контакт», whereby сфокусированного лазерного пучка порезы от клетки или регионы интереса в ткани; в зависимости от конфигурации в двух имеющихся в настоящее время коммерческих платформ, использующих либо прямой или инвертированный микроскоп дизайн ткани приобретается в коллекции устройство по лазерно индуцированным давления волны, что катапульты против силы тяжести или ткани собранные под действием силы тяжести, соответственно. Значительные преимущества УФ-LCM системы включают в себя быстрее клеток приобретения, свободной от загрязнения коллекции с бесконтактным подхода и более точного рассечение из-за гораздо меньшие лазерный луч диаметром9. Этот протокол был разработан специально для системы УФ-LCM и не тестировался в системе ИК-НОК. В конструкции системы либо УФ-НОК когда накопления клеток в коллекции колпачок, использование coverslip, улучшает сотовых ясность при микроскопии не подходит, как клетки не сможет вступить в коллекции Кап. Таким образом чтобы повысить визуализации тканей, мы протестировали использование непрозрачной коллекции шапки, которые призваны выступать в качестве coverslip для микроскопических визуализации в системах УФ-НОК, против жидкости заполнены коллекции шапки. Колпачков жидкости заполнены коллекции может быть сложным, как жидкость подлежит испарения и должны быть заменены часто во время работы в Микроскоп. Время становится важным фактором стабильности РНК, как захваченных ткани растворяет сразу7.
Наша лаборатория изучает посмертных neuropathologic изменения в мозжечке больных с необходимым тремор (ET) и смежных нейродегенеративных расстройств мозжечка. Мы продемонстрировали морфологических изменений, сосредоточены на клетки Пуркинье, которые отличают ET дела против контроля, в том числе уменьшение количества клеток Пуркинье, увеличение дендритных регрессии и разнообразные аксональное изменений, ведущих нас постулат что Пуркинье дегенерации клеток является основной функцией биологических ET патогенеза10,11,12,13. Транскрипционный анализ профиля используется во многих неврологических заболеваний исследовать основные молекулярные основы дегенеративных клеточных изменений. Однако транскрипционный анализ профилей из гетерогенных образцов, таких как ткани областях мозга, могут действенно маска выражение низкой изобилие стенограммы и/или уменьшить обнаружения молекулярных изменений, которые происходят только в небольшой численностью населения пострадавших клеток, таких как клетки Пуркинье в коре мозжечка. Например клетки Пуркинье значительно превосходили клетками обильные гранул в коре мозжечка, приблизительно в избытке; Таким образом чтобы эффективно целевой их транскриптом требует конкретных изоляции этих нейронов. Коры мозжечка, разделенное на различные слои, которые отличаются в ячейке плотность и размер ячейки. Эта Сотовая архитектура идеально подходит для визуализации в образец ткани, свежемороженая без красителя содержащих окрашивание реагентов. В теории, этот протокол может также применяться к другим типам ткани, которые имеют аналогичные отличительные ткани Организации.
Этот протокол был разработан для работы специально для визуализации клеток Пуркинье в мозжечок человека посмертные. Для фиксации, окрашивание визуализации и РНК сохранение многих видов тканей для целей из обоих ИК - и УФ-LCM существуют многочисленные протоколы. При созерцая экспериментальный дизайн для УФ-НОК, лиц следует адаптировать их протокол для наилучшего нужд и потребностей, начиная и заканчивая материалы. Здесь мы объединяем многие аспекты различных протоколов LCM, чтобы предоставить метод расширения для визуализации клеток Пуркинье трупа человека мозжечка без необходимости краски, содержащие окрашивание реагентов для подготовки высококачественных РНК транскриптом последовательности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все человеческие образцы, используемые в настоящем протоколе были получены с осознанного согласия и были одобрены внутреннего обзора (КИБ) при Колумбийском университете, Йельском университете.
Примечание: Полностью этот протокол должен следовать строгим РНК, обработка руководящие принципы, whereby перчатке всегда используется, все поверхности очищаются с РНКазы обеззараживатель и все рабочие материалы являются РНК/ДНК/нуклеиназы бесплатно.
1. Проверьте целостность РНК ткани до начала LCM
Примечание: Тестирование качества РНК может быть сделано многими методами. Убедитесь, что РНК от всей секции тестируется для обеспечения репрезентативного числа целостности РНК (Рин) для образца.
- Тщательно выберите образцы тканей для включения, которые вписываются в параметре экспериментального дизайна. Если резки на криостат, перейти к шагу 1.2. Если нет, то соответственно обрабатывать ткани и перейти к шагу 1.11.
-
Получите два контейнеров сухого льда. Размер будет зависеть количество выборок.
- В первый контейнер сухого льда место пустым, обозначенные 2-мл пробирку с кодом ткани.
Примечание: 10 минут для трубок для замораживания. Трубы должны быть заморожены до размещения на ткани в них; в противном случае ткани будет таять на поверхности трубы. - В второй контейнер сухого льда место ткани из морозильной камеры-80 ° C, которая требует проверки РНК.
- В первый контейнер сухого льда место пустым, обозначенные 2-мл пробирку с кодом ткани.
- Очистите криостата. Разделе 4.7 шаг подробная процедура очистки.
- Удаление ткани из сухого льда и вырезать небольшой участок ткани с лезвием бритвы РНКазы дезактивацию. Ткань должна быть около 1 см x 1 см в размер.
- Место примерно 3 мм высокий Курган оптимального раскроя температуры (OCT) соединение на криостата «Чак» и позволяют ему частично заморозить. Затем, место ткани поверх OCT — не толкать в OCT, просто дайте ему отдохнуть на верхней части.
- После октября твердеет, место патрона с подключенного ткани в криостата резки руку и позицию перед криостата лезвие.
- Трим 30 мкм разделы пока даже ткани.
- Вырежьте 300 мкм ткани и место в замороженных 2-мл пробирку. Установите трубку обратно в сухой лед.
- Удаление ткани из «Чак» и место обратно в сухого льда до готовности положить прочь.
- Повторите шаги с 1,4-1,9 для всех тканей.
- После того, как все образцы выполнены, извлечь РНК с помощью РНК добыча комплект предоставляется (Таблица материалов #15). В РНК добыча комплект предоставляется подробный протокол. Следуйте всем инструкциям, включая необязательный шаг для сухих Мембранная трубка коллекции и необязательный шаг для DNase пищеварения (Таблица материалов #16).
- Проверьте целостность извлеченные РНК посредством оценки качества bioanalyzer14.
2. подготовить до начала секционирование для LCM
-
Очистите слайды Держатели перед каждой ткани секционирование для LCM. Выполните процедуру очистки день перед использованием, чтобы позволить полного высыхания на ночь.
Примечание: слайд Держатели используются для фиксации секции ткани в этаноле и очистки в ксилоле.- Сдвиньте держатель процедура очистки: промыть РНКазы дезинфектор следуют диэтиловым pyrocarbonate лечение (DEPC) воды. Разрешить для высыхания на ночь вниз на РНК/ДНК/нуклеиназы свободной поверхности, избегая любой пыли или других обсемененности.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: DEPC высокотоксичных и следует обрабатывать и обезвреженных EH & S протоколу стандартных опасных химических веществ.
- Сдвиньте держатель процедура очистки: промыть РНКазы дезинфектор следуют диэтиловым pyrocarbonate лечение (DEPC) воды. Разрешить для высыхания на ночь вниз на РНК/ДНК/нуклеиназы свободной поверхности, избегая любой пыли или других обсемененности.
- Чистой щетки для разрезания с РНКазы decontaminator и позволяют для высыхания на ночь. Избегайте любой пыли и других загрязнений.
- Место мембраны слайды под УФ на 30 минут при комнатной температуре. Сделать не подвергайте слайды для УФ более чем 1-2 дня до использовать. Это улучшает связывание ткани на слайд мембраны.
Примечание: 2.3 шаг может сочетаться с шаг 4, который позволяет для слайда УФ лечение происходит в тот же день как секущей ткани (см. шаг 4.4).
3. Подготовьте фиксации решений с РНКазы свободной воды и этанола высокого качества
Примечание: Все решения готовятся свежие для каждого эксперимента. Убедитесь, что держатель слайдов, процедура от шага 1.1 очистки завершена. Все решения готовятся в слайд Держатели.
- Место 30 мл 100% этанола в один слайд владельца.
- Разбавьте этанола с бесплатной водой РНКазы/DNase/нуклеиназы. Место 30 мл 95% этанола в одном слайд держатель и положить на льду.
- Разбавьте этанола с бесплатной водой РНКазы/DNase/нуклеиназы. Место 30 мл 70% этанола в одном слайд держатель и положить на льду.
- Место 30 мл 100% ксилола в двух отдельных слайдов Держатели и обозначить их как #1 и #2.
4. Подготовьте криостат для разрезания тканей
- Получите ведро льда для растворы этанола и контейнер с сухим льдом для ткани.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Сухой лед очень холодно, так что используйте защитные перчатки. Не кладите лед и сухого льда в том же контейнере. Различных температур в лед и сухим льдом приведет к их форме вместе при температуре неопределенный. - Удаление ткани от-80 ° C морозильника и место на сухой лед для транспорта для криостата.
-
Криостат настройки:
- Установка толщины среза до 14 мкм.
- Значение отделку толщиной 30 мкм для сохранения количества ткани.
- Для криостатов с двойной камерой и проведение температуры образца установите температуру камеры (CT) до-18 ° C. Для криостатов с одной установки установите температуру до-17 ° C.
- Для криостатов с двойной камерой и проведение температуры образца установите температуру объекта (OT) до-16 ° C.
Примечание: OT должен быть теплее, чем CT для обеспечения даже резки. Если ткань еще измельчения, OT может быть увеличена до-15 ° C и КТ может быть увеличена до-18 ° C.
- Место ткани в криостат для по крайней мере 20 минут позволить прийти к оптимальной температуры.
Примечание: Если ткань не при оптимальной температуре, он будет перерабатывать после резки. Не ставьте ткани в-20 ° C ночью сохранения целостности РНК и предотвратить образование кристаллов льда. Разрешить ткани как много время необходимости сбалансировать до оптимальной температуры, чтобы сократить гладко. Необязательная реализация инкубации слайд под УФ может произойти здесь (см. шаг 1.3). - Место «Чак» в криостата по крайней мере 20 минут, чтобы спуститься к температуре криостата.
- Место чистой щетки в криостата по крайней мере 20 минут, чтобы спуститься к температуре криостата.
-
Очистить криостат
- Очистите сцену с 1:1 смесь РНКазы обеззараживатель и 70% этанола, разбавляют РНК/ДНК/нуклеиназы свободной воды, чтобы предотвратить замораживание на сцене.
- Очистите нового лезвия одноразовые криостат с РНКазы обеззараживатель и место в держатель лезвия на сцене. Позвольте по крайней мере 20 минут для криостата лезвие прийти к температуре криостата.
- Очистить пластина уголка с РНКазы обеззараживатель и прикрепить к сцене. Позвольте по крайней мере 20 минут для пластина уголка прийти к температуре криостата.
Примечание: Пластина уголка для резки не требуется, но настоятельно рекомендуется. Если пластина уголка не доступен, уборка кисть работает в качестве альтернативы. Если пластина уголка не при правильной температуре, ткани расплава или палку после резки.
5. секущей ткани
- Вырежьте небольшой кусочек ткани (~ 1 см x 1 см) для разрезания. Возвращение оставшихся ткани в сухой лед-80 ° C морозильник.
Примечание: Убедитесь, что в разделе ткани ~ 95% коры мозжечка, где расположены клетки Пуркинье. - Место примерно 3 мм высокий Курган Сен для покрытия «Чак». Начните с создания слоев на верхней части в медленно, круговыми движениями, до тех пор, пока существует небольшой холм.
- После октября частично заморожен, но есть еще некоторые жидкости в центре, место ткани поверх Окт. Не вставляйте ткани глубоко в октября разрешить ткани, чтобы сидеть на вершине октября до тех пор, пока полностью заморожены. Это займет 1 – 2 мин.
- Место «Чак» с замороженных OCT и ткани в руку резки криостата. Отрегулируйте ткани, так что это заподлицо с лезвия.
- Разрешить ткани сидеть в руку резки для 15 – 20 мин адаптироваться к новой температуре.
Примечание: В зависимости от толщины ткани необходимо время для адаптационного температуры. Разрешить ткани сидеть до тех пор, как требуется аккуратно вырезать. Отрегулируйте OT и CT для оказания помощи с адаптационного температуры тканей. - Медленно перемещайте ткани ближе к лезвию. Как только ткань достиг лезвие, начните процесс отделки. Обрезать толщины должно быть присвоено 30 мкм.
- Трим x 2 – 3 до тех пор, пока видны слои коры.
- Место и выровнять пластина уголка чуть выше лезвие криостата.
Примечание: Серебряная линия появится от света в криостата на стыке лезвие и пластина уголка. Это означает, что пластина уголка находится прямо над краем лезвия. - Начните сократить разделы на 14 мкм. Должным образом сократить разделы будет плоский под пластину уголка.
Примечание: Если ткань застрял, убедитесь, что пластина уголка достаточно холодно. Если необходимо, поместив кусок сухого льда на внешних (сторона, не касаясь этап) будет быстро охладите пластина уголка. - Вырезать 4 – 6 секций и выровнять их по горизонтали по сцене криостата.
- Рыбалка на слайд, забрать все части ткани в одно время.
Примечание: С помощью щетки, поднимите вверх концы ткани, чтобы быть более доступными для слайда после забрать. Не забрать одного раздела одновременно. Воздействие комнатной температуре воздуха будет деградировать РНК целостности.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не позволяйте коснуться стадии криостата мембраны. Если мембрана прикоснется к сцене, он начнет отделить от стеклянное скольжение и будут вызывать ошибки при попытке LCM. - Сразу перейти к шагу 6. Не откладывайте фиксации.
6. Крепление ткани/пятно менее визуализации
- Сразу перейти к протокол фиксации этанола
- Поместите слайд в слайд держатель с 70% этанола на 2 мин — на льду.
- Поместите слайд в слайд держатель с 95% этанола для 45 s — на льду.
- Поместите слайд в слайд держатель с 100% этанола на 2 мин — на RT.
- Погрузите слайд 3 раза в слайд держатель с ксилол 1 — на RT.
- Поместите слайд в слайд держатель с ксилоле 2 для 5 мин — на RT.
- Дайте высохнуть в чистой зоне, по крайней мере 30 минут дольше сухой раз являются оптимальными, до 60 мин.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Встаньте слайды для сушки в зонта. Ксилол нестабильна. Укладка слайды плоский вызовет ксилол пул в разделе ткани, который приведет к ткани, чтобы быть слишком темно.
7. Факультативный — Слайд хранения
- Место сушеные слайды в отдельных 50 мл трубки (один слайд на трубку) и места в холодильнике-80 ° C до 7 дней.
Примечание: Слайды должны быть сухими до размещения в морозильной камере-80 ° С. Не используйте осушитель внутри трубки, как частицы будет вставлять в ткани и мембраны. Убедитесь, что трубка крышка плотно; Если нет, то будет происходить конденсация на слайде при оттаивании для использования.
ОСТОРОЖНОСТЬЮ: РНК целостности уменьшается после 7 дней, как это делает качество визуализации тканей.
8. размораживание хранить слайды для использования
- Снимите трубку с одного слайда из морозильной камеры-80 ° C 1 ч до предполагаемого использования.
- Не открывайте сразу трубку. Разрешить трубки приехать в комнатной температуре. На внешней стороне трубки только будет происходить конденсация.
- После того, как трубка пришел к комнатной температуре и все уплотнения пошли (приблизительно 30-40 мин.), снимите крышку и разоблачить слайд к комнатной температуре воздуха.
- Разрешить на слайд, чтобы акклиматизироваться к комнатной температуре в течение 15 – 20 мин отпуск слайд внутри трубки с крышкой удалены.
Примечание: Слайд теперь готов к НОК.
9. Лазерная захвата Microdissection клеток Пуркинье:
Примечание: Этот раздел протокола будет обсуждать только особенности, связанные с захвата клеток Пуркинье для последующих РНК последовательности. В этом разделе предполагается, что пользователь знаком с УФ лазер захвата микроскоп и аффилированных программного обеспечения.
- Очистить микроскопа и коллекции Кап АРМ РНКазы дезинфектор.
- В перчатках место слайда на микроскопе и 500 мкл непрозрачной крышкой в коллекции руку.
Примечание: Всегда обеспечить правильную технику РНК путем очистки области работы с РНКазы обеззараживатель и использовать перчатках Касаясь слайд или непрозрачной крышкой. Перчатки могут быть удалены после слайд и Кап находятся на месте и начала захвата лазера. - При низком увеличении Совместите непрозрачный колпачок мозжечковой ткани, обеспечивая, что крышка охватывает всю территорию визуализирована в глаз кусок.
Примечание: Только глаза часть микроскопа покажет, если центру непрозрачный Кап. Камера не будет показывать, если крышка центрируется над ткани. В зависимости от конструкции область захвата лазер визуализации через непрозрачные колпачок будет либо в глаз кусок только или визуализировать как глаз кусок, так и камеры. - Визуализировать мозжечковой слои с 5 x - 10 x объектив и поместите курсор над разделом, где молекулярный слой и слой клеток гранул пересекаются (слоя клеток Пуркинье).
- Перейти к 40 X и визуализировать клеток Пуркинье.
Примечание: Рисунок 1 и на рисунке 2 приведена Пример визуализации. - Начните захват клеток Пуркинье.
Примечание: Для выполнения РНК последовательности, по крайней мере 5 нг РНК не требуется. Примерно 1600-2000 Пуркинье клетки привести достаточно РНК материала для виртуализации. РНК будет стабильной до 8 ч в Микроскоп. Энергии тест УФ и УФ фокус до сбора для обеспечения уровня являются правильными. Со временем ткани будет по-прежнему высыхает и энергии УФ и УФ фокус может потребоваться изменить.
10. РНК коллекции пост LCM
-
Подготовьте буфер lysis клетки (приготовить свежий каждый раз)
- Развести 2-меркаптоэтанол литического буфера на масштаба 1: 100 (10 μL:1 мл, соответственно). Буфер Lysis (RLT) приводится в Таблице материалов (#14 и #15).
- Добавьте 50 мкл буфера lysis клетки в крышку непрозрачные, с крышкой вверх. Тщательно закройте трубку над крышкой.
- Оставьте трубку вниз головой за 1 мин.
- Вихревой трубе для 30 s и быстро спина литического буфера в нижней части трубки.
- Возобновить трубки и повторите шаги 10.2-10,4.
- Место труб, содержащей 100 мкл буфера lysis и РНК из морозильной камеры-80 ° C до тех пор, пока все образцы готовой и готовы к РНК добыча (Таблица материалов #14).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает шаги для подготовки ткани мозга человека свежий замороженные посмертные УФ-LCM. Тщательной спецификации и аннотации приведены для криостата резки, как это может быть трудно вырезать свежий замороженные мозговой ткани с высокой степенью точности. Наиболее важным моментом для рассмотрения является свежий замороженные ткани очень холодно и требуется значительное количество времени, чтобы акклиматизироваться к высокой температуре криостата. Этот шаг нельзя торопить, и он не может быть завышена, как этот шаг расположен в успех или провал этого протокола. Если ткань не подготовлен должным образом на криостат, все последующие попытки выявления клеток или регионы интереса будет очень трудно, если не невозможно.
После разрезания криостат и отведенное время сушки ткани готова к НОК. При визуализации тканей под микроскопом, клеточных слоев мозжечка легко видны с 5 X и 10 X объективов. Рисунок 1 показывает, представитель изображения тканей фиксированной в этанол на только (рис. 1А) и ткани инкубировали в ксилоле после фиксации (рис. 1Б) этанола. Мы тщательно протестированы различные этанола и ксилола инкубации раз / температуры на способность как исправить и визуализировать ткани. Если ткань не инкубировали достаточно долго в ксилоле, полученное изображение будет больше напоминать Рисунок 1A, а не Рисунок 1B. Ксилол инкубации причины, что ткани, чтобы стать темнее и лучше очерчивает клеточных слоев чем делает этанола в одиночку. При резке на лазерный микроскоп захват, 40 X объектив для обеспечения захвата только клеток Пуркинье и не окружающие ткани. Инкубации в ксилоле производит высокое качество, морфологически нетронутыми изображения (рис. 1D) по сравнению с только этанола фиксации (рис. 1C).
Для дальнейшего повышения визуализация наших тканей, мы протестировали coverslip способность непрозрачной крышкой. Другие протоколы, УФ-LCM использовать жидкости заполнены колпачок 200 – 500 мкл трубки, которая растворяет ткани на контакт. Жидкое заполненный шапки можно уменьшить визуализации тканей, вызывая полученное изображение гранулированных и радужные под микроскопом (рисA). Визуализация в ткани через непрозрачные крышка (рис. 2B) результаты в выровненные ткани внешний вид, который мягче и более резким в форме. В частности непрозрачной крышкой позволяет коллекции до 8 ч, без необходимости замены. Представитель изображения подакцизным клеток Пуркинье при малой мощности (рис. 2C) и при высокой мощности (Рисунок 2D, E) показывают точное удаление всего тела клетки Пуркинье. Для справки, Рисунок 2F показывает быстро Luxol синий / гематоксилином и эозином (LH & E) stained мозжечковой коры, которая конкретно освещаются различные слои мозжечка и размещение клеток Пуркинье в молекулярной слой и блок клеток слой сопоставление.
Целью настоящего Протокола является получить высокое качество РНК для последующих РНК последовательности. Мы протестировали наш протокол на шести образцах различных посмертные мозга человека, которые прошли три дня LCM собирать 1500 – 2000 клетки для извлечение RNA. Примерно 6-8 ч в Микроскоп производства 500 – 700 клетки, которые затем были объединены с продуктами LCM предыдущих дней до извлечение RNA. Образцы прошли РНК добыча и были высокомобильна в 14 мкл РНКазы свободной воды (Таблица материалов #14). Все шесть образцов производится высокое качество РНК, с РНК целостности ≥8 чисел (RINs) (рис. 3A-F). Эта процедура привела в количествах РНК 11.5 нг (рисA), 8.3 нг (рис. 3B), 13,6 нг (рис. 3C), 11,5 нг (рис. 3D), 14,9 нг (рис. 3E) и 26,9 NG (рис. 3F). Следует отметить, что все образцы человеческого мозга post-mortem были проверены на качество РНК до LCM (Таблица 1). Если образец происхождения РНК деградации, LCM только еще больше понизит его целостность.
Рисунок 1 : Мозжечковой слои и клеток Пуркинье визуализации с и без лечения ксилол. Представитель изображений с и без ксилол после фиксации этанола и обезвоживания. Помечены как молекулярный слой (мл) и слоя клеток гранул (GCL). Клетки Пуркинье обозначаются стрелками. (A) 5 X представление мозжечковой слой визуализации без ксилола. Линейки: 10 мкм. (B) 5 X представление мозжечковой слой визуализации с ксилола. Линейки: 10 мкм. (C) 40 X представление мозжечковой слой визуализации без ксилола. Линейки: 1 µm. (D) 40 X представление мозжечковой слой визуализации с ксилола. Линейки: 1 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Визуализация клеток Пуркинье до и после LCM. Представитель изображений на 40 X с ксилол после фиксации этанола и обезвоживания. Помечены как ML и GCL. Клетки Пуркинье обозначаются стрелками. (A) визуализации в Микроскоп под жидкости заполнены колпачок на 40 x. Линейки: 1 µm. Визуализация (B) в Микроскоп под непрозрачные коллекции колпачок 40 X. Линейки: 1 µm. (C) 5 X визуализация мозжечковой коры показаны подакцизным клеток Пуркинье между мл и GCL. Линейки: 10 мкм. (D) 40 X визуализация клетки Пуркинье до обрезания. Линейки: 1 µm. (E) 40 X визуализация успешных клеток Пуркинье захвата. Линейки: 1 µm. (F) 20 X представитель LH & E окрашенных мозжечка показаны клеток Пуркинье органов с отмеченные стрелками. Линейки: 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : РНК контроля качества Bioanalyzer результаты LCM образцы. Группы A-F показать представителя РНК контроля качества отсчетов. Каждая группа является другой образец, который прошел тот же LCM процесс фиксации и визуализации с этанолом и ксилола только. РНК целостности чисел (промывки) все > 8.0. Представитель концентрации [] результат урожайности по крайней мере 5 нг всего РНК. Все образцы были этого eluted в 14 мкл РНКазы свободной воды. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Пример | Рин - раздел Prep | РИН - LCM | [РНК] - LCM | PMI-замороженные |
| A | 9.2 | 8.6 | 822 pg/мкл | 450 мин |
| B | 9.8 | 8 | 598 pg/мкл | 550 мин |
| C | 9.1 | 8.5 | 976 pg/мкл | 455 мин |
| D | 9.8 | 8.2 | 823 pg/мкл | 463 мин |
| E | 9.8 | 9.1 | 1069 pg/мкл | 1139 мин |
| F | 9.6 | 8.3 | 1923 pg/мкл | 1080-мин |
Таблица 1: Краткая информация о целостности РНК . Пример номера соответствуют bioanalyzer результаты, представленные на рисунке 3. В разделе Подготовка выполняются до LCM обеспечить начиная ткань хорошего качества. Показано оригинальные ткани промывки из раздела парфюмерные, промывки LCM и концентрации РНК от LCM, а также посмертные интервалы для замораживаются (PMI-замороженные) для тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокола, представленные здесь специально изменены нержавеющей подход в визуализации морфологически различные ткани для УФ-НОК. Этот метод предназначен для обеспечения максимальной целостности РНК для последующих прямой последовательности РНК, сохраняя при этом повышенный уровень визуализации тканей. Способность различать различных типов клеток для захвата, для создания чистой популяция клеток возможно, имеет важное значение для понимания различных молекулярных профилей в тканях человека15. В контексте настоящего Протокола выбор ткани имеет первостепенное значение, как использование антиген или краситель конкретных реагенты не используются и поэтому не подходит для исследований, которые требуют такой дифференциации. Хотя это ограничение этого протокола, результате визуализации тканей и РНК целостности довольно Улучшенный и поддерживать актуальность в другие экспериментальные проекты. Существуют многие другие протоколы, которые также использовать альтернативные методы окрашивания специально для УФ - и ИК-LCM с целью сохранения РНК. Однако, большинство других методов содержат по крайней мере один пятнать или антигена конкретных реагент нектар6,16,17, предназначены для одного типа клеток или органов, (которые не являются человеческие вскрытия ткани)18,19, 20, или требуют специализированных РНК seq наборы для повышения целостности21. Пятнать количество кресил фиолетовый (Ниссль) является популярным красителем, содержащие реагент, который используется в многих протоколов, как это пятна ядер нейронов в головном мозге и причиняет наименьшее количество РНК деградации6. Однако больше ядро клетки Пуркинье хорошо не запятнана количество кресил фиолетовый, обеспечивая не значительные выгоды для визуализации клеток Пуркинье. Важно отметить, что мы определили только одно исследование LCM в литературе описано коллекции человеческих клеток Пуркинье, которые представляют значительный интерес для изучения мозжечка дегенеративных и развития расстройств. Это исследование окрашенных замороженные ткани с количество кресил фиолетовый и изолированных клеток Пуркинье с ИК-LCM системой; Пример как низкий, как 5 были использованы, но считаются приемлемыми для microarray анализ22промывки. Таким образом это первое исследование протокол, предназначенный специально для высокого качества РНК из клеток Пуркинье посмертные человека мозжечка подакцизным через УФ-НОК.
Стабильность РНК в тканях трупа человека является известный препятствием, как молекулы РНК в клетки подвергаются довольно естественного распада после смерти. В частности мРНК было показано наиболее чувствительны к деградации nucleolytic5. Мониторинг-послеубойной интервала (PMI) время для замораживания (PMI-замороженные) является одна метрика, которая показывает некоторые корреляции РНК деградации в некоторых исследованиях по23,24,25. Однако Таблица 1 показывает наш PMI-замороженные интервалы для шести образцах показано на рисунке 3, который указывает не относительной корреляции с ФМИ ценности и качества РНК. Таким образом, это необходимо для выполнения должной осмотрительности в проверке целостности РНК до начала проекта захвата лазера. Если целостность РНК начала образца низкого качества, результирующая РНК из LCM продукта будет даже более низкого качества. Когда нельзя избежать низкого уровня целостности РНК, другие методы для повышения РНК последовательности могут быть использованы в дополнение к этот протокол21. Примечательно низкозатратного или деградированных РНК может привести к приглушенные сложности и субоптимальные результаты, которые часто требуют дополнительного усиления шаги. Добавление циклов PCR для амплификации было показано усилить последовательности неравномерно, а так же создать читать дубликаты по виртуализации26,27. Таким образом использование высококачественных РНК от LCM образцов для секвенирования весьма выгодным.
Метод визуализации, используемые в настоящем Протоколе сильно зависит от пользователя знания при резке свежие замороженных ткани на криостата. Протокол переходит в обширные подробно о том, как наилучшим образом подготовить ткань для разрезания и место ткани на слайде. Это, несомненно, являются два наиболее важных шаги настоящего Протокола. Если ткань не приспособиться к температуре криостат, измельчения будет происходить, что существенно препятствует морфологические качества ткани. Измельчение является результатом нескольких потенциальных проблем; Устранение неполадок возможности включают ожидания дольше для ткани, чтобы прийти к температуре или изменяя OT криостата или КТ к целому теплее. Как только вырезать и помещены на сцене ткани важно ориентироваться на ткани и слайд должным образом обеспечить все ткани вписывается в мембране и можно точно подобрать со сцены. При попытке подобрать ткань от этапа криостат, ткани должны быть холодной, и слайд должна быть теплой. Альтернативные протоколы существуют, которые рекомендуют охлаждать слайд до собирание ткани и утепленные с пальцем над районом ткани размещение28; Однако в наших руках, это не дает никакой пользы и часто вызывает затруднения в выборе тканей и складки излишней ткани. С слайд при комнатной температуре ткани сразу же тает при контакте с слайд. Для обеспечения чистой раскладки, это необходимо для угол слайда таким образом, чтобы она прикоснулась ткани в зоне мембраны, но не пойти так далеко, чтобы коснуться на стадии себя. Мембрана начнет отсоединить от стеклянное скольжение, если она затрагивает на этапе, который повреждает мембраны и делает лазерные захвата сложных. Если это произойдет, это будет заметно, как только LCM начал и не может быть отменено. Поиск и устранение неисправностей ограничены; Если в любой момент думали, были скомпрометированы мембраны или слайд, целесообразно отменить. Рекомендуется для практики свежий замороженные ткани резании до начала проекта или с помощью основной патологии, который может производить высококачественные ткани секционирование. Однако если используется основной службы, обеспечить соблюдение правильной техники РНК для предотвращения загрязнения РНКазы. РНК деградации легко может произойти, когда используется неправильная техника.
Мы представили здесь полный метод для нержавеющей визуализации клеток Пуркинье в мозжечке трупа человека для целей УФ-НОК. Мы также включены правильные методы сохранения РНК и методы, чтобы обеспечить высокий уровень целостности РНК. Этот протокол не обязательно специфичные для любой одной клетки или ткани типа, но не поддерживать требование, что ячейку области интереса морфологически отличаются от окружающих стромы без необходимости для конкретных распознавания антигена или краска.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать банк Нью-Йорка мозга, д-р Жан Поль Vonsattel и доктор Etty Кортес, за их помощь в резки и сохранения замороженных человеческий мозг образцов ткани для этих экспериментов. Авторы хотели бы признать лица, которые щедро пожертвовал их мозг для продолжающихся исследований в важнейших тремор. Доктор Фауст и д-р Martuscello хотели бы признать Колумбийского университета Департамента патологии и клеточной биологии, за их неизменную поддержку и основных космических исследований. Авторы хотели бы признать NIH R01 NS088257 Луи/Фауст) для финансирования научных исследований для этого проекта. LCM изображения были исполнены в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Авторы хотели бы признать Тереза Swayne и Лаура Мунтяну за их постоянную помощь с специализированными микроскопии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
References
- Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Romero, I. G., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12 (42), 1-13 (2014).
- Bevilacqua, C., Ducos, B. Laser microdissection: A powerful tool for genomics at cell level. Molecular Aspects Medicine. 59, 5-27 (2018).
- Sidova, M., Tomankova, S., Abaffy, P., Kubista, M., Sindelka, R. Effects of post-mortem and physical degradation on RNA integrity and quality. Biomolecular Detection and Quantification. 5, 3-9 (2015).
- Wang, H., et al. Histological staining methods preparatory to laser capture microdissection significantly affect the integrity of the cellular RNA. BMC Genomics. 7, 97 (2006).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Springer. (2018).
- Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: should an ultraviolet or infrared laser be used. Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
- Graeme, M. I. Laser Capture Microdissection. Third edn. , Humana Press. (2018).
- Louis, E. D. Re-thinking the biology of essential tremor: From models to morphology. Parkinsonism & Related Disorders. 20, 88-93 (2014).
- Choe, M., et al. Purkinje cell loss in essential tremor: Random sampling quantification and nearest neighbor analysis. Movement Disorders. 31 (3), 393-401 (2016).
- Louis, E. D., et al. Neuropathological changes in essential tremor: 33 cases compared with 21 controls. Brain. , Pt 12 3297-3307 (2007).
- Louis, E. D., et al.
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Jensen, E.
- Waller, R., et al. Isolation of enriched glial populations from post-mortem human CNS material by immuno-laser capture microdissection. Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 108-113 (2012).
- Lee, S., et al. Laser-capture microdissection and transcriptional profiling of the dorsomedial nucleus of the hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 520 (16), 3617-3632 (2012).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Sonne, S. B., et al. Optimizing staining protocols for laser microdissection of specific cell types from the testis including carcinoma in situ. PLoS One. 4 (5), 5536 (2009).
- Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas. Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).
- Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (1), 442 (2017).
- Kumar, A., et al. Age-associated changes in gene expression in human brain and isolated neurons. Neurobiology of Aging. 34 (4), 1199-1209 (2013).
- Sampaio-Silva, F., Magalhaes, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval. PLoS One. 8 (2), 56507 (2013).
- Walker, D. G., et al. Characterization of RNA isolated from eighteen different human tissues: results from a rapid human autopsy program. Cell Tissue Bank. 17 (3), 361-375 (2016).
- Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue. Cell Tissue Bank. 12 (4), 311-318 (2011).
- Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
- Parekh, S., Ziegenhain, C., Vieth, B., Enard, W., Hellmann, I. The impact of amplification on differential expression analyses by RNA-seq. Scientific Reports. 6, 25533 (2016).
- Carl Zeiss Microscopy. , Carl Zeiss. Germany. (2012).
