Summary
Het hormoon afgescheiden door de bijnierschors is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. Hier presenteren we een protocol bij de cultuur de primaire rat bijnier cellen. Het zou een goede in-vitro platform voor onderzoek naar de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier steroidogenesis en lipide biosynthese.
Abstract
Het hormoon die de bijnierschors scheidt is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. De hier beschreven methode is de procedure van primaire gekweekte rat bijnier cellen en verwante Functionele assays (immunofluorescentie kleuring van lipide druppel oppervlakte-proteïne, evenals corticosterone analyse). In tegenstelling tot een in vivo model, de variatie van de interexperiments in de bijnier enkelgelaagde culturen is minder en de experimentele conditie is makkelijk te controleren. Bovendien, is de bron van ratten ook stabieler dan andere dieren zoals runderen ones. Er zijn ook verschillende menselijke bijnier cellijnen (NCI-H295 NCI-H295R, SW13, etc.) die kunnen worden gebruikt in de bijnier studies. De steroïde productie van deze regels zal echter nog steeds worden beïnvloed door talrijke factoren, waaronder serum lotnummer, passage nummer, mutant/verlies van verschillende genen, enz. Met uitzondering van 17α-hydroxylase ontbreekt, is de primaire cultuur van rat adrenocortical cellen een beter en handiger techniek voor het bestuderen van de bijnier fysiologie. Kortom zou de primaire rat bijnier culturen een goede in-vitro platform voor onderzoekers te onderzoeken van de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier-systeem.
Introduction
Het endocriene systeem is verantwoordelijk voor de regulering van de fysiologische activiteiten en homeostase1. Bijnieren, gelegen aan de craniale pool van de nieren zijn een van de belangrijkste endocriene organen die mineralocorticoids, glucocorticoïden en androgeen2,3 afscheiden. Er zijn twee verschillende delen van de bijnier: de cortex en de medulla. De bijnierschors bestaat uit drie lagen: de buitenste glomerulosa, de tussenliggende fasciculata en de innerlijke reticularis3. De zona glomerulosa is de oorspronkelijke dat site van aldosteron, een Mineralocorticoïden, die helpt bij het ion van natrium en water in de nieren3geabsorbeerd. De fasciculata van de zona produceert voornamelijk een basale niveau van glucocorticoïden in normale fysiologische omstandigheden3. Corticosteroïden bij knaagdieren en cortisol in mensen handelen binnen het lichaam helpen in het omgaan met stress door het reguleren van bloed glucose3. Tot op zekere hoogte kunnen remmen inflammatoire reacties en reguleren het immuunsysteem4,5. In tegenstelling tot andere zoogdieren, muizen en ratten geen hebben een functionele zona reticularis vanwege het ontbreken van een 17α-hydroxylase expressie in de bijnier6,7. Bijnieren van muizen en ratten zijn dus verstoken van de secretie van bijnier C-19 steroïden (cortisol en bijnier-androgenen).
Primaire gekweekte adrenocortical cellen is aangetoond dat het nuttig is voor het onderzoeken van de mechanismen waarmee de bijnier fysiologie8worden bestuurd. Net als andere steroidogenic weefsels synthetiseert elke bijnier zone zijn steroïden van gratis cholesterol9. Op adrenocorticotropic hormoon (ACTH) stimulatie, de gratis cholesterol wordt vrijgelaten uit de uitsplitsing lipide druppels en, dus, verbetert steroïde productie in de fasciculata en reticularis10.
Vele groepen hebben geprobeerd om stabiele cellijnen van adrenocortical carcinomen. Verschillende zorgen hebben echter slechts beperkt het gebruik van adrenocortical cellijnen in vitro modellen8. De steroïde reacties van cellijnen kunnen verschillen tussen passages, het lotnummer van het serum en de kwaliteit van de serum, enz. Bovendien doen de commerciële bijnier cellijnen (Y1 en SW13) niet corticosterone, waardoor het moeilijker om te studeren bijnier steroidogenesis8afscheiden. Met behulp van runderen en paarden bijnieren zoals ex vivo modellen een goede keuze wellicht, hoewel weefsels van deze markten sommige onbekende risico's verdoezelen kunnen. Vergeleken met hen, beheer van rat bijnieren is makkelijker en de bron is relatief meer stabiel en pathogenen vrije. Tezamen, kan de huidige hier beschreven methode worden gebruikt om te onderzoeken het verwante mechanisme van corticosterone synthese in rat bijnier fasciculata cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité van Kaohsiung medische universiteit.
1. experimentele Procedure
- De volwassene (8 tot 12 weken oude) mannelijke en vrouwelijke SD rats offeren door CO2 euthanasie.
- Toepassen van 70% ethanol en laat het worden geabsorbeerd in de huid, en vervolgens veeg de huid met een papieren zakdoekje.
- Zet de rat op een schone kunststof plaat in de liggende positie.
- Til de huid met een 'externe' gebogen Tang op de middellijn en een botte dissectie uitvoeren door het creëren van een "Y" vorm (van het niveau van de dij de subcostal hoek).
- Spoel schaar met 70% ethanol en knip de spier, ook het creëren van een "Y" vorm.
-
Vind de linker bijnier achter de maag.
Opmerking: de juiste bijnier diep achter de lever kan worden gevonden.- Een paar van de verlostang om te heffen van de maag of de lever en de bijnieren te isoleren met een andere gebogen pincet gebruiken
- Na de invoering van de bijnieren in een steriele schotel, verwijder zorgvuldig de bijnier capsule met fijne pincet.
- Met een delicate schaar, snijd de bijnieren in kleine stukjes met een beetje beetje Dulbecco serumvrij Eagle's medium (DMEM) gewijzigde / F-12 medium.
-
Bereiden van drie verschillende porie-grootte Pasteur pipets en gebruik de eerste pipet van Pasteur om gecombineerd alle stukken van de bijnier in een kegelvormig tube van 50 mL, met medium met collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Triturate het weefsel stukken zachtjes ongeveer 10 x. De rest van de pipets gebruiken en herhaal de bovenstaande stappen totdat alle stukjes kleiner geworden.
Opmerking: De verschillende porie-grootte van het Pasteur-pipets kunnen worden gemaakt door het verhitten van hen met vuur. De eerste Pipetteer is de oorspronkelijke grootte (ongeveer 1 mm), de poriegrootte van de tweede is ongeveer 0,8 mm en het derde pipet van Pasteur is ongeveer 0,5 mm. Tijdens de spijsvertering, zal de stukken van de bijnier afnemen. Dus via de mechanische procedure, kunnen de bijnieren worden verteerd meer voltooid. Incubeer de buis in een waterbad (bij 37 ° C) en schud het elke 5 min, 4 x in totaal.
- Triturate het weefsel stukken zachtjes ongeveer 10 x. De rest van de pipets gebruiken en herhaal de bovenstaande stappen totdat alle stukjes kleiner geworden.
- Voeg vers en koel medium (zesvoudig volume; bijvoorbeeld 5 mL weefsel + 25 mL van cool DMEM/F-12 medium) met 2,5% foetale runderserum (FBS) en 5% paard serum om te stoppen met het enzym effect na de incubatie 20 min.
- Het verzamelen van de cel pellets door centrifugeren bij 800 x g gedurende 10 minuten.
- Het toevoegen van een passende omvang van medium tot schorsing van de cellen.
Opmerking: Elke klier kan maken ongeveer 3 ~ x 105 ~ 4 x 105 cellen. - Plaat van de cellen in de gewenste platen of schotels met groeimedium (1:1 [v/v] mengsel van DMEM en Ham van F-12 medium, aangevuld met 25 mM HEPES en 1% penicilline en streptomycine) overnachting (dag 0) bij 37 ° C, in een bevochtigde omgeving van 95% lucht en 5% CO2.
Let op: Meestal, we plaat cellen in 24-Wells-platen (vier klieren/plaat) voor de corticosterone assay en in 35 mm gerechten (één klier/ongeveer één tot twee gerechten) voor de westelijke analyse van de vlek. - Grondig wassen de cellen 2 x met warme serumvrij DMEM/F-12 medium (dag 1). Vervang de nieuwe groeimedium.
- Handhaving van de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde omgeving van 95% lucht en 5% CO2 tot en met dag 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebruik de procedure hier, zich primaire gekweekte bijnier cellen kunnen onderscheiden onder een microscoop met fase contrast (figuur 1A). Om te bevestigen dat de blaasjes in het cytoplasma lipide druppels zijn, kan de immunofluorescentie kleuring van obesitas differentiatie-gerelateerde eiwitten (ADRP) plaatsvinden op de dag-3 culturen (figuur 1B). Cellen werden geteeld op de glazen coverslips. De cellen waren drie keer gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en vaste met 4% paraformaldehyde. Na driemaal wassen met PBS, de cellen werden geblokkeerd en permeabel met 0,1% Triton X-100 in 5% nonfat melk. Het primaire antilichaam ADRP verdunde (1:50) was in 5% nonfat melk en 's nachts werd uitgebroed. Na drie keer van PBS wassen, de cellen werden geïncubeerd met geit anti-konijn Alexa Fluor 488 secundaire antilichamen (1:100). Na het herhalen de stappen wassen, de cellen waren gemonteerd met gouden Antifade verlengen montage medium en werden onderzocht onder de Microscoop fluorescentie. Bovendien, het hormoon-producerende vermogen van de rat bijnier cellen kon worden vastgesteld door bepaling van de corticosterone. Stimulatie van ACTH op rat bijnier cellen kan dienen als positieve controle (Figuur 1 c). De verzamelde media waren verdund en vehiculumcontrolegroep corticosterone inhoud, volgens de procedure die wordt beschreven door Chen et al.11.
Figuur 1: de karakterisatie van de bijnier cellen en de corticosterone reactie op de behandeling van ACTH. (A) fase contrast foto van de dag-3 primaire gekweekte rat bijnier cellen. (B) ADRP kleuring wordt weergegeven. (C) dag-3 gekweekte rat bijnier cellen werden behandeld met ACTH (1 uur en 1 nM) voor 6 uur. De media werden verzameld en opgeslagen in een koelkast-80 ° C tot gebruik. Corticosterone niveaus werden gemeten door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bijnieren spelen een sleutelrol in milieu aanpassing3. Het hormoon dat door die de bijnierschors scheidt kunt reguleren en fysiologische functies en homeostase3aanpassen. De in vivo model weerspiegelt de echte fysiologische effecten in het lichaam. Het is echter nog steeds beïnvloed door vele complexe factoren, unstable effecten veroorzaken in experimenten. Daarentegen heeft de in vitro cell model voordelen waardoor het onvergelijkbaar met de diermodel. Ten eerste is de milieu voorwaarde makkelijk te controleren in de in vitro systeem. Hormonen zijn waarschijnlijk worden beïnvloed door elke stimulans. In vivo experimenten resulteert dit meestal in een niet-specifieke reactie omdat dieren gevoelig voor nood zijn. Ten tweede, de stoffen zijn niet gemakkelijk te controleren in het lichaam maar in de gekweekte systeem aansprakelijk zijn. Ten derde, het in vitro systeem vermindert de verschillen tussen elke onafhankelijke experiment. Veel wetenschappelijke rapporten tonen een voedingsbodems voor adrenocortical cellen met 10%-20% FBS12,13,14,15, overwegende dat het protocol gepresenteerd hier 5% FBS en 2,5% paard serum gebruikt om de groei van de bijnier cellen voor maximaal een week.
Steroidogenesis wordt gestart vanuit het splijten van gratis cholesterol door cytochroom P450-zijketen decollete enzymen. Zoals blijkt uit figuur 1AB, bijnier cellen vertonen vele en verschillende maten van lipide droplets, suggereert het is een goed hulpmiddel voor het onderzoek van steroïde biosynthese en/of lipide biologie (fasciculata cellen hebben prominente en grotere lipide druppels)1,3. De ADRP, ook bekend als perilipin 2, is een lipide druppel oppervlakte-proteïne die bij de opslag van neutrale lipiden binnen de lipide druppels16 helpt. Als gevolg van de adrenocortical cellen vertoont een bedrag van lipide, de ADRP (of andere lipide druppel oppervlakte eiwitten, zoals perilipin) kan worden gebruikt om te onderzoeken of de geteste agenten hormoon synthese16 beïnvloeden.
De groei en functie van de bijnieren zijn streng gecontroleerd door de hypothalamische corticotropic-releasing hormoon en hypofyse ACTH, neuropeptides, neurotransmitters en groeifactoren, etc.17. Figuur 1 c blijkt dat de productie van de corticosterone aanzienlijk was geïnduceerd door ACTH behandeling in een concentratie-afhankelijke manier. Bovendien, ACTH at 1 pM en 1 nM stimuleerde de productie van corticosterone ongeveer 30 - en 70-fold, respectievelijk. Het is aangetoond dat dag-3 gekweekte primaire bijnier cellen een beter inspelen op de ACTH stimulatie15 vertonen. Dit is ook de reden waarom dag-3 cultuur werd gebruikt in de huidige studie. Bovendien, is de meting van corticosterone door ELISA-kit ook een eenvoudig en gemakkelijk hulpmiddel voor onderzoek. Dus, de primaire gekweekte rat bijnier cellen niet alleen het platform te bieden voor de studie van de bijnier steroidogenesis maar kunnen ook van toepassing op het onderzoek van inflammatoire-gerelateerde ziekten.
De kritische stappen in dit protocol zijn de vertering van de bijnieren en bestrijding van verontreiniging. Controle van de tijd van de spijsvertering, fysieke zuigkracht en waarneming van het niveau van de spijsvertering weefsel zijn daarom erg belangrijk voor de overleving van de cel. Bovendien is de methode voor het snijden van de huid en het isoleren van de bijnieren ook belangrijk. Altijd onderdompelen alle instrumenten in 70% ethanol om verontreiniging te voorkomen door dieren bont. Teneinde te verkrijgen meer cellen, moet op de zuig frequentie minder dan tien keer tijdens elke zuig worden gecontroleerd. Ook, als de toestand van de weefsels is niet goed voor verdere stappen, de incubatie in collagenase-bevattende medium mag niet langer zijn dan 30 min.
Omdat de bijnieren van ratten klein zijn, de glomerulosa laag mogelijk verloren tijdens de peeling van de bijnier capsule. Het is aangetoond dat uitpakken van gegevenspakketten verstaan resulteerde in de verwijdering van de capsule van het bindweefsel en de gehele zona glomerulosa18. De bijnieren van mannelijke ratten zijn kleiner dan die van vrouwelijke ratten. Bovendien lijken de lipide druppels groter in 11 weken oude vrouwelijke of mannelijke muizen6. Met betrekking tot de beschikbare cellen wellicht vrouwelijke ratten een goede keuze voor experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door een subsidie van de National Science Raad Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) en een nationale Cheng-Kung Universiteit ziekenhuis onderzoeksbeurs (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
