Ett rostfritt protokoll för högkvalitativa RNA isolering från Laser fånga Microdissected Purkinje celler i människans postmortala lillhjärnan

Summary

Detta protokoll används en fläck-fri metod för att visualisera och isolera Purkinje celler i färskfryst vävnad från mänskliga postmortala lillhjärnan via laser fånga lokalt. Syftet med detta protokoll är att generera tillräckliga mängder av hög kvalitet RNA för RNA-sekvensering.

Abstract

Laser fånga lokalt (LCM) är ett fördelaktigt verktyg som möjliggör insamling av cytologically och/eller fenotypiskt relevanta celler eller regioner från heterogen vävnader. Fångade produkten kan användas i en mängd olika molekylära metoder för protein, DNA eller RNA isolering. Bevarandet av RNA från efter döden mänsklig hjärnvävnad är dock särskilt utmanande. Standard visualiseringstekniker för LCM kräver histologisk eller immunhistokemisk färgning förfaranden som kan ytterligare försämra RNA. Därför har vi utformat ett rostfritt protokoll för visualisering i LCM med syftet att bevara RNA i postmortala mänsklig hjärnvävnad. Purkinje cellen av lillhjärnan är en bra kandidat för rostfritt visualisering, på grund av dess storlek och karakteristiska läge. Cerebellar cortex har distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten, vilket gör dem ett bra arketyp att identifiera under hög förstoring mikroskopi. Purkinje celler är stora nervceller som ligger mellan det granule celllagrar, som är ett tätt nät av små nervceller, och det molekylära lagret, som är gles i cellen organ. På grund av denna arkitektur är användningen av rostfritt visualisering genomförbart. Andra organ eller cell system som efterliknar denna fenotyp skulle också vara lämpliga. Det rostfria protokollet är utformat för att fixa färskfryst vävnad med etanol och ta bort lipider med xylen för förbättrade morfologiska Visualisering under hög förstoring ljusmikroskopi. Detta protokoll tar inte hänsyn till andra fixering metoder och är särskilt utformad för färskfryst vävnadsprover som tagits med en ultraviolett (UV)-LCM-systemet. Här presenterar vi ett komplett protokoll för snittning och fastställande färsk fryst postmortala mänsklig cerebellär vävnad och rening av RNA från Purkinje celler isoleras genom UV-LCM, samtidigt som RNA kvalitet för efterföljande RNA-sekvensering. I våra händer, detta protokoll producerar enastående nivåer av cellulära visualisering utan behov av färgning reagenser och avkastningar RNA med höga RNA integritet tal (≥8) som behövs för transkriptionell profilering experiment.

Introduction

Laser fånga lokalt (LCM) är en värdefull forskningsverktyg som tillåter separation av patologiskt relevanta celler för efterföljande molekylärt driven utvärdering. Användning av molekylära analyser i dessa heterogena vävnadsprover och sambandet med patologiska och kliniska data är ett nödvändigt steg i utvärdera translationell betydelsen av biologisk forskning¹. När man analyserar gen uttryck data från RNA, användning av frysta vävnadssnitt rekommenderas eftersom det ger utmärkt kvalitet av RNA som maximerad kvantitet². Det har också fastställts att hög kvalitet och kvantitet av RNA är viktigt för meningsfulla data från RNA-sekvensering³. När du använder RNA från färsk fryst post mortem vävnad för LCM, är RNA nedbrytning dock en stor utmaning, eftersom det sker omedelbart efter döden och dess utsträckning medieras av olika faktorer som är förknippade med vävnad samling metod^4,5 . Dessutom förvärras RNA nedbrytning när färgning tekniker behövs för att känna igen histologisk detaljer och cell identifiering. Specialiserade färgningsteknik, såsom hematoxylin och eosin, Nissl fläcken, immunofluorescens och immunohistokemi är till hjälp för att skilja celler från omgivande stroma men har visat sig försämra RNA och ändra avskrift uttryck profiler⁶. Vårt laboratorium har därför skapat ett rostfritt protokoll specifikt för att bevara RNA i postmortala mänskliga lillhjärnan för RNA-sekvensering efter LCM isolering av Purkinje nervceller.

I bearbetning färsk fryst vävnad för LCM, kan metoden fixering steglöst påverka både RNA och vävnad integritet. Formalin fixering är standard för morfologiska bevarande, men orsaker cross-linking som kan splittra RNA och störa RNA förstärkning⁷. Etanol fixering är ett bättre alternativ för RNA isolering, eftersom det är en coagulative fixativ som inte inducerar tvärbindande¹. För att förbättra visualisering av vävnad morfologi, är xylen det bästa valet, eftersom det tar bort lipider från vävnaden. Men finns det kända begränsningar när du använder xylen i LCM, som vävnader kan torka ut och bli sprött orsakar vävnad fragmentering vid laser fånga⁷. Xylen är också ett flyktiga toxin och måste hanteras korrekt i dragskåp. Xylen har dock visats öka vävnad visualisering samtidigt bevara RNA integritet⁸. Därför kretsar våra protokoll kring användningen av 70% etanol fixering och etanol uttorkning, följt av xylen inkubation i morfologiska klarhet.

Det är viktigt att notera de olika typerna av laser-baserad lokalt system, som de har visat sig skiljer sig i hastighet, precision och RNA kvalitet. Infraröd (IR) lasern fånga lokalt och ultraviolett (UV) lasern microbeam lokalt system var båda roman LCM-plattformar som uppstod nästan samtidigt⁸. IR-LCM systemet använder ett ”kontakt system” med en transparent termoplast film placeras direkt på avsnittet vävnad och celler av intresse följa selektivt filmen av fokuserad pulser från en IR-laser. Alternativt, UV-LCM systemet är en ”icke-kontakt” whereby en fokuserade laserstrålen skär bort cellerna eller regioner av intresse i vävnaden; beroende på konfigurationen i två tillgängliga kommersiella plattformar som använder antingen en inverterad eller upprätt Mikroskop design, vävnad förvärvas i en samling av en laser-inducerad tryckvågen som katapulter det mot gravitationen eller vävnad är samlas in av gravitation, respektive. Betydande fördelar av UV-LCM systemet inkluderar snabbare cell förvärv, förorening-fri samling med beröringsfri metod och mer precisa dissektion på grund av en mycket mindre laser beam diameter⁹. Detta protokoll utformades specifikt för ett UV-LCM-system och har inte testats i ett IR-LCM-system. I antingen UV-LCM systemdesign, när ackumulerande celler i samlingen GJP, användning av ett täckglas som förbättrar är cellulär tydlighet under mikroskopi inte lämplig, som cellerna skulle kunna träda i den samling gemensamma jordbrukspolitiken. Därför, för att öka vävnad visualisering, vi testade användningen av ogenomskinlig collection lock, som är utformade för att fungera som ett täckglas för mikroskopiska visualisering i UV-LCM system, mot flytande fyllda samling caps. Flytande fyllda samling caps kan vara en utmaning då vätskan är föremål för avdunstning och måste bytas oftare medan du arbetar på mikroskopet. Tiden blir en viktig faktor för RNA stabilitet, som fångade vävnaden upplöser omedelbart⁷.

Vårt laboratorium studier efter döden neuropatologiska förändringar i lillhjärnan av patienter med essentiell tremor (ET) och relaterade neurodegenerativa sjukdomar av lillhjärnan. Vi har visat morphologic ändringar centrerad på Purkinje celler som skiljer ET fall jämfört med kontroller, inklusive minskat antal Purkinje celler, ökade dendritiska regression och en mängd axonal förändringar, leder oss till postulerar att Purkinje cell degeneration är en core biologiska funktion i ET patogenes^10,11,12,13. Transkriptionell profilering har använts i många neurologiska sjukdomar för att utforska underliggande molekylära grunden för degenerativa cellförändringar. Dock kan transkriptionell profiler från heterogena prover, såsom vävnad hjärnregioner, effectually maskera uttryck för låg överflöd avskrifter eller minska detektion av molekylära förändringar som förekommer endast i en liten population av drabbade celler, såsom Purkinje celler i lillhjärnan cortex. Exempelvis är Purkinje celler kraftigt underläge av riklig granule celler i lillhjärnan cortex av ungefärligt 1:3000; således att effektivt rikta kräver deras transkriptom särskild isolering av dessa nervceller. Cerebellar cortex avgränsas av distinkta lager som skiljer sig i cell densiteten och Cellstorlek. Denna cellulära arkitektur är idealisk att visualisera i ett färskfryst vävnadsprov utan som innehåller färgämnet färgning reagenser. I teorin, detta protokoll skulle också kunna tillämpas på andra vävnadstyper av som har liknande särskiljande vävnad organisation.

Detta protokoll var ämnad att arbeta specifikt för Purkinje celler visualisering i mänskliga postmortala lillhjärnan. Det finns även många protokoll, ofta för fixering, färgning visualisering och RNA bevarandet av många typer av vävnader vid tillämpningen av både IR - och UV-LCM. När överväger en experimentell design för UV-LCM, bör individer skräddarsy sina protokoll för att bäst passa behoven och kraven av start- och slutdatum material. Här kombinerar vi många aspekter av olika LCM protokoll att tillhandahålla en förbättrad metod för att visualisera Purkinje celler i postmortala mänskliga lillhjärnan utan färgämne som innehåller färgning reagenser att förbereda högkvalitativa RNA för transkriptom sekvensering.

Protocol

Alla mänskliga prover som utnyttjas i detta protokoll har erhållits med informerat samtycke och har godkänts av den interna granskning Board (IRB) vid Columbia University och Yale University.

Obs: Helheten av detta protokoll bör följa strikta RNA hantering riktlinjer, whereby en behandskade hand används alltid, alla ytor rengörs med ett RNase decontaminator och alla arbetsmaterial är RNA/DNA/Nuclease gratis.

1. testa RNA integritet vävnad före start LCM

Obs: Testning RNA kvalitet kan göras av många metoder. Se till att RNA från hela sektionen är testade för att ge en representativ RNA integritet nummer (RIN) för provet.

1. Noga välja vävnadsprover för inkludering som ryms inom parametern för experimentell design. Om skärning på kryostaten, gå till steg 1.2. Om inte, bearbeta vävnaden med detta och gå till steg 1.11.
2. Få två behållare av torr-is. Storlek beror på antalet prover.
   1. I den första behållaren torris, placera ett tomt, märkt 2 mL rör med vävnad koden.
      Obs: Det tar 10 min för rören för att frysa. Rören skall frysas innan vävnaden i dem; annars smälter vävnaden på röret.
   2. I en andra behållare med torris, placera vävnaden från-80 ° C frys som kräver RNA kontrollera.
3. Rengöra kryostaten. Se steg 4.7 för detaljerad procedur rengöring.
4. Ta bort vävnad från torris och skär en liten del av vävnad med ett RNase dekontamineras rakblad. Vävnad bör vara ca 1 cm x 1 cm i storlek.
5. Placera en cirka 3 mm hög kulle av optimal skärtemperatur (ULT) förening på en kryostat 'chuck' och gör det möjligt att delvis frysa. Sedan placera vävnaden ovanpå ULT — inte tryck i OCT, bara låta det vila på toppen.
6. När OCT hårdnar, placera chucken med monterade vävnaden i kryostaten skärande arm och position framför kryostaten bladet.
7. Trim på 30 μm sektioner tills vävnaden är ännu.
8. Skär 300 μm av vävnad och placera i en fryst 2 mL tub. Placera röret tillbaka i torr-is.
9. Ta bort vävnad från 'chuck' och placera tillbaka i torris tills redo att lägga undan.
10. Upprepa steg 1,4 – 1,9 för alla vävnader.
11. När alla prover är komplett, extrahera RNA med hjälp av RNA extraktion kit som tillhandahålls (Tabell för material #15). Ett detaljerat protokoll tillhandahålls med RNA extraktion kit. Följ alla instruktioner inklusive valfria steget torka collection tube membranet och det valfria steget för DNAS matsmältningen (Tabell för material #16).
12. Testa integriteten för extraherade RNA via en kvalitet bedömning bioanalyzer¹⁴.

2. Förbered innan start snittning för LCM

1. Rengöra diabilder innehavare före varje omgång av vävnad snittning för LCM. Utför rengöringsproceduren dagen innan användning för att möjliggöra fullständig torkning över natten.
   Obs: bild hållare används för vävnaden avsnitt fixering i etanol och clearing i xylen.
   1. Skjut korthållaren rengöringsprocedur: Skölj med RNase decontaminator följt av dietyleter pyrocarbonate behandlas (DEPC) vatten. Låt torka över natten uppochner på ett RNA/DNA/Nuclease fri yta, undvika att damm eller andra luftburna föroreningar.
      Varning: DEPC är mycket giftigt och bör hanteras och bortskaffas med EH & S standard farliga kemikalier-protokollet.
2. Rengör borstarna för snittning med RNase decontaminator och låt torka över natten. Undvika damm och andra föroreningar.
3. Plats membranet glider under UV-ljus för 30 min i rumstemperatur. Får inte utsättas bilderna UV-mer än 1 – 2 dagar före till använda. Detta förbättrar bindningen av vävnaden till membran bild.
   Obs: Steg 2.3 kan kombineras med Steg4, som möjliggör för bild UV behandling ska inträffa på samma dag som vävnad snittning (se steg 4.4).

3. Förbered fixering lösningar med RNase gratis vatten och högkvalitativa etanol

Obs: Alla lösningar är beredda färska för varje experiment. Säkerställa att den diapositivhållaren rengöring från steg 1.1 är avslutat. Alla lösningar är beredda i bild hållare.

1. Placera 30 mL 100% etanol i en diapositivhållaren.
2. Späd etanol med RNase/DNAS/Nuclease gratis vatten. Plats 30 mL 95% etanol i ett Skjut korthållaren och på is.
3. Späd etanol med RNase/DNAS/Nuclease gratis vatten. Plats 30 mL 70% etanol i en Skjut korthållaren och på is.
4. Plats 30 mL 100% xylen i två separata bild innehavare och märka dem som #1 och #2.

4. Förbered kryostat för vävnad snittning

1. Få en hink med is för etanol lösningar och en behållare med torr-is för vävnaden.
   Varning: Torris är extremt kallt, så Använd skyddshandskar. Placera inte is och torris i samma behållare. Olika temperaturer i is och kolsyreis kommer att orsaka dem att bilda tillsammans på ett obestämt temperatur.
2. Ta bort vävnad från-80 ° C frys och plats på torris för transport till kryostaten.
3. Kryostaten inställningar:
   1. Ställa in snittjocklek till 14 μm.
   2. Ange trim tjocklek till 30 μm att bevara vävnad kvantitet.
   3. För kryostater med dubbla kammare och preparatet håller temperaturer, ställa in kammare temperaturen (CT) till-18 ° C. För kryostater med en enda inställning, Ställ in temperaturen till-17 ° C.
   4. För kryostater med dubbla kammare och preparatet håller temperatur, ställa in objektet temperaturen (OT) till-16 ° C.
      Obs: OT måste vara varmare än CT att säkerställa även skära. Om vävnaden fortfarande fragmentering, OT kan ökas till-15 ° C och CT kan ökas till-18 ° C.
4. Placera vävnaden i kryostaten i minst 20 min för att komma till optimal temperatur.
   Obs: Om vävnaden inte är vid optimal temperatur, kommer det strimla vid styckning. Placera inte vävnaden i-20 ° C kvällen innan att bevara RNA integritet och förhindra ice crystal bildandet. Tillåta vävnaden så mycket tid som behövs för att temperera vid optimal temperatur att skära smidigt. Valfria genomförandet av bild inkubationen under UV kan uppstå här (se steg 1.3).
5. Placera den 'chucken' i kryostaten i minst 20 min för att komma ner till temperaturen av kryostaten.
6. Placera rena borstarna i kryostaten i minst 20 min för att komma ner till temperaturen av kryostaten.
7. Rengöra kryostaten
   1. Rensa scenen med en 1:1 blandning av RNase decontaminator och 70% etanol utspätt med RNA/DNA/Nuclease gratis vatten för att förhindra frysning på scenen.
   2. Ren ett nytt disponibla kryostaten blad med RNase decontaminator och plats i bladhållaren på scenen. Låt minst 20 min för kryostaten bladet att komma till temperaturen i kryostaten.
   3. Rengöra antirullningsplattan med RNase decontaminator och bifoga till scenen. Låt minst 20 min för antirullningsplattan komma till temperaturen i kryostaten.
      Obs: En anti-rullningsplattan krävs inte för att skära men rekommenderas starkt. Om en anti-rullningsplattan inte är tillgänglig, fungerar en rengjorda borste som ett alternativ. Om inte är antirullningsplattan vid rätt temperatur, kommer att vävnaden smälta eller hålla vid styckning.

5. snittning vävnad

1. Skär en liten bit av vävnaden (~ 1 cm x 1 cm) för snittning. Returnera den återstående vävnaden till torr-is /-80 ° C frys.
   Obs: Se till att avsnittet vävnad ~ 95% cerebellar cortex, där Purkinje celler finns.
2. Placera en cirka 3 mm hög kulle av OCT att täcka 'chuck'. Börja med att bygga lager på toppen i en långsam, cirkulär rörelse, tills det finns en liten kulle.
3. När OCT är delvis frusen, men det finns fortfarande lite vätska i mitten, placera vävnaden ovanpå OCT. Skjut inte vävnaden djupt in i OCT. Tillåt vävnaden att sitta ovanpå OCT tills helt fryst. Detta kommer att ta 1 – 2 min.
4. Placera den 'chucken' med frysta OCT och vävnaden in i kryostaten skärande arm. Justera vävnaden så det är jäms med klingan.
5. Att vävnaden att sitta i den skärande arm för 15 – 20 min att anpassa sig till nya temperatur.
   Obs: Beroende på tjockleken av vävnad behövs tid för temperatur acklimatisering. Låt vävnaden att sitta så länge som behövs för att skära rent. Justera OT och CT för att hjälpa till med vävnad temperaturen acklimatisering.
6. Långsamt flytta vävnaden närmare till bladet. När vävnaden har nått bladet, börja trimma processen. Trim tjocklek ska vara inställd på 30 μm.
7. Trimma 2 – 3 x tills cortex lager är synliga.
8. Placera och Justera antirullningsplattan precis ovanför bladet kryostaten.
   Obs: En silver linje visas från ljuset i kryostaten på gränssnittet för bladet och anti-rullningsplattan. Detta indikerar antirullningsplattan är direkt över kanten på bladet.
9. Börja med att skära avsnitten på 14 μm. Korrekt skära sektioner blir under antirullningsplattan.
   Obs: Om vävnaden har fastnat, se till att antirullningsplattan är tillräckligt kallt. Om nödvändigt, att placera en bit torr is på utsidan (sida inte röra scenen) kommer snabbt chill antirullningsplattan.
10. Skär 4 – 6 sektioner och justera dem horisontellt över kryostaten scenen.
11. Mete i bilden, plocka upp alla bitar av vävnad i taget.
    Obs: Använda borstarna, lyft upp ändarna av vävnaden att vara mer lättillgängliga för bilden på plocka upp. Inte plocka upp ett avsnitt i taget. Exponering för rumstemperatur luft kommer att försämra RNA integritet.
    Varning: Låt inte membran tryck på scenen av kryostaten. Om membranet rör scenen så det börjar lossna från glasskiva och kommer att orsaka fel när du försöker LCM.
12. Omedelbart flytta till steg 6. Dröj inte fixering.

6. fastställande av vävnad/Stain-less visualisering

1. Omedelbart flytta till protokollet etanol fixering
2. Placera bilden i bildhållaren med 70% etanol för 2 min – på is.
3. Placera bilden i bildhållaren med 95% etanol för 45 s — på is.
4. Placera bilden i bildhållaren med 100% etanol för 2 min – på RT.
5. Doppa i bilden 3 gånger i skjut hållaren med xylen 1 — på RT.
6. Placera bilden i bildhållaren med xylen 2 för 5 min — på RT.
7. Låt torka i ett rent område för minst 30 min. längre torktid är optimala, upp till 60 min.
   Varning: Stå upp bilder för torkning i dragskåp. Xylen är flyktiga. Äggläggande diabilder platta kommer att orsaka xylen till pool i avsnittet vävnad som kommer att orsaka vävnad för att vara för mörkt.

7. valfri — Bild lagring

1. Placera torkade diabilder i enskilda 50 mL rör (en bild per rör) och Ställ i frysen-80 ° C i upp till 7 dagar.
   Obs: Bilder måste vara torrt innan i-80 ° C frysen. Använd inte torkmedel inuti röret som partiklar kommer att bädda in i vävnad och membran. Se till att röret GJP är tight; om så inte är fallet, kondens inträffar i bilden när upptining för användning.
   Varning: RNA integritet minskar efter 7 dagar, liksom kvaliteten på vävnad visualisering.

8. upptining lagras bilder för användning

1. Ta bort röret med en enstaka bild från frysen-80 ° C 1 h före avsedd användning.
2. Öppna inte röret omedelbart. Låt röret för att komma till rumstemperatur. Kondens uppstår på utsidan av röret bara.
3. När tuben har kommit till rumstemperatur och alla kondens är borta (cirka 30 – 40 min), ta av locket och exponera bilden till rumstemperatur luften.
4. Låt bilden anpassa sig till rumstemperatur för 15 – 20 min. lämna bilden inuti röret med locket tas bort.
   Obs: Bilden är nu klar för LCM.

9. laser Capture lokalt Purkinje celler:

Obs: Detta avsnitt av protokollet kommer endast att diskutera detaljerna relaterade till fånga Purkinje celler för efterföljande RNA-sekvensering. Det här avsnittet förutsätts att användaren är bekant med mikroskopet UV laser capture och anknutna programvara.

1. Ren Mikroskop scenen och samlingen cap arm med RNase decontaminator.
2. Med handskar på händerna, placera bilden på mikroskopet och 500 μL ogenomskinlig i samlingen armen.
   Obs: Alltid säkerställa korrekt RNA teknik genom rengöring arbetsområdet med RNase decontaminator och behandskade händer medan röra bilden eller ogenomskinlig. Handskar kan avlägsnas när luckan och cap är på plats och laser capture har påbörjats.
3. Vid låg förstoring, justera ogenomskinlig över lillhjärnan vävnad, se till att locket täcker hela området visualiseras i ögat bit.
   Obs: Endast ögat bit av mikroskopet visar om ogenomskinlig centreras. Kameran kommer inte att visas om den gemensamma jordbrukspolitiken är centrerad över vävnaden. Beroende laser fånga omfattningen design, kommer visualisering genom ogenomskinlig antingen vara i ögat bit endast eller visualiseras i både ögat bit och kamera.
4. Visualisera cerebellär lagren med 5 x - 10 x objektiv och placera markören över avsnittet där molekylära lagret granule cellager skär (det Purkinje cell-lagret).
5. Flytta till 40 X och visualisera Purkinje celler.
   Obs: Se figur 1 och figur 2 för exempel visualiseringar.
6. Börja fånga Purkinje celler.
   Obs: Att utföra RNA-sekvensering, minst 5 ng av RNA krävs. Ca 1600-2000 Purkinje celler leda tillräckligt RNA material för sekvensering. RNA kommer att vara stabil för upp till 8 h vid mikroskopet. Testa UV energi och UV fokus före samlingen säkerställa nivåer är korrekta. Över tiden, vävnaden kommer att fortsätta att torka ut och UV energi och UV fokus kan behöva ändras.

10. RNA Collection post LCM

1. Förbereda cell lysis bufferten (förbereda färska varje gång)
   1. Späd 2-merkaptoetanol i lyseringsbuffert på 1: 100 (10 μL:1 mL, respektive). Lyseringsbuffert (RLT) ges i Tabell för material (#14 och #15).
2. Tillsätt 50 μL lyseringsbuffert cell till ogenomskinlig, med locket uppåt. Stäng försiktigt röret över den gemensamma jordbrukspolitiken.
3. Lämna tuben upp och ned för 1 min.
4. Vortex röret för 30 s och sedan snabbt spinna lyseringsbuffert till botten av röret.
5. Öppna tuben och upprepa steg 10.2 – 10,4.
6. Placera röret som innehåller 100 μL lyseringsbuffert och RNA från-80 ° C frysen tills alla prover är färdig och klar för RNA-extraktion (Tabell för material #14).

Representative Results

Detta protokoll Detaljer stegen för att förbereda färska frysta postmortala mänsklig hjärnvävnad UV-LCM. Grundlig specifikationer och anteckningar ges för kryostaten skärning, eftersom det kan vara svårt att skära färska frysta hjärnvävnad med en hög grad av precision. Den viktigaste punkten att överväga är att färsk fryst vävnad är extremt kallt och kräver en betydande mängd tid anpassa sig till en kryostat varmare temperatur. Detta steg kan inte forceras, och det kan inte överskattas hur central detta steg ligger i framgång eller misslyckande i detta protokoll. Om vävnaden inte är beredda ordentligt på kryostaten, kommer att alla efterföljande försök att identifiera celler eller områden av intresse vara mycket svårt, om inte omöjligt.

Efter kryostaten snittning och tilldelade torktid är vävnaden redo för LCM. När visualisera vävnaden under mikroskopet, är cellular lagren av lillhjärnan väl synlig med 5 X och 10 X objektiv. Figur 1 visar representativa bilder av vävnad fast i etanol bara (figur 1A) och vävnad inkuberas i xylen efter etanol fixering (figur 1B). Vi testade noggrant olika etanol och xylen inkubationstider / temperaturer på förmågan att både fix och visualisera vävnaden. Om vävnaden inte är ruvade länge nog i xylen, kommer den resulterande bilden mer liknar figur 1A, i stället för figur 1B. Xylen inkubation orsaker vävnaden att bli mörkare och bättre skisserar cellulära lager än gör etanol ensam. När styckning på mikroskopet laser capture, krävs det 40 X-objektivet för att fånga endast Purkinje celler, och inte den omgivande vävnaden. Inkubation i xylen producerar hög kvalitet, morfologiskt intakt bild (figur 1D) jämfört med etanol fixering ensam (figur 1C).

För att ytterligare förbättra visualisering av vår vävnad, testade vi en ogenomskinlig täckglas förmåga. Andra UV-LCM-protokoll använder en flytande fyllda mössa av en 200 – 500 μL tub som löser upp vävnaden på kontakt. Flytande fyllda caps kan minska vävnad visualisering, orsakar den resulterande bilden vara granulat och skimrande under mikroskopet (figur 2A). Vävnaden visualisering genom ogenomskinlig (figur 2B) resultaten i en smidigare vävnad utseende som är mjukare och skarpare i form. Särskilt möjliggör den ogenomskinlig överdel insamling upp till 8 h utan behovet för ersättning. Representativa bilder av exciderad Purkinje celler vid låg effekt (figur 2C) och vid hög effekt (figur 2D, E) visar exakt avlägsnande av bara Purkinje cellkroppen. För referens, figur 2F visar en Luxol Fast blå / Hematoxylin och Eosin (LH & E) målat cerebellar cortex, som speciellt belyser de olika lagren av lillhjärnan och placeringen av de Purkinje cellerna på molekylära lager och granule cellen layer sammanställning.

Syftet med detta protokoll är att få hög kvalitet RNA för efterföljande RNA-sekvensering. Vi testade våra protokoll på sex olika postmortala mänskliga hjärnan prover, som varje genomgick tre dagar av LCM att samla 1500 – 2000 celler för RNA-extraktion. Cirka 6 – 8 h vid mikroskopet producerade 500 – 700 celler, som kombinerades sedan med de föregående dagar LCM produkterna före RNA-extraktion. Prover genomgick RNA-extraktion och var resuspended i 14 μL RNAse-fritt vatten (Tabell för material #14). Alla sex prover producerat högkvalitativa RNA, med RNA integritet nummer (RIN) ≥8 (figur 3A-F). Detta förfarande resulterade i RNA mängder 11,5 ng (figur 3A), 8,3 ng (figur 3B), 13,6 ng (figur 3C), 11,5 ng (figur 3D), 14,9 ng (figur 3E) och 26,9 ng (figur 3F). Att notera är att alla postmortala mänskliga hjärnan prover testades för RNA kvalitet före LCM (tabell 1). Om provet av ursprung har RNA nedbrytning, kommer LCM bara ytterligare försämra dess integritet.

Figur 1 : Cerebellär lager och Purkinje celler visualisering med och utan xylen behandling. Representativa bilder med och utan xylen efter etanol fixering och uttorkning. Molekylära lagret (ML) och granule cellager (GCL) är märkta. Purkinje celler är markerade med pilar. (A), 5 X representation av cerebellär lager visualisering utan xylen. Skalstapeln: 10 µm. (B), 5 X representation av cerebellär lager visualisering med xylen. Skalstapeln: 10 µm. (C) 40 X representation av cerebellär lager visualisering utan xylen. Skalstapeln: 1 µm. (D) 40 X representation av cerebellär lager visualisering med xylen. Skalstapeln: 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2 : Purkinje celler visualisering före och efter LCM. Representativa bilder på 40 X med xylen efter etanol fixering och uttorkning. I ML och GCL märks. Purkinje celler är markerade med pilar. (A) visualisering vid mikroskopet under vätska fylld cap på 40 x. Skalstapeln: 1 µm. (B) visualisering vid mikroskopet under ogenomskinliga samling cap på 40 X. Skalstapeln: 1 µm. (C), 5 X visualisering av lillhjärnan cortex visar exciderad Purkinje cellerna mellan ML och GCL. Skalstapeln: 10 µm. (D) 40 X visualisering av en Purkinje cell innan excision. Skalstapeln: 1 µm. (E) 40 X visualisering av framgångsrika Purkinje celler fånga. Skalstapeln: 1 µm. (F), 20 X representant LH & E målat lillhjärnan visar Purkinje celler organ med markerade pilar. Skalstapeln: 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3 : RNA kvalitetskontroll Bioanalyzer resultat av LCM prover. Paneler A-F visar representativa RNA kvalitetskontroll utläsningar. Varje panel är ett annat exempel som genomgick samma LCM process av fixation och visualisering med etanol och xylen endast. RNA integritet siffror (RIN) är alla > 8.0. Representativa koncentrationer [] resultatet i en avkastning på minst 5 ng av total-RNA. Alla prover var elueras i 14 µL RNAse-gratis vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov	RIN - avsnitt Prep	RIN - LCM	[RNA] - LCM	PMI-fryst
A	9,2	8,6	822 pg/µL	450 min
B	9,8	8	598 pg/µL	550 min
C	9,1	8,5	976 pg/µL	455 min
D	9,8	8,2	823 pg/µL	463 min
E	9,8	9,1	1069 pg/µL	1139 min
F	9,6	8,3	1923 pg/µL	1080 min

Tabell 1: Sammanfattning av RNA integritet . Prov nummer motsvarar de bioanalyzer resultat som presenteras i figur 3. Avsnitt förberedelserna utförs före LCM för att starta vävnad är av god kvalitet. Visas fryses den ursprungliga vävnaden RINs avsnitt preps, LCM RINs och koncentrationen av RNA från LCM, liksom postmortala intervallen till (PMI-frysta) för vävnader.

Discussion

Det protokoll som presenteras här är specifikt modifierad för att vara ett rostfritt tillvägagångssätt visualisera morfologiskt skilda vävnader för UV-LCM. Denna metod är utformad för att maximera RNA integritet för efterföljande direkt RNA-sekvensering, samtidigt som en förbättrad nivå av vävnad visualisering. Förmåga att skilja olika celltyper för capture, för att skapa den renaste befolkningen av celler som möjligt, är viktigt för att förstå olika molekylära profiler i mänskliga vävnader¹⁵. Inom ramen för detta protokoll, vävnad val är avgörande, eftersom användningen av antigen eller färgämne specifika reagens används inte och därför inte är lämplig för studier som kräver sådan differentiering. Medan detta är en begränsning av detta protokoll, den resulterande vävnad visualisering och RNA integritet är ganska överlägsna och upprätthålla relevansen i andra experimentella designer. Många andra protokoll finns att också använder alternativa färgning metoder specifikt för UV - och IR-LCM med avsikt att bevara RNA. Men de flesta andra metoder innehåller minst en färgning eller antigen specifika reagens^6,16,17, är utformade för att en cell eller organ typ (som inte är mänskliga obduktion vävnad)^{18,19, 20}, eller kräva specialiserade RNA-seq kit att förbättra integriteten²¹. Tolyloxi violett (Nissl) färgning är en populär färgämne som innehåller reagens som används i många protokoll, eftersom det fläckar kärnor i nervceller i hjärnan och orsakar minst mängd RNA nedbrytning⁶. Dock är den större Purkinje cellkärnan inte väl målat av tolyloxi violett, ger ingen signifikant nytta för att visualisera Purkinje celler. Ännu viktigare, identifierat vi endast en LCM studie i den litteratur som beskrivs insamling av mänskliga Purkinje celler, som är av stort intresse för studiet av cerebellär degenerativa och utvecklingsmässiga störningar. Denna studie målat frysta vävnader med tolyloxi violett och isolerade Purkinje celler med IR-LCM system. Prova RINs så lågt som 5 var använt men anses godtagbar för microarray analys²². Därför är detta den första protokoll-studien som är utformade för högkvalitativa RNA från Purkinje celler i postmortala mänskliga lillhjärnan censurerade via UV-LCM.

Stabiliteten av RNA i postmortala mänsklig vävnad är en välkänd hinder, som RNA-molekyler i cellerna omfattas av ganska naturliga förfall efter döden. Specifikt, har mRNA visat sig vara mest mottagliga till nucleolytic nedbrytning⁵. Kontroll av post mortem intervallet (PMI) är dags att frysning (PMI-frysta) ett mått som har visat vissa korrelation till RNA nedbrytning i vissa studier^23,24,25. Tabell 1 visar dock våra PMI-fryst intervall för de sex prover som visas i figur 3, som anger ingen relativ korrelation med PMI värden och RNA kvalitet. Därför, är det nödvändigt att utföra due diligence i Kontrollera RNA integritet före start ett laser fånga projekt. Om start provet RNA integritet är av låg kvalitet, blir den resulterande RNA från en LCM produkt ännu lägre kvalitet. När låg RNA integritet inte kan undvikas, kunde andra metoder för att förbättra RNA för sekvensering vara anställd utöver detta protokoll²¹. Särskilt, kan resurssnåla eller försämrat RNA leda till dämpad komplexitet och suboptimala resultat som ofta nödvändiggör ytterligare förstärkning steg. Tillägg av PCR-cykler för förstärkning har visat sig förstärka sekvenser ojämnt, samt skapa Läs dubbletter vid sekvensering^26,27. Utnyttjande av hög kvalitet RNA från LCM prover för sekvensering är därför mycket fördelaktiga.

Den visualisering metod använde i detta protokoll tungt beroende av användaren är expertis när du skär färsk fryst vävnad på ett kryostaten. Protokollet går in omfattande detalj om hur man bäst förbereda vävnaden för snittning och placera vävnaden i bilden. Dessa är utan tvekan de två mest kritiska steg i detta protokoll. Om vävnaden inte är acklimatiserad till kryostaten temperatur, inträffar fragmentering, som avsevärt försvårar morfologiska kvaliteten av vävnad. Fragmentering är resultatet av några potentiella problem; felsökning möjligheter inkluderar vänta längre för vävnaden komma till temperatur eller förändra den kryostaten OT eller CT till ett varmare område. När vävnaden har framgångsrikt skära och placerats på scenen, det är viktigt att orientera vävnaden och bilden ordentligt för att säkerställa alla vävnad passar i membranet och exakt kan plockas upp från scenen. När du försöker plocka upp vävnaden från kryostaten scenen, vävnaden måste vara kall, och bilden bör vara varm. Alternativa protokoll finns som rekommenderar för att kyla i bilden innan plocka upp vävnaden och värmde med ett finger över området av vävnad placering²⁸; dock i våra händer, detta ger inte någon fördel, och ofta orsakar svårigheter i att plocka upp vävnad och överdriven vävnad veck. Med en bild i rumstemperatur smälter vävnaden omedelbart vid kontakt med bilden. För att säkerställa en ren pickup, är det nödvändigt att vinkla bilden så att den kommer i kontakt med vävnaden på området membran men inte gått så långt att tryck på scenen själv. Membranet kommer att börja lossna från glasskiva om det berör scenen, som skadar membranet och gör laser fånga svårt. Om detta inträffar kommer det att märkas när LCM har börjat och kan inte ångras. Alternativ för felsökning är begränsade. om när som helst är det tänkt den membran eller bild har äventyrats, är det klokt att kassera. Det rekommenderas att praktiken färsk fryst vävnad snittning innan du startar ett projekt eller använder en patologi kärna som kan producera hög kvalitet vävnad snittning. Dock om använder en bastjänst, se till att korrekt RNA teknik följs för att förhindra RNase kontaminering. RNA kan lätt försämras när felaktig teknik används.

Vi har presenterat här en komplett metod för rostfritt visualisering av Purkinje celler i postmortala mänskliga lillhjärnan för UV-LCM. Vi har även inkluderat korrekt RNA Bevarandemetoder och tekniker för att säkerställa höga nivåer av RNA integritet. Detta protokoll är inte nödvändigtvis specifika någon en cell eller vävnadstyp men inte upprätthålla kravet på att regionen/cellen av intresse är morfologiskt kan särskiljas från omgivande stroma utan behov av antigen eller färgämne särskilt erkännande.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.