Summary
肾上腺皮质分泌的激素对动物对抗压力和疾病至关重要。在这里, 我们提出了一个方案, 培养原发性大鼠肾上腺细胞。它可以作为研究肾上腺类固醇发生和脂质生物合成中感兴趣的试剂机制的一个很好的体外平台。
Abstract
肾上腺皮质分泌的激素对动物对抗压力和疾病至关重要。本文介绍的方法是原代培养大鼠肾上腺细胞的程序和相关功能检测 (脂滴表面蛋白的免疫荧光染色, 以及皮质酮分析)。与体内模型不同的是, 肾上腺单层培养物中的间实验变化较小, 实验条件易于控制。此外, 老鼠的来源也比其他动物更稳定, 比如牛的动物。还有几种人肾上腺细胞系 (nci-h295、nci-h295r、sw13 等) 可用于肾上腺研究。然而, 这些系的类固醇生产仍将受到多种因素的影响, 其中包括血清批号、传道数、不同基因的突变/丢失等。大鼠肾上腺皮质细胞的原代培养除了缺乏17α-羟化酶外, 是研究肾上腺生理的一种较好、更简便的方法。总之, 原发性大鼠肾上腺培养可以作为一个很好的体外平台, 研究肾上腺系统中有关试剂的机制。
Introduction
内分泌系统负责调节生理活动和稳态1。肾上腺位于肾脏的颅极, 是分泌矿物皮质激素、糖皮质激素和雄激素2, 3 的主要内分泌器官之一。肾上腺有两个不同的部分: 皮层和髓质。肾上腺皮质由三层组成: 外肾小球、中间小泡和内网状 3.肾小球带是醛固酮的原始分泌位点, 醛固酮是一种矿物质皮质激素, 它有助于在肾脏中重新吸收钠离子和水 3.在正常生理条件下, 小束带主要产生糖皮质激素的基础水平3。啮齿类动物中的皮质类固醇和人类的皮质醇通过调节血糖来帮助身体应对压力.在一定程度上, 他们可以抑制炎症反应和调节免疫系统4,5。与其他哺乳动物不同的是, 由于肾上腺缺乏17α-羟化酶表达, 小鼠和大鼠没有功能性网状带.因此, 小鼠和大鼠的肾上腺缺乏肾上腺 c-19 类固醇 (皮质醇和肾上腺雄激素) 的分泌。
原代培养的肾上腺皮质细胞已被证明是有用的研究机制控制肾上腺生理 8.像其他类固醇生成组织, 每个肾上腺区域合成其类固醇从游离胆固醇9。在肾上腺皮质激素 (acth) 刺激下, 游离胆固醇从破裂的脂滴中释放, 从而提高了小泡和网状10中类固醇的产生。
许多群体试图从肾上腺皮质癌中建立稳定的细胞系。然而, 一些担忧限制了肾上腺皮质细胞系的使用, 就像体外模型 8一样。细胞系的类固醇反应可能因通道、血清批号、血清质量等而异。此外, 商业肾上腺细胞系 (y1 和 sw13) 不分泌皮质酮, 使研究肾上腺类固醇发生变得更加困难 8.使用牛和马肾上腺作为体外模型可能是一个很好的选择, 尽管来自这些市场的组织可能掩盖了一些未知的风险。与它们相比, 大鼠肾上腺的管理更容易, 来源相对较稳定, 无病原菌。总之, 本文所述的方法可用于研究大鼠肾上腺束细胞中皮质酮合成的相关机制。
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Protocol
所有的程序, 包括动物科目已批准高雄医科大学动物护理和使用委员会。
1. 实验程序
- 用co2安乐死产出成年 (8至12周) 女性 sd 大鼠。
- 应用70% 乙醇, 让它被吸收到皮肤, 然后用纸巾擦拭皮肤。
- 把老鼠放在一个干净的塑料板上仰面位置。
- 在中线用 "外部" 弯曲钳提起皮肤, 并通过创建 "y" 形状 (从大腿的水平到肋下的角度) 来执行钝性解剖。
- 用70% 乙醇冲洗剪刀, 然后, 切断肌肉, 也创造一个 "y" 形状。
-
找到胃后面的左肾上腺。
注:右肾上腺可以发现肝脏后面深处。- 使用一对钳子抬起胃或肝脏, 用另一个弯曲的钳子隔离肾上腺。
- 将肾上腺放入无菌的培养皿中后, 用细钳小心取出肾上腺囊。
- 用一把精致的剪刀, 用一点无血清的杜尔贝克改装的鹰的培养基 (DMEM)/F-12 的培养基, 把肾上腺素切成小块。
-
准备三个不同的毛孔大小的巴斯德管, 并使用第一个巴斯德管吸气到一个50毫升锥形管含有中的胶原酶 ii (约 0.5–0.8 mg/ml)。
- 轻轻三度将组织块切成10倍左右。使用其余的吸管, 并重复上述步骤, 直到所有的碎片变得更小。
注: 巴斯德管的不同孔径可以通过火加热来创建。第一个管道是原来的大小 (约1毫米), 第二个的孔径约0.8 毫米, 第三个巴斯德管约0.5 毫米。在消化过程中, 肾上腺的碎片会变小。因此, 通过机械程序, 肾上腺素可以消化得更多。将管子在水浴中 (37°c) 中培养, 每5分钟摇一次, 共4倍。
- 轻轻三度将组织块切成10倍左右。使用其余的吸管, 并重复上述步骤, 直到所有的碎片变得更小。
- 孵育20分钟后, 加入新鲜清凉培养基 (6倍体积; 例如, 含有2.5% 胎牛血清 (fbs) 和5% 马血清的5毫升组织 + 25 毫升的冷 demce/-12 培养基), 以停止酶的作用。
- 以 800 x 克离心收集细胞颗粒 10分钟.
- 添加适当的介质体积以悬挂单元格。
请注意:每个腺体可以使大约 3 x10 5 ~ ~ 4 x 10 5细胞。 - 在37°c 的加湿环境中, 用 dmem 和 ham 的 f-12 培养基 (1: 1 [v/v] 混合的 dmem 和 ham 的 f-12 介质将细胞贴在所需的盘子或盘子中, 并在37°c 夜间 (第0天) 补充 25 mm hepes 和1% 青霉素和链霉素)。
注: 通常情况下, 我们板细胞在24孔板 (四个腺体板) 的皮质酮检测和35毫米的菜肴 (一个腺/约一至两个盘子) 用于西方印迹分析。 - 用无血清温暖的 demmsf-12 介质 (第1天) 小心地清洗细胞2倍。更换新的生长介质。
- 在95% 空气和5% 二氧化碳的加湿环境中将细胞保持在 37°c, 直到第3天。
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Representative Results
使用这里描述的程序, 原代培养的肾上腺细胞可以在相反的对比显微镜下进行区分 (图 1a)。为了进一步证实细胞质内的囊泡是脂滴, 可以在第3天培养物上进行脂肪分化相关蛋白 (adrp) 的免疫荧光染色 (图 1b)。玻璃被单上长出了细胞。用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 对细胞进行三次清洗, 并用4% 的甲醛固定。用 pbs 清洗三次后, 细胞被阻断, 并渗透在5% 脱脂牛奶中 0.1% triton x-100。原代 adrp 抗体在5% 的脱脂牛奶中稀释 (1:50), 并在一夜之间孵育。经过三次 pbs 清洗后, 用山羊抗家兔亚历克莎氟化物488二级抗体 (1: 100) 孵育细胞。重复洗涤步骤后, 用 prolong gold 防褪色安装介质安装细胞, 并在荧光显微镜下进行检查。此外, 皮质酮法可以测定大鼠肾上腺细胞的激素生成能力。刺激促肾上腺皮质激素对大鼠肾上腺细胞可作为阳性对照 (图 1c)。根据 chen 等人描述的程序, 收集到的培养基被稀释并检测到皮质酮含量.
图 1: 肾上腺细胞的特征和皮质酮对促肾上腺皮质激素治疗的反应.(a) 第3天原代培养大鼠肾上腺细胞的相图。(b) 显示 adrp 染色。(c) 用 acth (1 pm 和 1 nm) 对 day-3 培养的大鼠肾上腺细胞进行6小时治疗。介质被收集并储存在-80°c 的冰箱中, 直到使用。用酶联免疫吸附法 (elisa) 测定皮质激素水平。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
肾上腺在环境适应中起着关键作用3。肾上腺皮质分泌的激素可以调节和调节生理功能和稳态3。体内模型反映了人体的真正生理效应。然而, 它仍然受到许多复杂因素的影响, 在实验中造成不稳定的影响。相比之下, 体外细胞模型具有优势, 与动物模型相比是无与伦比的。首先, 环境条件在体外系统中易于控制。激素很可能受到任何刺激的影响。体内实验通常会产生非特异性反应, 因为动物容易受到困扰。其次, 这些物质在体内不容易监测, 但在培养系统中负有责任。第三, 体外系统减少了每个独立实验之间的差异。许多科学报告显示, 肾上腺皮质细胞的培养基含有 10%-20% 的 fbs12,13,14, 15, 而这里介绍的协议使用5% 的 fbs 和2.5% 的马血清来维持肾上腺细胞的生长长达一周。
类固醇生成是从细胞色素 p450 侧链裂解酶游离胆固醇裂解开始的。如图 1 a、b、肾上腺细胞表现出许多不同大小的脂滴, 这表明它是研究类固醇生物合成和脂质生物学的一个很好的工具 (分枝细胞具有突出和较大的脂质液滴)1,3。adrp, 也被称为环磷蛋白 2, 是一种脂滴表面蛋白, 它有助于在脂滴16内储存中性脂质.由于肾上腺皮质细胞表现出一定的脂质, adrp (或其他脂滴表面蛋白, 如特雷皮平) 可用于检测所测试的药物是否影响激素合成16。
肾上腺的生长和功能受到下丘脑皮质激素释放激素和垂体促肾上腺皮质激素、神经肽、神经递质和生长因子等的严格控制.图 1c显示, 以浓度依赖性的方式通过 acth 处理显著诱导了皮质酮的产生。此外, 在 1 pm 和 1 nm 的 acth 刺激了皮质酮的生产, 分别为30倍和70倍左右。结果表明, 天3培养的原代肾上腺细胞对促肾上腺皮质激素刺激 15表现出较好的反应。这也是本研究中使用第3天培养的原因。此外, 通过 elisa 试剂盒测量皮质酮也是一个简单易用的研究工具。因此, 原代培养的大鼠肾上腺细胞不仅为肾上腺类固醇发生的研究提供了平台, 也可应用于炎症相关疾病的调查。
本协议的关键步骤是消化肾上腺素和控制污染。因此, 控制消化时间、物理吸力和观察组织消化水平对细胞生存非常重要。此外, 切割皮肤和隔离肾上腺的方法也很重要。始终将所有仪器浸入70% 的乙醇中, 以防止任何动物毛皮污染。为了获得更多的细胞, 每次吸气过程中的吸力频率应控制不到十倍。另外, 如果组织的条件不适合进一步的步骤, 在含有胶原酶的培养基中的孵育不应超过 3 0分钟。
由于大鼠肾上腺较小, 肾上腺囊剥落过程中可能会失去肾小球层。结果表明, 分离可去除结缔组织囊和全肾小球带18。雄性大鼠肾上腺比雌性大鼠小。此外, 11只一周大的雌性或雄性小鼠的脂滴似乎较大。关于可用的细胞, 雌性老鼠可能是实验的好选择。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了台湾国家科学委员会的资助 (nsc102-2320-b-07-008-my3) 和国立城公大学医院研究补助金 (nckuh-10102045) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
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