Summary
Este protocolo utiliza un enfoque libre de manchas para visualizar y aislar a las células de Purkinje en tejido fresco congelado del cerebelo humano post-mortem mediante microdisección de captura láser. El propósito de este protocolo es generar cantidades suficientes de ARN de alta calidad para secuenciación del RNA.
Abstract
Microdisección de captura láser (LCM) es una herramienta ventajosa que permite la acumulación de las células citológico o fenotípicamente pertinentes o regiones de tejidos heterogéneos. Producto capturado se puede utilizar en una variedad de métodos moleculares para proteínas, aislamiento de DNA o RNA. Sin embargo, la preservación del ARN del tejido de cerebro humano postmortem es especialmente desafiante. Técnicas de visualización estándar para LCM requieren histologic o procedimientos de tinción inmunohistoquímica que pueden degradarán RNA. Por lo tanto, hemos diseñado un protocolo de acero inoxidable para la visualización de LCM con la finalidad de preservar integridad de RNA en tejido de cerebro humano postmortem. La célula de Purkinje del cerebelo es un buen candidato para la visualización de acero inoxidable, debido a su tamaño y localización característica. La corteza cerebelosa tiene distintas capas que difieren en la densidad celular, lo que un buen arquetipo para identificar bajo el microscopio de alta magnificación. Las células de Purkinje son neuronas grandes, situadas entre la capa de células del gránulo, que es una red densamente celular de neuronas pequeñas, y la capa molecular, que es escasa en cuerpos de la célula. Gracias a esta arquitectura, el uso de acero inoxidable visualización es factible. Otros sistemas de órganos o células que imitan este fenotipo sería convenientes. El protocolo de acero inoxidable está diseñado para fijar tejido congelado con etanol y eliminar lípidos con xileno para mejorar la visualización morfológica bajo microscopia ligera de alta magnificación. Este protocolo no tiene en cuenta otros métodos de fijación y está diseñado específicamente para las muestras de tejido fresco congelado con una radiación ultravioleta (UV)-sistema LCM. Aquí, presentamos un protocolo completo para el seccionamiento y la fijación de tejido cerebeloso humano fresco congelado post mortem y la purificación del ARN de las células de Purkinje aisladas por UV-LCM, preservando calidad de RNA para la posterior secuenciación del RNA. En nuestras manos, este protocolo produce niveles excepcionales de visualización celular sin necesidad de coloración de los reactivos y rendimientos RNA con números altos de integridad de RNA (≥8) según sea necesario para los experimentos de perfilamiento transcripcionales.
Introduction
Microdissection de la captura del laser (LCM) es una herramienta de investigación valiosa que permite la separación de células patológico relevantes para la posterior evaluación molecular conducida. El uso de análisis moleculares en estas muestras de tejido heterogéneo y la correlación con datos clínicos y patológicos es un paso necesario en la evaluación de la significación traslacional de la investigación biológica1. Al analizar los datos de la expresión del gene del RNA, el uso de secciones congeladas del tejido es muy recomendable ya que permite excelente calidad de RNA como maximiza cantidad2. Se ha establecido bien que alta calidad y la cantidad de RNA son esenciales para datos significativos de la secuencia de RNA3. Sin embargo, cuando se utiliza RNA de tejido fresco congelado post mortem para LCM, degradación de RNA es un gran desafío, como ocurre inmediatamente a la muerte y su extensión está mediada por diversos factores asociados con el tejido colección método4,5 . Además, degradación de RNA se exacerba cuando se necesitan técnicas de tinción para reconocer detalles histologic e identificación de la célula. Especializado de tinciones, como la hematoxilina & eosina, tinción de Nissl, inmunofluorescencia e inmunohistoquímica son útiles para distinguir las células del estroma circundante pero han demostrado que degradan RNA y alterar la expresión de la transcripción perfiles6. Por lo tanto, nuestro laboratorio ha creado un protocolo inoxidable específicamente diseñado para preservar la RNA para los propósitos de la secuencia de RNA después de aislamiento de LCM de neuronas de Purkinje en cerebelo humano post-mortem.
En el proceso de tejido fresco congelado para LCM, el método de fijación variable puede afectar tejido y RNA integridad. La fijación con formol es estándar para la preservación morfológica, pero causas Cross-linking pueden fragmento de RNA e interferir con amplificación de RNA7. Fijación del etanol es una alternativa mejor para el aislamiento de RNA, ya que es un fijador coagulante que no induce el cross-linking1. Para mejorar la visualización de la morfología del tejido, xileno es la mejor opción, ya que elimina los lípidos de los tejidos. Sin embargo, se conocen limitaciones al utilizar xileno en LCM, como los tejidos pueden secarse y convertirse en frágiles causando fragmentación del tejido con láser captura7. Xileno es también una toxina volátil y debe ser manipulado correctamente en una campana de humos. Sin embargo, el xileno se ha demostrado para mejorar la visualización de tejido conservando también RNA integridad8. Por lo tanto, nuestro protocolo se centra en el uso de la fijación de etanol 70% y etanol deshidratación, seguido por incubación de xileno para claridad morfológica.
Es importante tener en cuenta los diferentes tipos de sistemas de Microdisección láser, como ha demostrado que difieren en la velocidad, precisión y calidad de RNA. El láser infrarrojo (IR) capture microdissection y los ultravioleta (UV) láser microhaz microdissection sistemas fueron ambas plataformas LCM novela que surgió casi al mismo tiempo8. El sistema IR-LCM emplea un "sistema de contacto" con una película termoplástica transparente colocada directamente en la sección del tejido y las células de interés selectivamente se adhieren a la película por impulsos de centrado de un laser del IR. Por otra parte, el sistema UV-LCM es un "sistema sin contacto", por el que un rayo láser enfocado corta las celdas o regiones de interés en el tejido; dependiendo de la configuración en dos plataformas comerciales actualmente disponibles que utilizan un diseño de microscopio invertido o vertical, tejido se adquiere en un dispositivo de recolección por una onda de presión inducida por láser que catapulta contra la gravedad o el tejido es recogida por gravedad, respectivamente. Ventajas significativas del sistema UV-LCM incluyen adquisición de celular más rápido, libre de contaminación la colección con el método de no contacto y disección más precisa debido a un mucho más pequeño laser viga diámetro9. Este protocolo fue diseñado específicamente para un sistema de UV-LCM y no ha sido probado en un sistema IR-LCM. En cualquier diseño de sistema UV-LCM, al acumular las células en la tapa de la colección, el uso de un cubreobjetos que mejora la claridad celular en microscopia no es conveniente, como las células sería incapaces de entrar en la tapa de la colección. Por lo tanto, para mejorar la visualización de tejido, probamos el uso de gorras de colección opaco, que están diseñados para actuar como un cubreobjetos para visualización microscópica en sistemas UV-LCM, contra tapas de colección llena líquido. Gorras de colección llena líquido pueden ser difícil, ya que el líquido está sujeto a evaporación y debe reemplazarse con frecuencia mientras trabajaba en el microscopio. Tiempo se convierte en un factor importante para la estabilidad del RNA, como el tejido capturado disuelve inmediatamente7.
Nuestro laboratorio estudia los cambios neuropathologic post mortem en el cerebelo de pacientes con temblor esencial (ET) y neurodegenerativos relacionados con trastornos del cerebelo. Hemos demostrado cambios morfológicos en las células de Purkinje que distinguen casos ET versus controles, incluyendo un número reducido de células de Purkinje, aumentaron de la regresión dendrítica y una variedad de cambios axonales, que nos lleva a postular que Purkinje degeneración celular es una característica biológica de base en ET patogenesia10,11,12,13. Transcripcional de perfiles se ha utilizado en muchas enfermedades neurológicas para explorar las bases moleculares subyacentes de los cambios degenerativos celulares. Sin embargo, pueden enmascarar la expresión de las transcripciones de baja abundancia o disminuir la detección de cambios moleculares que ocurren solamente en una pequeña población de afectados eficazmente perfiles transcripcionales de muestras heterogéneas, como las regiones de tejido cerebral, células, como células de Purkinje en la corteza cerebelosa. Por ejemplo, las células de Purkinje son ampliamente superados en número por las células del gránulo abundante en la corteza cerebelosa por aproximadamente 1: 3000; así, al objetivo eficazmente su transcriptoma requiere aislamiento específico de estas neuronas. La corteza cerebelosa está delineada por distintas capas que difieren en la densidad celular y el tamaño de la célula. Esta arquitectura celular es ideal para visualizar en una muestra de tejido congelado sin reactivos de tinción que contiene el tinte. En teoría, este protocolo también podría aplicarse a otros tipos de tejidos que tienen tejido distintivo similar organización.
Este protocolo fue diseñado para trabajar específicamente para visualización de células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem. Numerosos protocolos existen para la fijación, coloración visualización y RNA preservación de muchos tipos de tejidos para los propósitos de ambos LCM IR y UV. Cuando se contempla un diseño experimental para UV-LCM, individuos deben adaptar sus protocolos para adaptarse mejor a las necesidades y requisitos de inicio y fin de materiales. Aquí, se combinan muchos aspectos de diferentes protocolos de LCM para proporcionar un método mejorado para la visualización de las células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem sin necesidad de preparación de RNA de alta calidad para el transcriptoma de tinte que contiene reactivos de tinción secuencia.
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Protocol
Todas las muestras humanas utilizadas en este protocolo se han obtenido con consentimiento informado y han sido aprobadas por la Junta interna de revisión (IRB) en la Universidad de Columbia y la Universidad de Yale.
Nota: La totalidad de este protocolo debe seguir RNA estricto manejo de las directrices, por el que se utiliza siempre una mano enguantada, todas las superficies se limpian con un descontaminador de RNasa y todos los materiales de trabajo son RNA/DNA/nucleasa gratis.
1. prueba de integridad del ARN del tejido antes de LCM a partir
Nota: Pruebas de calidad de RNA pueden hacerse por varios métodos. Asegúrese de que el ARN de toda la sección es probado para prever un número representativo de RNA integridad (RIN) de la muestra.
- Seleccione cuidadosamente las muestras de tejido para su inclusión que caben dentro del parámetro del diseño experimental. Si el corte en el criostato, hacia paso 1.2. Si no es así, procesar según el tejido y pasar a paso 1.11.
-
Haz dos contenedores de hielo seco. El tamaño dependerá del número de muestras.
- En el primer contenedor de hielo seco, coloque un tubo de 2 mL de vacío, rotulado con el código de tejido.
Nota: Tarda 10 min para los tubos a congelar. Los tubos deben ser congelados antes de colocar el tejido en ellos; de lo contrario, el tejido se funde sobre la superficie del tubo. - En un segundo envase de hielo seco, coloque el tejido de un congelador de-80 ° C que requiere verificación de RNA.
- En el primer contenedor de hielo seco, coloque un tubo de 2 mL de vacío, rotulado con el código de tejido.
- Limpie el criostato. Ver paso 4.7 para detallado procedimiento de limpieza.
- Extirpar el tejido de hielo seco y cortar una pequeña sección de tejido con una navaja de Rnasa descontaminado. Tejidos deben ser aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamaño.
- Coloque un montón alto de aproximadamente 3 mm de la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto en un criostato 'chuck' y deje que se congele parcialmente. Luego, coloque el tejido en la parte superior el OCT — no empuje en OCT, simplemente Déjelo descansar en la parte superior.
- Una vez que se endurece la OCT, coloque el mandril con el tejido montado en el criostato corte brazo y posición delante de la hoja de criostato.
- Corte en secciones de 30 μm hasta que el tejido es uniforme.
- Cortar 300 micras del tejido y coloque en un tubo de 2 mL congelados. Coloque el tubo en hielo seco.
- Extirpar el tejido de 'chuck' y coloque en hielo seco hasta que esté listo para guardar.
- Repita los pasos 1.4 – 1.9 para todos los tejidos.
- Cuando haya completado todas las muestras, extraer RNA utilizando el kit de extracción de RNA proporcionado (Tabla de materiales #15). Un protocolo detallado se suministra con el kit de extracción de RNA. Siga todas las instrucciones incluyendo el paso opcional para secar la membrana del tubo de colección y de paso opcional para la digestión de la ADNsa (Tabla de materiales #16).
- Probar la integridad del ARN extraído a través de una evaluación de calidad equipo bioanalyzer14.
2. prepare antes a partir de seccionamiento para LCM
-
Limpie los soportes de diapositivas antes de cada ronda de tejido seccionado para LCM. Realizar el procedimiento de limpieza el día antes de su uso para permitir un completo secado durante la noche.
Nota: titulares de diapositivas se utilizan para la fijación de sección de tejido en etanol y claro en el xileno.- Deslice el soporte de procedimiento de limpieza: enjuagar con descontaminador de Rnasa seguido de dietil pirocarbonato tratado (DEPC) agua. Permita que seque durante la noche boca abajo sobre una superficie libre de RNA/DNA/nucleasa, evitando cualquier polvo u otra contaminación aerotransportada.
PRECAUCIÓN: DEPC es altamente tóxico y debe ser manejado y eliminado utilizando el protocolo estándar de productos químicos peligrosos EH & S.
- Deslice el soporte de procedimiento de limpieza: enjuagar con descontaminador de Rnasa seguido de dietil pirocarbonato tratado (DEPC) agua. Permita que seque durante la noche boca abajo sobre una superficie libre de RNA/DNA/nucleasa, evitando cualquier polvo u otra contaminación aerotransportada.
- Limpia las escobillas para seccionamiento con Rnasa decontaminator y deje que se seque durante la noche. Evitar el polvo y otros contaminantes.
- Coloque la membrana los portaobjetos bajo UV luz durante 30 min a temperatura ambiente. No no exponer que las diapositivas a los rayos UV más de 1 – 2 días antes de utilizar. Esto realza el atascamiento del tejido a la diapositiva de la membrana.
Nota: Paso 2.3 puede combinarse con el paso 4, que permite para slide tratamiento UV que se produzca en el mismo día como tejido seccionamiento (véase paso 4.4).
3. Preparar soluciones de fijación con agua libre de ARNasa y etanol de alta calidad
Nota: Todas las soluciones se preparan frescos para cada experimento. Asegúrese de que el titular diapositiva procedimiento de 1.1 paso de limpieza se ha completado. Todas las soluciones se preparan en los titulares de la diapositiva.
- Coloque 30 mL de etanol al 100% en soporte de diapositivas.
- Etanol diluido con agua libre de DNasa/Rnasa/nucleasa. Lugar 30 mL de etanol al 95% en una diapositiva titular y puesto en el hielo.
- Etanol diluido con agua libre de DNasa/Rnasa/nucleasa. Lugar 30 mL de etanol al 70% en una diapositiva titular y puesto en el hielo.
- Lugar 30 mL de xileno 100% en dos separar titulares de diapositiva y etiquetarlos como #1 y #2.
4. preparar el criostato para seccionamiento de tejidos
- Obtener un cubo de hielo en soluciones de etanol y un recipiente con hielo seco para el tejido.
PRECAUCIÓN: Hielo seco es extremadamente frío, use guantes de protección. No coloque hielo y hielo seco en el mismo recipiente. Diferentes temperaturas en el hielo y el hielo seco causará que forma juntos a una temperatura indeterminada. - Quitar el tejido del congelador de-80 ° C y en hielo seco para el transporte al criostato.
-
Configuración de criostato:
- Establezca el espesor de la sección 14 μm.
- Establezca el ajuste grueso 30 μm para preservar la cantidad de tejido.
- Para criostatos con doble cámara y muestra que las temperaturas, ajuste la temperatura de cámara (TC) a-18 ° C. Para criostatos con un ajuste, ajuste la temperatura a-17 ° C.
- Para criostatos con doble cámara y manteniendo la temperatura de la muestra, ajustar la temperatura del objeto (OT)-16 ° C.
Nota: El Antiguo Testamento debe ser más caliente que la CT para corte incluso. Si todavía es triturar el tejido, el OT puede ser aumentado a-15 ° C y la CT puede aumentarse a-18 ° C.
- Coloque el tejido en el criostato para por lo menos 20 minutos permitir que llegue a temperatura óptima.
Nota: Si el tejido no está a temperatura óptima, tritura al corte. No coloque el tejido en-20 ° C la noche anterior para preservar la integridad del RNA y para prevenir la formación de cristales de hielo. Permitir que el tejido tanto tiempo como sea necesario se equilibren a temperatura óptima para cortar sin problemas. Aplicación opcional de incubación diapositiva bajo UV puede ocurrir aquí (véase el paso 1.3). - Coloque el 'mandril' en el criostato para por lo menos 20 minutos permitir que bajara a la temperatura del criostato.
- Colocar las escobillas limpiamos en el criostato para por lo menos 20 minutos permitir que bajara a la temperatura del criostato.
-
Limpiar el criostato
- Limpiar el escenario con una mezcla 1:1 de Rnasa descontaminador y 70% etanol diluido con agua libre de nucleasa/DNA/RNA para evitar la congelación en el escenario.
- Limpiar un disco nuevo de criostato desechables con descontaminador de RNasa y colóquelos en el sujetador de la cuchilla en el escenario. Permiten por lo menos 20 minutos para que la hoja de criostato llegar a la temperatura del criostato.
- Limpiar la placa estabilizadora con descontaminador de RNasa y coloque en el escenario. Permiten por lo menos 20 min para la placa estabilizadora llegar a la temperatura del criostato.
Nota: Una placa anti-roll no es necesaria para el corte pero es muy recomendable. Si no hay una placa estabilizadora, un cepillo limpiado funciona como una alternativa. Si la placa estabilizadora no está a la temperatura correcta, el tejido derretirse o pegarse al corte.
5. seccionar el tejido
- Corte un pedazo pequeño de tejido (~ 1 cm x 1 cm) para el seccionamiento. Retomar el tejido restante congelador de hielo seco /-80 ° C.
Nota: Asegúrese que la sección del tejido corteza cerebelosa ~ 95%, donde se encuentran las células de Purkinje. - Coloque un montón alto de aproximadamente 3 mm de OCT para cubrir el 'chuck'. Iniciar con la construcción de las capas en la parte superior con un movimiento lento, circular, hasta que hay un pequeño montículo.
- Una vez que OCT es parcialmente congelada, pero todavía hay un poco de líquido en el centro, colocar el tejido en la parte superior OCT. No empuje el tejido profundamente en octubre permitir el tejido para sentarse encima de OCT hasta completamente congelado. Esto tomará 1 a 2 min.
- Lugar mandril con OCT congelado y el tejido en el brazo de corte criostato. Ajuste el tejido para que quede al ras con una cuchilla.
- Permitir que el tejido en el brazo de corte durante 15 – 20 min ajustar a la nueva temperatura.
Nota: Dependiendo del grosor del tejido, se necesita tiempo para la aclimatación de la temperatura. Permitir que el tejido se siente como necesaria para cortar limpiamente. Ajuste de OT y CT para ayudar con la aclimatación de temperatura del tejido. - Mueva lentamente el tejido más cercano a la hoja. Una vez que el tejido ha llegado a la hoja, iniciar el proceso de ajuste. Ajuste grueso debe ajustarse a 30 μm.
- Moldura x 2 – 3 hasta que las capas de la corteza son accesibles.
- Coloque y alinee la placa estabilizadora justo por encima de la hoja de criostato.
Nota: Aparecerá una línea de plata de la luz en el criostato en el interfaz de la hoja y placa estabilizadora. Esto indica la placa estabilizadora directamente sobre el borde de la hoja. - Comience a cortar las secciones 14 μm. Secciones debidamente cortadas será plana debajo de la placa estabilizadora.
Nota: Si el tejido está atrapado, asegúrese de que la placa estabilizadora es lo suficientemente fría. Si es necesario, colocar un pedazo de seco hielo en la voluntad (lado sin tocar el escenario) fuera rápidamente enfriar la placa estabilizadora. - Cortar secciones de 4 – 6 y alinearlas horizontalmente a través de la etapa de criostato.
- Pesca la diapositiva, recoger todas las piezas del tejido a la vez.
Nota: Con los cepillos, levante de los extremos del tejido para ser más fácilmente disponible de la diapositiva a recoger. No recoja una sección a la vez. Exposición a aire a temperatura ambiente degrada la integridad del RNA.
PRECAUCIÓN: No permita que la membrana táctil la etapa del criostato. Si la membrana toca el escenario, comienza a separarse de lo portaobjetos de vidrio y se producirán errores al tratar de LCM. - Inmediatamente pasar al paso 6. No se demore la fijación.
6. fijación del tejido/inoxidable visualización
- Inmediatamente hacia el protocolo de fijación de etanol
- Coloque el portaobjetos en el soporte de diapositiva con etanol al 70% por 2 min, en el hielo.
- Coloque el portaobjetos en el soporte de diapositiva con etanol al 95% para 45 s, en el hielo.
- Coloque el portaobjetos en el soporte de diapositivas con etanol al 100% por 2 min, a TA.
- Sumergir el portaobjetos 3 veces en el soporte de diapositivas con xileno 1 — a TA.
- Coloque el portaobjetos en el soporte de diapositivas con xileno 2 por 5 min, a TA.
- Dejar para secar en un área limpia para por lo menos 30 min seco tiempo óptimo, de hasta 60 min.
PRECAUCIÓN: Soporte de diapositivas para el secado en una campana de humos. Xileno es volátil. Colocación portaobjetos plano causará xileno a piscina en la sección de tejido, lo cual causará tejido a ser demasiado oscuro.
7. opcional: Almacenamiento de portaobjetos
- Coloque los portaobjetos secos en tubos individuales de 50 mL (una diapositiva por el tubo) y coloque en el congelador de-80 ° C durante 7 días.
Nota: Portaobjetos deben estar secos antes de colocar en el congelador de-80 ° C. Utilice el desecante dentro del tubo, las partículas se incruste en el tejido y membrana. Asegurar que la tapa del tubo es ajustada; Si no, condensación se producirá en la diapositiva cuando descongelar para su uso.
PRECAUCIÓN: Integridad del RNA disminuye después de 7 días, igual que la calidad de la visualización del tejido.
8. descongelación almacena diapositivas para uso
- Retire el tubo con una sola diapositiva del congelador de-80 ° C 1 h antes de uso.
- No abra inmediatamente el tubo. Deje el tubo a temperatura ambiente. Se producirá condensación en el exterior del tubo solamente.
- Una vez que el tubo ha llegado a la temperatura y condensación todo se ha ido (aproximadamente 30 – 40 min), retire la tapa y exponer la diapositiva a la temperatura ambiente.
- Permita que el portaobjetos se adapte a la temperatura ambiente durante 15-20 min dejar la corredera dentro del tubo con el tapón quitada.
Nota: Diapositiva está ahora lista para el LCM.
9. láser Microdissection de la captura de células de Purkinje:
Nota: Esta sección del Protocolo sólo discutir detalles específicos relacionados con la captura de las células de Purkinje para la posterior secuencia de RNA. Esta sección asume que el usuario está familiarizado con el microscopio de captura láser UV y el software de afiliados.
- Limpia la platina del microscopio y la colección de casquillo brazo con descontaminador de Rnasa.
- Con las manos enguantadas, coloque el portaobjetos en el microscopio y tapa opaca de 500 μL en el brazo de la colección.
Nota: Siempre asegurarse de adecuada técnica de RNA por limpiar el área de trabajo con descontaminador de RNasa y use las manos enguantadas mientras toca la diapositiva o la tapa opaca. Guantes pueden eliminarse una vez que la diapositiva y la tapa estén en su lugar y ha comenzado la captura del laser. - En la ampliación baja, alinee la tapa opaca sobre el tejido cerebeloso, asegurando que la tapa cubre toda la zona visualizada en el ocular.
Nota: Sólo el ocular del microscopio mostrará si se centra la tapa opaca. La cámara no se mostrará si la tapa está centrado sobre el tejido. Dependiendo del diseño de alcance captura láser, la visualización a través de la tapa opaca será en el pedazo de ojo único o visualizado en el ocular y la cámara. - Visualizar las capas cerebelosas con 5 x - 10 x objetivo y coloque el cursor sobre la sección donde cruzan (la capa de células de Purkinje) capa molecular y la capa de la célula del gránulo.
- Pasar a 40 X y visualizar las células de Purkinje.
Nota: Ver figura 1 y figura 2 para crear visualizaciones de datos de ejemplo. - Comenzar la captura de las células de Purkinje.
Nota: Para realizar la secuenciación del RNA, por lo menos 5 ng de ARN es necesario. Aproximadamente 1600 – 2000 Purkinje células producir suficiente material para la secuencia de RNA. RNA será estable por hasta 8 h en el microscopio. Prueba UV energía y foco UV antes de la recogida para garantizar los niveles son correctos. Con el tiempo, continuará el tejido se seque y la energía UV y UV enfoque deba ser cambiado.
10. RNA colección post LCM
-
Preparar el tampón de lisis celular (preparar fresca cada vez)
- Diluir 2-Mercaptoetanol en tampón de lisis en el 1: 100 (10 mL de μL:1, respectivamente). Tampón de lisis (RLT) se proporciona en la Tabla de materiales (#14 y #15).
- Añadir 50 μL de tampón de lisis de la célula a la tapa opaca, con la tapa hacia arriba. Cierre con cuidado el tubo encima de la tapa.
- Dejar el tubo boca abajo durante 1 minuto.
- Vórtice el tubo durante 30 s y girar rápidamente el tampón de lisis en la parte inferior del tubo.
- Abrir el tubo y repita los pasos 10.2-10.4.
- Coloque el tubo que contenía 100 μL de tampón de lisis y RNA del congelador de-80 ° C hasta que todas las muestras estén terminados y listos para la extracción de RNA (Tabla de materiales #14).
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Representative Results
Este protocolo describe los pasos para preparación de tejido de cerebro humano postmortem fresco congelado para UV-LCM. Anotaciones y especificaciones completa se dan para corte en criostato, ya que puede ser difícil cortar tejido cerebral congelado fresco con un alto grado de precisión. El punto más importante a considerar es que el tejido fresco congelado es extremadamente frío y requiere una cantidad significativa de tiempo para aclimatarse a la temperatura más caliente de un criostato. Este paso no puede ser apresurado, y no puede ser exagerado como este paso es en el éxito o fracaso de este protocolo. Si el tejido no está preparado adecuadamente en el criostato, todos los intentos posteriores de identificar las células o regiones de interés será muy difíciles, si no imposible.
Tras secciones de criostato y asignado tiempo de secado, el tejido está listo para LCM. Al visualizar el tejido bajo el microscopio, las capas celulares del cerebelo son fácilmente accesibles con 5 X y 10 X lentes del objetivo. Figura 1 muestra imágenes representativas del tejido fijados en etanol solamente (figura 1A) y los tejidos se incubaron en xileno posterior a la fijación de etanol (figura 1B). Rigurosamente probamos diferentes tiempos de incubación etanol y xileno / temperatura en la capacidad de ambos arregla y visualizar el tejido. Si el tejido se incuba no bastante en xileno, la imagen resultante asemeja más a figura 1A, en lugar de la figura 1B. Causas de incubación xileno el tejido más oscuro y mejor delinea las capas celulares que hace etanol solamente. Cuando corte al microscopio captura láser, la lente del objetivo 40 X es necesaria para asegurarse de capturar sólo las células de Purkinje y no los tejidos circundantes. Incubación en xileno produce una calidad de imagen morfológicamente intacto (figura 1D) en comparación con fijación de etanol solamente (figura 1C).
Para mejorar la visualización de nuestro tejido, probamos la capacidad de cubreobjetos de una tapa opaca. Otros protocolos de LCM UV utilizan un casquillo llenado líquido de un tubo de 200 – 500 μL que se disuelve el tejido en contacto. Tapas de llenado líquidos pueden reducir la visualización del tejido, haciendo que la imagen resultante sea granular e iridiscente bajo el microscopio (figura 2A). Visualización de tejido a través de los resultados de tapa opaca (figura 2B) en un aspecto de suavizante de tejido que es más suave y más en forma. En particular, la tapa opaca permite la colección hasta 8 h sin necesidad de recambio. Imágenes representativas de las células de Purkinje suprimidas en baja potencia (figura 2C) y alta potencia (figura 2D, E) muestran precisa remoción de sólo el cuerpo de la célula de Purkinje. Para referencia, figura 2F muestra un azul Luxol rápido / hematoxilina y eosina (LH & E) teñida corteza cerebelosa, donde destacan especialmente las diferentes capas del cerebelo y la colocación de las células de Purkinje en el molecular capa y célula del gránulo capa yuxtaposición.
El propósito de este protocolo es obtener alta calidad de RNA para la posterior secuencia de RNA. Probamos nuestro protocolo en seis muestras de cerebro humano de diferentes post-mortem que experimentó tres días de LCM para recoger células de 1500 – 2000 para la extracción de RNA. Aproximadamente 6-8 h en el microscopio había producido 500 – 700 células, que entonces fueron combinadas con los productos de LCM de días anteriores antes de la extracción de RNA. Muestras experimentaron la extracción de RNA y se resuspendió en 14 μL de agua libre de ARNasa (Tabla de materiales #14). Todas las muestras de seis producen ARN de alta calidad, con RNA integridad números (RINs) ≥8 (figura 3A-F). Este procedimiento dio lugar a cantidades de RNA de 11.5 ng (figura 3A), 8.3 ng (figura 3B), 13.6 ng (figura 3C), 11.5 ng (figura 3D), 14.9 ng (figura 3E) y 26,9 NG (figura 3F). Es de destacar que todas las muestras de cerebro humano postmortem fueron probadas para la calidad del RNA antes de LCM (tabla 1). Si la muestra de origen tiene degradación de RNA, LCM degradará más su integridad.
Figura 1 : Visualización de células de Purkinje con y sin tratamiento de xileno y capas cerebelosas. Imágenes representativas con y sin xileno tras fijación de etanol y la deshidratación. La capa molecular (ML) y la capa de la célula del gránulo (GCL) se etiquetan. Las células de Purkinje están marcadas con flechas. (A) 5 X representación de visualización de la capa cerebelosa sin xileno. Barra de escala: 10 μm. (B) 5 X representación de visualización de la capa cerebelosa con xileno. Barra de escala: 10 μm. (C) 40 X representación de visualización de la capa cerebelosa sin xileno. Barra de escala: 1 μm. (D) la representación de X a 40 de visualización de la capa cerebelosa con xileno. Barra de escala: 1 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Célula de Purkinje visualización antes y después de LCM. Imágenes representativas a 40 X con xileno tras fijación de etanol y la deshidratación. El ML y el GCL se etiquetan. Las células de Purkinje están marcadas con flechas. (A) visualización en el microscopio bajo líquido llena tapa de 40 x. Barra de escala: 1 μm. (B) visualización en el microscopio bajo colección opaco tapa a 40 X. Barra de escala: 1 μm. (C) 5 X visualización de la corteza cerebelosa que muestra las células de Purkinje suprimidas entre el ML y el GCL. Barra de escala: 10 μm. (D) 40 X visualización de una célula de Purkinje antes de la supresión. Barra de escala: 1 μm. (E) la visualización de X a 40 de la captura exitosa de células de Purkinje. Barra de escala: 1 μm. (F) 20 X representante LH & E tinción de cuerpos de la célula de Purkinje de cerebelo mostrando con flechas marcadas. Barra de escala: 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Muestras de RNA Control de calidad equipo Bioanalyzer resultados de LCM. Paneles A-F mostrar lecturas de control de calidad de representante de RNA. Cada panel es una muestra diferente que experimentó el mismo proceso de LCM de fijación y visualización con etanol y xileno solo. Números de integridad del RNA (RINs) son todos > 8.0. Concentraciones representativas [] dan como resultado un rendimiento de al menos 5 ng de RNA total. Todas las muestras se eluyeron en 14 μl de agua libre de ARNasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | RIN - sección Prep | RIN - LCM | [RNA] - LCM | PMI-congelado |
| A | 9.2 | 8.6 | 822 pg/μl | 450 min |
| B | 9.8 | 8 | 598 pg/μl | 550 min |
| C | 9.1 | 8.5 | 976 pg/μl | 455 min |
| D | 9.8 | 8.2 | 823 pg/μl | 463 min |
| E | 9.8 | 9.1 | 1069 pg/μl | 1139 min |
| F | 9.6 | 8.3 | 1923 pg/μl | 1080 min |
Tabla 1: Resumen de la integridad del ARN . Muestra números corresponden a los resultados de equipo bioanalyzer presentados en la figura 3. Preparaciones de sección se realizan antes de LCM para que a partir de tejido sea de buena calidad. Muestra son el tejido original RINs de sección preparaciones, RINs de LCM y la concentración de RNA de LCM, así como los intervalos post mortem a congelado (PMI-congelado) para los tejidos.
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Discussion
El protocolo presentado aquí es modificado específicamente para un enfoque inoxidable en visualizar morfológicamente distintos tejidos para UV-LCM. Este método está diseñado para maximizar la integridad del RNA para la posterior secuencia de RNA directa, manteniendo un mayor nivel de visualización de tejido. La capacidad de distinguir diferentes tipos de células para la captura, para crear la población pura de células posible, es esencial para la comprensión de diferentes perfiles moleculares en los tejidos humanos15. En el marco del presente Protocolo, selección de tejido es de suma importancia, como el uso de antígeno o colorante reactivos específicos no son utilizados y por lo tanto no es adecuados para estudios que requieren dicha diferenciación. Mientras que esto es una limitación del presente Protocolo, la visualización de tejido resultante y la integridad de RNA son muy superiores y mantienen relevancia en otros diseños experimentales. Muchos otros protocolos hay que utilizar también otros métodos de tinción específicamente para UV - y IR-LCM con la intención de preservar RNA. Sin embargo, la mayoría de los otros métodos contienen al menos una coloración o antígeno reactivo específico6,16,17, están diseñados para un tipo de célula u órgano (que no son tejidos de autopsia humana)18,19, 20, o requieren kits especializados de RNA-seq para mejorar integridad21. La coloración violeta de cresilo (Nissl) es un tinte popular que contiene el reactivo utilizado en muchos protocolos, ya que tiñe los núcleos de las neuronas en el cerebro y causa el mínimo de degradación de RNA6. Sin embargo, el mayor núcleo de la célula de Purkinje no se tiñe bien por violeta de cresilo, no proporcionar ningún beneficio significativo para la visualización de las células de Purkinje. Lo importante, se identificó sólo un estudio de LCM en la literatura que describe la colección humanas de células de Purkinje, que son de considerable interés para el estudio de los trastornos degenerativos y desarrollo cerebelosos. Este estudio teñidos los tejidos congelados con violeta de cresilo y aislado de las células de Purkinje con un sistema de IR-LCM; muestra tan bajos como 5 fueron utilizados pero considerado aceptable para el análisis de microarray22de RINs. Por lo tanto, este es el primer estudio de protocolo que está diseñado específicamente para alta calidad ARN de las células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem suprimido vía UV-LCM.
La estabilidad del RNA en tejido humano post-mortem es un obstáculo bien conocido, como moléculas de ARN en las células están muy sujetas a descomposición natural después de la muerte. Específicamente, mRNA ha demostrado ser la más susceptible a la degradación de nucleolytic5. Control del intervalo post mortem (PMI) tiempo para congelar (congelado de PMI) es una métrica que ha mostrado cierta correlación a la degradación del RNA en algunos estudios23,24,25. Sin embargo, la tabla 1 muestra nuestros intervalos de PMI-congelados para las seis muestras que se muestra en la figura 3, que no indica correlación relativa con valores PMI y la calidad de RNA. Por lo tanto, es necesario realizar diligencia en la comprobación de integridad del RNA antes de iniciar un proyecto de captura de láser. Si la integridad del RNA de la muestra inicial es de baja calidad, el ARN resultante de un producto de LCM serán de calidad aún más baja. Cuando baja integridad del RNA no se puede evitar, podrían emplearse otros métodos para mejorar RNA para secuenciación además este protocolo21. En particular, bajos insumos o degradado el RNA puede llevar a complejidad apagado y resultados subóptimos que a menudo requieren pasos de amplificación adicional. La adición de ciclos PCR para la amplificación se ha demostrado para amplificar secuencias desigual, así como crear duplicados leerlas sobre secuenciación26,27. Por lo tanto, la utilización de ARN de alta calidad de las muestras de LCM para la secuencia es altamente ventajosa.
El método de visualización empleado pesadamente en este protocolo se basa en el usuario de conocimientos cuando corte fresco congelado tejido en un criostato. El protocolo entra en gran detalle sobre cómo mejor preparar el tejido para seccionamiento y coloque el tejido en la diapositiva. Sin duda son los dos pasos más críticos de este protocolo. Si el tejido no está aclimatado a la temperatura de criostato, trituración se producirá, que dificulta notablemente la calidad morfológica de los tejidos. Destrucción es el resultado de algunos problemas potenciales; posibilidades de solución de problemas incluyen espera más tiempo para el tejido a temperatura o alterar el criostato OT o CT a una gama más caliente. Una vez el tejido ha sido exitosamente corte y colocado en el escenario, es importante orientar el tejido y la diapositiva sea todo el tejido se ajusta dentro de la membrana y puede recogerse con precisión de la etapa. Al intentar recoger el tejido de la etapa de criostato, el tejido debe ser frío, y la diapositiva debe ser caliente. Protocolos alternativos existen que recomendamos para enfriar el portaobjetos antes de recoger el tejido y calentado con un dedo sobre la zona de colocación de tejido28; sin embargo, en nuestras manos, esto no proporciona ningún beneficio y a menudo causa dificultad para recoger el tejido y el exceso de tejido pliegues. Con una diapositiva en la temperatura ambiente, el tejido se deshace inmediatamente al entrar en contacto con la corredera. Para garantizar una recogida limpia, es necesario al ángulo de la diapositiva para que entra en contacto con el tejido en el área de la membrana pero no ir tan lejos como para tocar la etapa sí mismo. La membrana comienza a separar del portaobjetos de cristal si toca la etapa, que daña la membrana y hace difícil captura del laser. Si esto ocurre, será notable una vez LCM ha comenzado y no se puede deshacer. Opciones de resolución de problemas son limitados; Si en cualquier momento se piensa la membrana o diapositivas han sido comprometidos, es conveniente descartar. Es aconsejable practicar seccionamiento tejido fresco congelado antes de empezar un proyecto o utilizando un núcleo de la patología que puede producir el seccionamiento de tejidos de alta calidad. Sin embargo, si utiliza un servicio de base, asegúrese de que la técnica adecuada de RNA es seguida para evitar contaminación con ARNasas. Degradación de RNA puede ocurrir fácilmente cuando se utiliza una técnica inadecuada.
Hemos presentado aquí un método completo para inoxidable visualización de células de Purkinje en el cerebelo humano post-mortem a efectos de la UV-LCM. También hemos incluido métodos adecuados de preservación de RNA y técnicas para asegurar altos niveles de integridad del RNA. Este protocolo no es necesariamente específico a cualquier uno celular o tipo de tejido pero no mantener el requisito de que la región de la célula de interés es morfológicamente distinguible del estroma circundante sin necesidad de reconocimiento específico de antígeno o tinte.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el cerebro Nueva York Banco, Dr. Jean Paul Vonsattel y Dr. Etty Cortés, por su asistencia en la corte y la preservación de las muestras de tejido de cerebro humano congelado para estos experimentos. Los autores desean reconocer las personas que generosamente donaron sus cerebros para la investigación continua en temblor esencial. Dr. Fausto y Dr. Martuscello agradece a Columbia University Departamento de patología y biología de la célula por su continuo apoyo y espacio de investigación de base. Los autores desean reconocer los NIH R01 NS088257 Louis/Fausto) de financiación de la investigación para este proyecto. Imágenes de LCM se realizaron en el Confocal y especializados microscopía compartido recursos del centro Herbert Irving integral cáncer en la Universidad de Columbia, apoyado por los NIH grant #P30 CA013696 (Instituto Nacional del cáncer). Los autores desean reconocer Theresa Swayne y Laura Munteanu su asistencia continua con microscopia especializada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MembraneSlide NF 1.0 PEN | Zeiss | 415190-9081-000 | Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides. |
| AdhesiveCap 500 Opaque | Zeiss | 415190-9201-000 | Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work. |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation. |
| Xylenes (Certified ACS) | Fisher Scientific | X5P-1GAL | If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization. |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only. |
| Slide-Fix Slide Jars | Evergreen | 240-5440-G8K | Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning. |
| Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm | Leica Biosystems | 14041933980 | Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements. |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758-50mL | DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat. |
| Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'. |
| Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades | Thermo Scientific | 4280L | Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements. |
| Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS | Fisher Scientific | NC0558768 | Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable. |
| RNeasy Micro Kit (50) | Qiagen | 74004 | Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap. |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues. |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh. |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-100ML | Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity. |
| Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL) | Fisher Scientific | 22-010-092 | Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do. |
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