Um protocolo de aço inoxidável para isolamento de RNA de alta qualidade do Laser capturar células de Microdissected Purkinje no cerebelo humano Post Mortem

Summary

Este protocolo utiliza uma abordagem de mancha-livre para visualizar e isolar as células de Purkinje no tecido fresco congelado do cerebelo humano post mortem através do laser microdissection de captura. O propósito do presente protocolo é gerar quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para a sequenciação do ARN.

Abstract

Captura de laser microdissection (LCM) é uma ferramenta vantajosa que permite a recolha de células tumorais e/ou fenotipicamente relevantes ou regiões de tecidos heterogêneas. Capturado do produto pode ser usado em uma variedade de métodos moleculares para proteína, isolamento de DNA ou RNA. No entanto, a preservação do RNA do tecido do cérebro humano após a morte é especialmente desafiador. Técnicas de visualização padrão para LCM exigem histológica ou procedimentos de coloração imuno-histoquímica que ainda podem degradam o RNA. Portanto, nós projetamos um protocolo de aço inoxidável para visualização no LCM com a finalidade de preservar a integridade do RNA no tecido do cérebro humano de post-mortem. A célula de Purkinje do cerebelo é um bom candidato para visualização de aço inoxidável, devido ao seu tamanho e localização característica. O córtex cerebelar tem camadas distintas que diferem em densidade celular, tornando-os um bom arquétipo para identificar sob microscopia de alta ampliação. Células de Purkinje são grandes neurônios situados entre a camada de células grânulo, que é uma rede densamente celular de pequenos neurônios, e a camada molecular, que é escassa em corpos celulares. Por causa dessa arquitetura, o uso de visualização de aço inoxidável é viável. Outros sistemas do órgão ou célula que imitam este fenótipo também seria adequados. O protocolo de aço inoxidável é projetado para reparar o tecido fresco congelado com etanol e remover os lipídios com xilol para uma melhor visualização morfológica sob microscopia de luz de alta ampliação. Este protocolo não leva em conta outros métodos de fixação e é projetado especificamente para amostras de tecido fresco congelado capturadas usando uma radiação ultravioleta (UV)-sistema de LCM. Aqui, apresentamos um protocolo completo para corte e fixação tecido cerebelar humano fresco congelado post-mortem e purificação de RNA a partir de células de Purkinje isoladas por UV-LCM, preservando a qualidade do RNA para subsequente-a sequenciação do ARN. Em nossas mãos, este protocolo produz níveis excepcionais de visualização celular sem a necessidade de coloração reagentes e produz RNA com números elevados de integridade do RNA (≥ 8) conforme necessário para experimentos de perfil transcricionais.

Introduction

Do laser captura microdissection (LCM) é uma ferramenta valiosa pesquisa que permite a separação das células patologicamente relevantes para posterior avaliação molecularmente orientada. O uso de análises moleculares nestes espécimes de tecido heterogêneo e a correlação com dados clínicos e patológicos é um passo necessário na avaliação o significado translacional de pesquisa biológica¹. Ao analisar dados da expressão do gene do RNA, o uso de seções do tecido congelado é altamente recomendado pois permite excelente qualidade de RNA bem como maximizada quantidade². Tem sido bem estabelecida que alta qualidade e a quantidade de RNA são essenciais para dados significativos de sequenciamento de RNA³. No entanto, quando usando o RNA do tecido fresco congelado post-mortem para LCM, degradação de RNA é um grande desafio, como ocorre imediatamente após a morte e sua extensão é mediada por diversos fatores associados com o tecido coleção método^4,5 . Além disso, degradação de RNA é agravada quando as técnicas de coloração são necessários para reconhecer detalhes histológicos e identificação de célula. Especializou-se de técnicas, como a hematoxilina & eosina, Nissl mancha, de coloração imunofluorescência e imunohistoquímica são úteis na diferenciação de células do estroma circundante, mas têm sido mostrados para degradar o RNA e alterar a expressão de transcrição perfis de⁶. Portanto, nosso laboratório criou um protocolo inoxidável projetado especificamente para preservar o RNA no cerebelo humano post mortem para fins de sequenciação do ARN, após isolamento de LCM de neurônios de Purkinje.

No processamento de tecido congelado fresco para o LCM, o método de fixação variàvel pode afetar a integridade tanto do RNA e tecido. Fixação de formalina é padrão para preservação morfológica, mas causas do cross-linking que podem fragmentar o RNA e interferir de amplificação do RNA⁷. Fixação de etanol é uma alternativa melhor para o isolamento de RNA, como é um hemostático fixador que não induz a do cross-linking¹. Para melhorar a visualização da morfologia do tecido, xileno é a melhor escolha, como ele remove lipídios do tecido. No entanto, existem conhecidas limitações quando utilizando o xileno no LCM, como os tecidos podem secar e tornar-se frágil causando fragmentação de tecido em cima do laser captura⁷. Xileno também é uma toxina volátil e deve ser manuseado corretamente em uma coifa. Não obstante, xileno foi mostrado para melhorar a visualização do tecido preservando também RNA integridade⁸. Portanto, nosso protocolo centros em torno do uso de fixação de etanol 70% e desidratação do etanol, seguido de incubação xileno para clareza morfológica.

É importante observar os diferentes tipos de sistemas baseados em laser microdissection, como eles têm sido mostrados para diferem em velocidade, precisão e qualidade do RNA. O laser de infravermelho (IR) capturar microdissection e os sistemas de microdissection microbeam de laser ultravioletas (UV) foram as duas plataformas de LCM romance que surgiu quase simultaneamente⁸. O sistema IR-LCM emprega um sistema de"contacto" usando um filme termoplástico transparente colocado diretamente na seção de tecido, e as células de interesse seletivamente aderirem ao filme por pulsos de concentrado de um laser de IR. Alternativamente, o UV-LCM é um sistema "non-contact" no qual um feixe de laser focalizado corta fora as células ou regiões de interesse no tecido; dependendo da configuração em duas plataformas comerciais atualmente disponíveis que usam qualquer um microscópio invertido ou vertical design, tecido é adquirido em um dispositivo de recolha por uma onda de pressão induzida por laser que catapulta-lo contra a gravidade ou tecido é coletados por gravidade, respectivamente. Vantagens significativas do sistema UV-LCM incluem aquisição de celular mais rápida, coleção livre de contaminação com a abordagem de não-contato e dissecação mais precisa devido a um muito menor laser feixe diâmetro⁹. Este protocolo foi projetado especificamente para um sistema de UV-LCM e não foi testado em um sistema de IR-LCM. Em qualquer projeto de sistema de UV-LCM, quando acumuladas células na PAC coleção, o uso de uma lamela que aumenta a clareza celular durante a microscopia não é apropriada, como as células seriam incapazes de entrar o cap de coleção. Portanto, para melhorar a visualização do tecido, testamos o uso de tampões de coleção opaco, que são projetados para agir como uma lamela para visualização microscópica em sistemas UV-LCM, contra tampões coleção cheia de líquido. Tampões de coleção cheia de líquido podem ser um desafio, como o líquido está sujeito a evaporação e deve ser substituído frequentemente enquanto estiver trabalhando no microscópio. Tempo torna-se um fator importante para a estabilidade do RNA, como o tecido capturado imediatamente dissolve⁷.

Nosso laboratório estuda as alterações post-mortem de contrair no cerebelo dos pacientes com tremor essencial (ET) e doenças neurodegenerativas relacionadas do cerebelo. Temos demonstrado alterações morfológicas centradas nas células de Purkinje que distinguem ET casos versus controles, incluindo um número reduzido de células de Purkinje, aumentaram dendrítica regressão e uma variedade de alterações axonal, levando-na postular que Purkinje degeneração celular é um recurso biológico núcleo ET patogênese^10,11,12,13. Perfil transcricional serviu em muitas doenças neurológicas para explorar a base molecular subjacente de alterações degenerativas do celulares. No entanto, perfis transcriptional de amostras heterogêneas, como regiões de tecido do cérebro, podem efetivamente mascarar a expressão de transcritos de baixa abundância e/ou diminuir a detecção de alterações moleculares que ocorrem apenas em uma pequena população de afetados células, como células de Purkinje do córtex cerebelar. Por exemplo, células de Purkinje são vastamente em desvantagem pelas células grânulo abundantes no córtex cerebelar por aproximadamente 1:3000; assim, para efetivamente alvo seu transcriptome exige isolamento específico destes neurônios. O córtex cerebelar é delineado por camadas distintas que diferem em densidade celular e tamanho da célula. Essa arquitetura celular é ideal para visualizar em uma amostra de tecido fresco congelado sem tintura contendo reagentes de coloração. Em teoria, este protocolo também poderia ser aplicado a outros tipos de tecidos que têm tecido característico semelhante organização.

Este protocolo foi projetado para trabalhar especificamente para visualização de células de Purkinje no cerebelo humano post mortem. Inúmeros protocolos existem para a fixação, de coloração, para efeitos de ambos os IR - e UV-LCM, visualização e preservação de RNA de muitos tipos de tecidos. Quando contemplando um projeto experimental para UV-LCM, indivíduos devem adaptar seu protocolo para melhor atender as necessidades e requisitos da inicial e final de materiais. Aqui, nós combinamos muitos aspectos dos diferentes protocolos de LCM para fornecer um método aprimorado para a visualização de células de Purkinje no cerebelo humano sem a necessidade de corante contendo reagentes coloração para preparar RNA de alta qualidade para transcriptome post-mortem sequenciamento.

Protocol

Todas as amostras humanas utilizadas neste protocolo foram obtidas com consentimento informado e foram aprovadas pelo interno Review Board (IRB), na Universidade de Columbia e Yale University.

Nota: A totalidade do presente protocolo deve seguir rigoroso RNA manipulação orientações, por meio de que uma mão enluvada sempre é usada, todas as superfícies são limpas com uma desinfecção de RNase e todos os materiais de trabalho são de RNA/DNA/Nuclease livre.

1. teste a integridade do RNA do tecido antes de começar a LCM

Nota: Teste de qualidade de RNA pode ser feito por vários métodos. Certifique-se de que o RNA da seção inteira é testado para fornecer um número representativo de integridade do RNA (RIN) para a amostra.

1. Selecione cuidadosamente as amostras de tecido para a inclusão que se encaixam dentro do parâmetro do design experimental. Se cortar no criostato, mova-se para a etapa 1.2. Se não, processar o tecido em conformidade e mover a passo 1.11.
2. Pegue dois recipientes de gelo seco. O tamanho vai depender do número de amostras.
   1. No primeiro recipiente de gelo seco, coloque um tubo vazio, etiquetado 2ml com o código do tecido.
      Nota: Leva 10 min para os tubos congelar. Os tubos devem ser congelados antes de colocar o tecido neles; caso contrário, o tecido vai derreter a superfície do tubo.
   2. Em um segundo recipiente de gelo seco, coloque o tecido de um freezer-80 ° C que requer verificação de RNA.
3. Limpe o criostato. Veja passo 4.7 para detalhadas do procedimento de limpeza.
4. Remova o tecido de gelo seco e cortar uma parte pequena do tecido com uma lâmina de barbear de RNase descontaminado. Tecido deve ser de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamanho.
5. Coloque um monte de elevado aproximadamente 3 mm da temperatura de corte ideal (OCT) composto em um criostato 'chuck' e deixe congelar parcialmente. Em seguida, coloque o tecido em cima da OCT — não empurrar em OCT, simplesmente deixe-a descansar em cima.
6. Quando OCT endurece, coloque o chuck com o tecido montado no braço de corte criostato e posição na frente da lâmina do criostato.
7. Apare a 30 μm seções até que o tecido é o mesmo.
8. Corte a 300 μm da tecido e coloque em um tubo congelado 2 mL. Coloque o tubo de volta em gelo seco.
9. Retire o tecido do 'chuck' e coloque volta em gelo seco até estar pronto para guardar.
10. Repita as etapas de 1,4-1,9 para todos os tecidos.
11. Uma vez que todas as amostras estão completas, extraia o RNA usando o kit de extração de RNA fornecido (Tabela de materiais #15). Um protocolo detalhado é fornecido com o kit de extração de RNA. Siga todas as instruções que incluindo a etapa opcional para secar a membrana do tubo de coleta e a etapa opcional para a digestão de DNase (Tabela de materiais #16).
12. Teste a integridade do RNA extraído através de uma avaliação de qualidade bioanalyzer¹⁴.

2. preparar antes de começar corte para LCM

1. Limpe os suportes de slides antes de cada rodada de corte de tecido para o LCM. Execute o procedimento de limpeza o dia antes da utilização para permitir a completa secagem durante a noite.
   Nota: suportes de lâmina são utilizados para fixação de secção de tecido em etanol e compensação em xilol.
   1. Deslize o titular procedimento de limpeza: enxaguar com desinfecção RNase seguida de dietilo pyrocarbonate Tratado (DEPC) água. Deixe secar durante a noite de cabeça para baixo em uma superfície livre de RNA/DNA/Nuclease, evitando qualquer poeira ou outros elementos de contaminação atmosférica.
      Atenção: DEPC é altamente tóxico e deve ser tratado e eliminado do uso de EH & S protocolo padrão produtos químicos perigosos.
2. Limpar as escovas para corte com RNase decontaminator e deixe secar durante a noite. Evite toda a poeira e outros contaminadores.
3. Coloque as lâminas de membrana sob UV luz por 30 min à temperatura ambiente. Fazer não exponha que os slides para UV mais de 1 – 2 dias antes de usam. Isso aumenta a ligação do tecido para o slide de membrana.
   Nota: Etapa 2.3 pode ser combinada com o passo 4, que permite o tratamento UV para ocorrer no mesmo dia que o tecido corte (ver passo 4.4) slide.

3. Preparar soluções de fixação com água livre de RNase e etanol de alta qualidade

Nota: Todas as soluções são preparadas fresco para cada experimento. Certifique-se de que o titular de slide limpeza procedimento de etapa 1.1 é concluído. Todas as soluções são preparadas em suportes de lâmina.

1. Coloque 30 mL de etanol a 100% no suporte de um slide.
2. Etanol diluído com água livre de RNase/DNase/Nuclease. Lugar 30 mL de etanol a 95% em um slide titular e colocar no gelo.
3. Etanol diluído com água livre de RNase/DNase/Nuclease. Lugar 30 mL de etanol a 70% em um slide titular e colocar no gelo.
4. Lugar 30 mL de xileno 100% em dois suportes de lâmina de separar e classificá-los como #1 e #2.

4. prepare o criostato para seccionamento de tecido

1. Pegue um balde de gelo para soluções de etanol e um recipiente com gelo seco para o tecido.
   Atenção: Gelo seco é extremamente frio, portanto, use luvas de proteção. Não coloque gelo e gelo seco no mesmo recipiente. Diferentes temperaturas no gelo e gelo seco causará-los para formar juntos a uma temperatura indeterminada.
2. Retire o tecido do congelador-80 ° C e lugar em gelo seco para o transporte para o criostato.
3. Configurações do criostato:
   1. Defina a espessura de corte de 14 μm.
   2. Defina a espessura de guarnição para 30 μm para preservar a quantidade de tecido.
   3. Para criostatos com câmara dupla e espécime mantendo temperaturas, definir a temperatura da câmara (CT) de-18 ° C. Para criostatos com uma configuração, defina a temperatura de-17 ° C.
   4. Para criostatos com câmara dupla e espécime mantendo a temperatura, regule a temperatura do objeto (OT)-16 ° c.
      Nota: O OT precisa ser mais quente que o CT para garantir o mesmo corte. Se o tecido ainda tá arrebentando, OT pode ser aumentada para-15 ° C e o CT pode ser aumentada a-18 ° C.
4. Coloque o tecido em criostato pelo menos 20 min permitir para vir à temperatura ideal.
   Nota: Se o tecido não é a temperatura ideal, isso vai destruir após corte. Não coloque o tecido em-20 ° C na noite anterior para preservar a integridade do RNA e para evitar a formação de cristais de gelo. Permitir que o tecido tanto tempo como necessário para equilibrar a temperatura ideal para cortar sem problemas. Aplicação opcional de incubação slide sob UV pode ocorrer aqui (veja etapa 1.3).
5. Coloque o 'chuck' em criostato pelo menos 20 min permitir para descer a temperatura do criostato.
6. Coloque as escovas limpas no criostato pelo menos 20 min permitir para descer a temperatura do criostato.
7. Limpar o criostato
   1. Limpe o palco com uma mistura 1:1 de álcool etílico de desinfecção e 70% de RNase diluído com água livre de RNA/DNA/Nuclease para evitar o congelamento no palco.
   2. Limpe uma nova lâmina descartável criostato com desinfecção de RNase e coloque no porta-lâmina no palco. Permitir que pelo menos 20 min. para a lâmina criostato à temperatura do criostato.
   3. Limpe a placa anti-roll com desinfecção de RNase e anexar para o palco. Permitir que pelo menos 20 min. para a placa anti-roll vir para a temperatura do criostato.
      Nota: Uma placa não é necessária para o corte, mas é altamente recomendada. Se uma placa anti-roll não estiver disponível, um pincel limpo funciona como uma alternativa. Se a placa não estiver na temperatura correta, o tecido irá derreter ou ficar em cima do corte.

5. corte o tecido

1. Corte um pequeno pedaço do tecido (~ 1 cm x 1 cm) para corte. Retorne o tecido restante ao congelador de ° C-80 gelo seco.
   Nota: Certifique-se de que a secção de tecido é córtex cerebelar ~ 95%, onde se situam as células de Purkinje.
2. Coloque um monte de elevado aproximadamente 3 mm da OCT para cobrir o 'chuck'. Comece a construir as camadas por cima em um movimento circular, lento, até que haja um pequeno monte.
3. Uma vez OCT é parcialmente congelado, mas ainda há um pouco de líquido no centro, coloque o tecido em cima da OCT. Não empurre o tecido profundamente em outubro Allow o tecido para sentar em cima de OCT até completamente congelado. Isto levará de 1 a 2 min.
4. Coloque o 'chuck' com OCT congelado e o tecido dentro do braço de corte do criostato. Ajuste o tecido de forma nivelada com a lâmina de corte.
5. Permitir que o tecido se sentar no braço corte por 15 – 20 min para se adaptar à nova temperatura.
   Nota: Dependendo da espessura do tecido, o tempo é necessário para a aclimatação de temperatura. Permitir que o tecido ficar quanto tempo necessário para cortar de forma limpa. Ajuste o OT e CT para ajudar com a aclimatação de temperatura do tecido.
6. Mova lentamente o tecido mais perto da lâmina. Uma vez que o tecido alcançou a lâmina, inicie o processo de acabamento. Espessura de corte deve ser definida como 30 μm.
7. Guarnição 2 – 3 x até as camadas do córtex são visíveis.
8. Coloque e alinhe a placa anti-roll logo acima da lâmina do criostato.
   Nota: Uma linha de prata aparecerá da luz em criostato na interface da lâmina e placa anti-roll. Isso indica que a placa anti-roll é diretamente sobre a borda da lâmina.
9. Comece a cortar as seções em 14 μm. Seções de corte corretamente será plana sob a placa anti-roll.
   Nota: Se o tecido é preso, certifique-se de que a placa anti-roll é fria o suficiente. Se necessário, colocar um pedaço de seco gelo na vontade externa (lado não tocar o palco) rapidamente esfriar a placa anti-roll.
10. 4 – 6 seções de corte e alinhá-los horizontalmente no palco do criostato.
11. Pesca do slide, pegar todas as peças do tecido de uma só vez.
    Nota: Usando os pincéis, levante as extremidades do tecido a ser mais prontamente disponível para o slide em cima da pick-up. Não pegue uma seção de cada vez. Exposição a temperatura ar degradará a integridade do RNA.
    Atenção: Não deixe que a membrana tocar a fase do criostato. Se a membrana toca o palco, ele vai começar a desconectar-se da lâmina de vidro e causará erros ao tentar LCM.
12. Afastar-se imediatamente para a etapa 6. Não atrase a fixação.

6. fixação de tecido/mancha-menos visualização

1. Afastar-se imediatamente para o protocolo de fixação de etanol
2. Coloque o slide no porta corrediça com etanol a 70% por 2 min — no gelo.
3. Coloque o slide no porta corrediça com etanol a 95% para 45 s — no gelo.
4. Coloque o slide no porta corrediça com 100% de etanol por 2 min — no RT
5. Mergulhe o slide 3 vezes no porta-lâmina com xilol 1 — no RT
6. Coloque o slide no porta corrediça com xilol 2 por 5 min — no RT
7. Deixe para secar em uma área limpa pelo menos 30 min. tempos de seca mais longos são ideais, a 60 min.
   Atenção: Levante-se slides para secar em uma coifa. Xileno é volátil. Slides postura plana causará xileno para piscina na seção de tecido, o que fará com que tecido ser muito escuro.

7. opcional — Armazenamento de Slide

1. Coloque slides secas em tubos individuais de 50 mL (um slide por tubo) e coloque no congelador a-80 ° C por até 7 dias.
   Nota: Slides devem estar secos antes de colocar no congelador a-80 ° C. Não utilize o dessecante dentro do tubo como partículas irão incorporar no tecido e membrana. Certifique-se de que a tampa do tubo é apertada; caso contrário, a condensação ocorrerá no slide quando descongelar para uso.
   Atenção: Integridade do RNA diminui após 7 dias, como faz a qualidade de visualização do tecido.

8. descongelar armazenado Slides para uso

1. Retire o tubo com um único slide do congelador a-80 ° C 1 h antes da utilização.
2. Não abra imediatamente o tubo. Deixe os tubos para a temperatura. Condensação ocorrerá do lado de fora do tubo somente.
3. Uma vez que o tubo chegou à temperatura e condensação todos desapareceu (aproximadamente 30 – 40 min), retire a tampa e expor o slide para o ar em temperatura ambiente.
4. Permitir que o slide se adaptar à temperatura ambiente por 15 – 20 min deixe o slide dentro do tubo com a tampa removido.
   Nota: Slide está pronto para o LCM.

9. laser Microdissection de captura das células de Purkinje:

Nota: Esta seção do protocolo só irá discutir detalhes relacionados a captura de células de Purkinje para a sequenciação do ARN subsequente. Esta seção pressupõe que o usuário está familiarizado com o microscópio de captura do laser UV e o software afiliado.

1. Limpar o palco do microscópio e a colecção de armar-se com desinfecção de RNase.
2. Com as mãos enluvadas, coloque a lâmina no microscópio e tampa opaca de 500 μL no braço coleção.
   Nota: Sempre certifique-se de técnica adequada de RNA pela limpeza da área de trabalho com desinfecção de RNase e usar as mãos enluvadas enquanto toca o slide ou tampa opaca. As luvas podem ser removidas uma vez o slide e a tampa no lugar e tenha iniciado a captura do laser.
3. Na ampliação baixa, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a PAC cobre toda a área visualizada na parte do olho.
   Nota: Apenas a parte do olho do microscópio mostrará se a tampa opaca é centralizada. A câmera não vai mostrar se a tampa está centrada sobre o tecido. Dependendo do design de escopo de captura do laser, a visualização através da tampa opaca ou será o pedaço de olho único ou visualizados na parte do olho e a câmera.
4. Visualize as camadas Cerebelares com 5x - lente objetiva de 10x e coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e camada de célula grânulo cruzam (a camada de células de Purkinje).
5. Mover para 40 X e visualize as células de Purkinje.
   Nota: Consulte a Figura 1 e Figura 2 para visualizações de exemplo.
6. Começa a captura de células de Purkinje.
   Nota: Para executar a sequenciação do ARN, pelo menos 5 ng do RNA é necessária. Cerca de 1600 – 2000 Purkinje células resultam em material suficiente do RNA para sequenciamento. RNA será estável por até 8 h no microscópio. Energia de teste UV e UV foco antes da coleção para garantir que os níveis estão corretos. Ao longo do tempo, o tecido continuará a secar e a energia UV e UV foco talvez precise ser alterado.

10. RNA coleção post LCM

1. Preparar a lise celular (prepare fresco cada vez)
   1. Diluir com 2-Mercaptoetanol em tampão de Lise em 1: 100 (10 mL de μL:1, respectivamente). Lise (RLT) é fornecido na Tabela de materiais (#14 e #15).
2. Adicione 50 μL de tampão de lise celular para a tampa opaca, com a tampa virada para cima. Feche cuidadosamente o tubo sobre o cap.
3. Deixe o tubo de cabeça para baixo por 1 min.
4. Vórtice do tubo por 30 s e girar rapidamente a Lise para o fundo do tubo.
5. Reabrir o tubo e repita as etapas de 10.2-10.4.
6. Coloca o tubo contendo 100 μL de tampão de Lise e RNA do freezer-80 ° C, até que todas as amostras são acabado e pronto para a extração do RNA (Tabela de materiais #14).

Representative Results

Este protocolo detalha as etapas para preparar o tecido do cérebro humano fresco congelado post-mortem para UV-LCM. Anotações e minuciosos especificações são dadas para cortes de criostato, como pode ser difícil de cortar o tecido de cérebro congelado fresco com um alto grau de precisão. O ponto mais importante a considerar é que o tecido congelado fresco é extremamente frio e requer uma quantidade significativa de tempo se aclimate à temperatura mais quente de um criostato. Esta etapa não pode ser apressada, e não pode ser exagerado como central nesta etapa é para o sucesso ou o fracasso do presente protocolo. Se o tecido não é preparado adequadamente no criostato, todas as tentativas subsequentes para identificar células ou regiões de interesse será muito difícil, se não impossível.

Seguindo criostato seccionamento e tempo de secagem, o tecido está pronto para LCM. Ao visualizar o tecido sob o microscópio, as camadas celulares do cerebelo são facilmente visíveis com 5 X e 10 X objectivas. A Figura 1 mostra imagens representativas do tecido fixadas em etanol única (Figura 1A) e tecido incubadas em xilol após fixação de etanol (Figura 1B). Estamos rigorosamente testados vários tempos de incubação de etanol e xileno / temperaturas sobre a capacidade de ambos corrigir e visualizar o tecido. Se o tecido não é incubado tempo suficiente em xilol, a imagem resultante será mais se assemelham a Figura 1A, ao invés de Figura 1B. Causas de incubação xileno o tecido tornar-se mais escura e melhor delineia camadas celulares que faz etanol sozinho. Quando cortar no microscópio de captura a laser, a lente de objetiva 40 X é necessário para garantir a captura apenas as células de Purkinje e não o tecido circundante. Incubação em xilol produz uma alta qualidade, imagem morfologicamente intacta (Figura 1D), em comparação com fixação etanol sozinha (Figura 1C).

Para aumentar ainda mais a visualização dos nossos tecidos, testamos a capacidade da lamela de uma tampa opaca. Outros protocolos de UV-LCM utilizam uma líquido tampa cheia de um tubo μL de 200-500 que dissolve-se o tecido em contato. Bonés preenchidos líquidos podem reduzir a visualização do tecido, fazendo com que a imagem resultante seja granular e iridescentes sob o microscópio(Figura 2). Visualização do tecido através dos resultados de tampa opaca (Figura 2B) em uma aparência de tecido smoothened é mais suave e mais nítida no formulário. Notavelmente, o cap opaco permite coleção até 8 h sem a necessidade de substituição. Imagens representativas das células de Purkinje extirpadas em baixa potência (Figura 2C) e alta potência (Figura 2-D, E) mostram remoção precisa de apenas o corpo da célula de Purkinje. Para referência, Figura 2F mostra um Luxol Fast Blue / hematoxilina e eosina (LH & E) manchado córtex cerebelar, que especificamente destaca as diferentes camadas do cerebelo e a colocação das células de Purkinje o molecular camada e célula grânulo camada justaposição.

O propósito do presente protocolo é obter alta qualidade do RNA para a sequenciação do ARN subsequente. Nós testamos o nosso protocolo em seis amostras de cérebro humano diferente post-mortem, que foi submetido a três dias de LCM para recolher pilhas de 1500-2000 para extração de RNA. Aproximadamente 6-8 h no microscópio produziu 500 – 700 células, que foram então combinadas com os produtos de LCM dias anteriores antes da extração do RNA. Amostras foram submetidos a extração do RNA e foram resuspended em 14 μL de água livre de RNAse (Tabela de materiais #14). Todas as seis amostras produziram RNA de alta qualidade, com ≥ 8 números (RINs) de integridade do RNA (Figura 3A-F). Esse procedimento resultou em quantidades de RNA de 11,5 ng(Figura 3),8,3 ng (Figura 3B), 13,6 ng (Figura 3C), 11,5 ng (Figura 3D), 14,9 ng (Figura 3E) e 26,9 NG (Figura 3-F). Digno de nota é que todas as amostras de cérebro humano post mortem foram testadas para a qualidade do RNA antes da LCM (tabela 1). Se a amostra de origem tem degradação do RNA, LCM apenas mais irá degradar sua integridade.

Figura 1 : Visualização de células de Purkinje com e sem tratamento de xileno e camadas cerebelares. Imagens representativas com e sem xileno após fixação de etanol e desidratação. A camada molecular (ML) e a camada de células grânulo (GCL) são rotulados. Células de Purkinje são marcadas com setas. (A) 5 X representação de visualização de camada cerebelar sem xileno. Barra de escala: (B) 5 X 10 µm. representação de visualização de camada cerebelar com xilol. Barra de escala: 10 µm. (C) 40 X representação de visualização de camada cerebelar sem xileno. Barra de escala: 1 µm. (D) 40 X a representação de visualização de camada cerebelar com xilol. Barra de escala: 1 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Visualização de células de Purkinje antes e depois da LCM. Imagens representativas em 40 X com xileno após fixação de etanol e desidratação. O ML e GCL são rotulados. Células de Purkinje são marcadas com setas. (A) visualização no microscópio sob líquido enchido cap em 40 x. Barra de escala: 1 µm. (B) visualização no microscópio sob coleção opaco cap em 40 X. Barra de escala: (C) 5 X 1 µm. visualização do córtex cerebelar, mostrando as células de Purkinje extirpadas entre o ML e GCL. Barra de escala: 10 µm. (D) 40 X visualização de uma célula de Purkinje antes da excisão. Barra de escala: 1 µm. (E) 40 visualização de X de captura de células de Purkinje bem sucedida. Barra de escala: 1 µm. (F), 20 X representante LH & E manchadas de corpos de células de Purkinje de apresentando cerebelo com setas marcadas. Barra de escala: 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Amostras de RNA controle qualidade Bioanalyzer resultados de LCM. Painéis A F mostrar representativas leituras de controle de qualidade de RNA. Cada painel é uma amostra diferente que sofreu o mesmo processo de LCM de fixação e visualização com etanol e xileno apenas. Números de integridade do RNA (RINs) são todos > 8.0. Resultado de [] concentrações representativa em um rendimento de pelo menos 5 ng do RNA total. Todas as amostras foram eluídas em 14 µ l de água livre de RNAse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amostra	RIN - secção Prep	RIN - LCM	[RNA] - LCM	PMI-congelado
A	9.2	8.6	822 pg / µ l	450 min
B	9.8	8	598 pg / µ l	550 min
C	9.1	8.5	976 pg / µ l	455 min
D	9.8	8.2	823 pg / µ l	463 min
E	9.8	9.1	1069 pg / µ l	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg / µ l	1080 min

Tabela 1: Resumo de integridade do RNA . Amostra números correspondem aos resultados bioanalyzer apresentados na Figura 3. Preparações são executadas antes da LCM para garantir que a partir de tecido é de boa qualidade. Mostradas são o tecido original RINs seção preparações, LCM RINs e concentração do RNA do LCM, bem como os intervalos de post-mortem a congelado (PMI-congelado) para os tecidos.

Discussion

O protocolo aqui apresentado é modificado especificamente para ser uma abordagem de aço inoxidável em Visualizar morfologicamente distintos tecidos para UV-LCM. Este método foi projetado para maximizar a integridade do RNA para subsequentes direto a sequenciação do ARN, mantendo um nível aprimorado de visualização do tecido. A capacidade de distinguir diferentes tipos de células para captura, para criar a população de células mais pura possível, é essencial para a compreensão de diferentes perfis moleculares em tecidos humanos¹⁵. No âmbito do presente protocolo, seleção de tecido é de suma importância, como o uso de antígeno ou corantes reagentes específicos não são utilizados e, portanto, não é adequados para estudos que exigem tal diferenciação. Enquanto esta é uma limitação do presente protocolo, a visualização de tecido resultante e a integridade do RNA são muito superiores e mantêm relevância em outros projetos experimentais. Muitos outros protocolos que também utilizam métodos alternativos de coloração especificamente para UV - e IR-LCM com a intenção de preservar RNA existem. No entanto, a maioria dos outros métodos contêm pelo menos uma mancha ou antígeno reagente específico^6,16,17, destinam-se a um tipo de célula ou órgão (que não são tecido humano autópsia)^{18,19, 20}, ou requerem kits de RNA-seq especializados para melhorar a integridade²¹. Coloração de cresilo violeta (Nissl) é um corante popular contendo o reagente utilizado em muitos protocolos, como manchas de núcleos de neurônios do cérebro e faz com que o mínimo de degradação de RNA⁶. No entanto, o maior núcleo da célula de Purkinje não está bem manchado por violet cresilo, não fornecendo nenhum benefício significativo para a visualização de células de Purkinje. Importante, identificamos apenas um estudo de LCM na literatura que descreveu a coleção de células de Purkinje, que são de grande interesse para o estudo de doenças degenerativas e do desenvolvimento cerebelares. Este estudo manchado tecidos congelados com violeta de cresilo e isolado de células de Purkinje com um sistema de IR-LCM; tão baixos quanto 5 foram usados, mas considera-se aceitável para análise de microarray²²RINs da amostra. Portanto, este é o primeiro estudo de protocolo que é projetado especificamente para alta qualidade RNA das células de Purkinje no cerebelo humano post mortem extirpado através de UV-LCM.

A estabilidade do RNA em tecido humano post mortem é um obstáculo bem conhecido, como moléculas de RNA dentro das células são bastante sujeitos a decadência natural após a morte. Especificamente, mRNA foi mostrado para ser os mais suscetíveis a degradação de antípodas⁵. Monitoramento do intervalo post-mortem (PMI) o tempo de congelamento (PMI-congelado) é uma métrica que tem mostrado alguma correlação para degradação do RNA em alguns estudos^23,24,25. No entanto, a tabela 1 mostra nossos intervalos PMI-congelado para os seis exemplos mostrados na Figura 3, que não indica nenhuma correlação relativa com valores PMI e a qualidade do RNA. Portanto, é necessário realizar diligência na verificação de integridade do RNA antes de iniciar um projeto de captura do laser. Se a integridade do RNA da amostra inicial é de baixa qualidade, o RNA resultante de um produto de LCM será de qualidade ainda mais baixa. Quando baixa integridade do RNA não pode ser evitada, outros métodos para reforço do RNA para o sequenciamento podem ser empregados para além deste protocolo²¹. Notavelmente, baixo-entrada ou degradada RNA pode levar a complexidade silenciada e resultados suboptimal que muitas vezes exigem etapas de amplificação adicional. A adição de ciclos PCR para a amplificação foi mostrada para amplificar sequências de forma desigual, bem como criar duplicatas Leia sobre sequenciamento de^26,27. Portanto, a utilização do RNA de alta qualidade das amostras de LCM para sequenciamento é altamente vantajosa.

O método de visualização empregado neste protocolo fortemente baseia-se o usuário está experiência quando corte fresco congelado tecido em um criostato. O protocolo entra em detalhes abrangentes sobre como melhor preparar o tecido para corte e coloque o tecido no slide. Estas são, sem dúvida, as duas etapas mais críticas do presente protocolo. Se o tecido não é aclimatado à temperatura do criostato, retalhamento ocorrerá, que prejudica significativamente a qualidade morfológica do tecido. Destruição é o resultado de alguns problemas potenciais; possibilidades de solução de problemas incluem a espera mais longa para o tecido vir à temperatura ou alterando o criostato OT e/ou CT para uma gama mais quente. Uma vez que o tecido tem foram cortado e colocado no palco com êxito, é importante orientar o tecido e o slide corretamente para garantir todo o tecido se encaixa dentro da membrana e pode ser selecionado com precisão do palco. Ao tentar pegar o tecido do palco criostato, o tecido deve ser frio, e o slide deve ser morno. Protocolos alternativos existem que recomendo para acalmar o slide antes de pegar o tecido e aquecido com um dedo sobre a área de colocação de tecido²⁸; no entanto, em nossas mãos, isto não fornece nenhum benefício e muitas vezes provoca dificuldade em pegar o tecido e dobras de tecido excessivo. Com um slide à temperatura ambiente, o tecido derrete-se imediatamente em contacto com o slide. Para garantir uma pickup limpa, é necessário ao ângulo do slide para que ele entra em contato com o tecido na área de membrana, mas não chegaria a tocar o palco em si. A membrana vai começar a desconectar-se da lâmina de vidro se toca o palco, que danifica a membrana e faz laser captura difícil. Se isso ocorrer, será perceptível quando LCM já começou e não pode ser desfeita. Opções de solução de problemas são limitadas; se a qualquer momento acredita-se estar comprometido a membrana ou slide, é aconselhável descartar. É recomendável a prática de corte de tecido congelado fresco antes de iniciar um projeto ou usando um núcleo de patologia que pode produzir o seccionamento de tecido de alta qualidade. No entanto, se utilizar um serviço de núcleo, certifique-se de que a técnica apropriada do RNA é seguida para prevenir a contaminação de RNase. Degradação de RNA pode ocorrer prontamente quando é usada a técnica imprópria.

Apresentamos aqui um método completo para visualização de aço inoxidável das células de Purkinje no cerebelo humano post mortem para fins de UV-LCM. Incluímos também métodos apropriados de preservação de RNA e técnicas para assegurar altos níveis de integridade do RNA. Este protocolo não é necessariamente específico para qualquer uma célula ou tipo de tecido, mas não manter a exigência de que a célula/região de interesse é morfologicamente distinguível de estroma circundante sem a necessidade de reconhecimento do antígeno ou tintura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.