Summary
L'ormone secernuta dalla corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Qui, presentiamo un protocollo alla cultura il ratto primario cellule adrenali. Potrebbe essere una buona piattaforma in vitro per indagare i meccanismi del reagente di interesse nella steroidogenesi surrenalica e biosintesi lipidica.
Abstract
L'ormone che secerne la corteccia surrenale è vitale per animali contro lo stress e malattie. Il metodo qui descritto è la procedura di cellule adrenali primario coltivati del ratto e saggi funzionali correlati (colorazione di immunofluorescenza di proteina di superficie della gocciolina del lipido, nonché analisi di corticosterone). A differenza di un modello in vivo, la variazione di interexperiments in colture monostrato adrenale è minore e la condizione sperimentale è facile da controllare. Inoltre, l'origine dei ratti è anche più stabile di altri animali, come quelli di bovino. Ci sono anche diverse linee di cellule umane adrenale (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, ecc.) che possono essere utilizzati negli studi adrenali. Tuttavia, la produzione di steroidi di queste linee sarà ancora influenzata da numerosi fattori, che includono il numero di lotto del siero, il numero di passaggio, mutante/perdita di geni distinti, ecc. Fatta eccezione per la mancanza di 17 α-idrossilasi, colture primarie di cellule corticosurrenali ratto sono una tecnica migliore e più conveniente per lo studio della fisiologia adrenale. In sintesi, culture adrenale del ratto primario potrebbero essere una buona piattaforma in vitro per i ricercatori a studiare i meccanismi del reagente di interesse nel sistema della ghiandola surrenale.
Introduction
Il sistema endocrino è responsabile della regolazione di attività fisiologiche e omeostasi1. Le ghiandole surrenali che si trova al Polo craniale dei reni sono uno dei principali organi endocrini che secernono mineralcorticoidi, glucocorticoidi e androgeni2,3. Ci sono due parti distinte della ghiandola surrenale: la corteccia ed il midollo. La corteccia surrenale è costituito da tre strati: l'esterno glomerulosa, la fascicolata intermedia e i reticularis interna3. La zona glomerulare è il sito originale di secrezione dell'aldosterone, un mineralcorticoide, che aiuta a riassorbire ioni di sodio e acqua nei reni3. La zona fascicolata principalmente produce un livello basale di glucocorticoidi in condizioni fisiologiche normali3. I corticosteroidi in roditori e cortisolo negli esseri umani agiscono per aiutare il corpo a fare fronte allo sforzo regolando sangue glucosio3. In una certa misura, possono inibire le risposte infiammatorie e regolano il sistema immunitario4,5. A differenza di altri mammiferi, topi e ratti non hanno un reticularis di zona funzionale a causa della mancanza di un'espressione di 17 α-idrossilasi in ghiandola adrenale6,7. Così, le ghiandole surrenali da topi e ratti sono privi di secrezione di steroidi surrenali C-19 (cortisolo e androgeni adrenali).
Cellule corticosurrenali coltivate primarie hanno dimostrate di essere utile per investigare i meccanismi che controllano la fisiologia adrenale8. Come altri tessuti steroidogenic, ogni zona adrenale sintetizza la sua steroidi da colesterolo libero9. Stimolazione con l'ormone adrenocorticotropo (ACTH), il colesterolo libero viene rilasciato da goccioline del lipido di ripartizione e, quindi, migliora la produzione di steroidi nella fascicolata e reticularis10.
Molti gruppi hanno tentato di stabilire linee cellulari stabilizzate da carcinomi adrenocorticali. Tuttavia, parecchie preoccupazioni hanno limitato l'uso di linee di cellule corticosurrenali come in vitro modelli8. Le risposte steroide di linee cellulari possono differire fra i passaggi, il numero di lotto del siero e la qualità del siero, ecc. Inoltre, linee cellulari adrenale commerciale (Y1 e SW13) non secernono corticosterone, rendendo più difficile studiare la steroidogenesi surrenalica8. Utilizzando le ghiandole surrenali bovine ed equine come ex vivo modelli potrebbero essere una buona scelta, anche se i tessuti di questi mercati possono oscurare alcuni rischi sconosciuti. Rispetto ad essi, gestione delle ghiandole surrenali del ratto è più facile e la fonte è relativamente più stabile e privo di agenti patogeni. Presi insieme, il presente metodo qui descritto potrebbe essere utilizzato per studiare il meccanismo correlato della sintesi di corticosterone in cellule del ratto fasciculata adrenale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure tra cui animali soggetti sono state approvate da istituzionale Animal Care e uso Comitato di Kaohsiung Medical University.
1. procedura sperimentale
- Sacrificare i ratti di SD femmina/maschio adulto (da 8 a 12 settimana-vecchi) di CO2 eutanasia.
- Applicare etanolo al 70% e lasciarlo essere assorbito dalla pelle e quindi pulire la pelle con una velina.
- Mettere il ratto su una piastra di plastica pulito in posizione supina.
- Sollevare la pelle con il forcipe curvo "esterno" al midline ed eseguire una dissezione smussa creando una forma di "Y" (dal livello della coscia dell'angolo sottocostale).
- Sciacquare le forbici con etanolo al 70% e, quindi, tagliare il muscolo, creando anche una forma di "Y".
-
Trovare la ghiandola surrenale sinistra dietro lo stomaco.
Nota: adrenale di destra può essere trovato profondamente dietro il fegato.- Utilizzare un paio di pinze per sollevare lo stomaco o fegato e isolare le ghiandole surrenali con un altro forcipe curvo.
- Dopo aver messo le ghiandole surrenali in un piatto sterile, rimuovere con cautela la capsula surrenale con una pinzetta.
- Con un delicato paio di forbici, tagliare le ghiandole surrenali in piccoli pezzi con un po' di Dulbecco privo di siero s modified esente Eagle (DMEM) / F-12 medio.
-
Preparare tre diverse dimensioni dei pori Pasteur pipetta e utilizzare la pipetta di Pasteur prima per aspirare tutti i pezzi adrenali in una provetta conica 50 mL contenente mezzo con collagenasi II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Delicatamente e triturare i pezzi di tessuto a 10x. Utilizzare il resto della pipetta e ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i pezzi diventano più piccoli.
Nota: Le dimensioni differenti dei pori di pipetta Pasteur possono essere create da loro riscaldamento con fuoco. La prima pipetta è la dimensione originale (circa 1 mm), il formato del poro del secondo è di circa 0,8 mm e la pipetta di Pasteur terza è di circa 0,5 mm. Durante la digestione, i pezzi delle surrenali diventerà più piccoli. Così, tramite la procedura meccanica, le ghiandole surrenali possono essere digerite più completato. Incubare la provetta a bagnomaria (a 37 ° C) e agitare ogni 5 min, 4 volte in totale.
- Delicatamente e triturare i pezzi di tessuto a 10x. Utilizzare il resto della pipetta e ripetere i passaggi precedenti fino a quando tutti i pezzi diventano più piccoli.
- Dopo l'incubazione di 20 min, aggiungere mezzo fresco e freddo (sestuplo volume; ad esempio, 5 mL di tessuto + 25ml di cool DMEM/F-12 medium) contenente 2,5% siero bovino fetale (FBS) e 5% di siero equino per fermare l'effetto degli enzimi.
- Raccogliere le palline delle cellule mediante centrifugazione a 800 x g per 10 min.
- Aggiungere un volume adeguato di medie di sospendere le cellule.
Nota: Ogni ghiandola può fare circa ~ 3 x 105 a ~ 4 x 105 celle. - Le cellule in piastre desiderate o piatti del piatto con il mezzo di crescita (miscela 1:1 [v/v] del mezzo F-12 di prosciutto e DMEM, completati con 25mm HEPES e 1% penicillina e streptomicina) durante la notte (giorno 0) a 37 ° C, in un ambiente umidificato di 95% aria e 5% CO2.
Nota: Di solito, abbiamo piastra cellule in piastre da 24 pozzetti (quattro ghiandole/piatto) per il dosaggio di corticosterone e in 35 mm piatti (una ghiandola/circa uno o due piatti) per western blot analisi. - Lavare accuratamente le cellule 2 x con caldo privo di siero DMEM/F-12 medio (giorno 1). Sostituire il nuovo mezzo di crescita.
- Mantenere le cellule a 37 ° C in un ambiente umidificato di 95% aria e 5% CO2 fino al giorno 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utilizzando la procedura descritta qui, cellule adrenali coltivate primarie si distinguevano sotto un microscopio a contrasto di fase (Figura 1A). Per confermare ulteriormente che le vescicole all'interno del citoplasma sono le goccioline del lipido, la colorazione di immunofluorescenza della proteina di relazione con la differenziazione adiposa (ADRP) potevano essere condotte sulle colture di giorno-3 (Figura 1B). Le cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetti. Le cellule sono state lavate tre volte con tampone fosfato salino (PBS) e fissate con paraformaldeide al 4%. Dopo aver lavato tre volte con PBS, le cellule sono state bloccate e permeabilizzate con 0,1% Triton X-100 in 5% di latte scremato. L'anticorpo primario ADRP è stato diluito (01:50) in 5% di latte scremato ed è stato incubato durante la notte. Dopo tre volte di lavaggio PBS, le cellule sono state incubate con anticorpi di capra anti-coniglio Alexa Fluor 488 secondari (1: 100). Dopo aver ripetuto la procedura di lavaggio, le cellule sono state montate con mezzo di montaggio prolungare Antifade oro e sono state esaminate al microscopio a fluorescenza. Inoltre, la capacità delle cellule del ratto adrenale producono ormoni potrebbe essere determinata dall'analisi di corticosterone. Stimolazione di ACTH su cellule adrenali ratto potrebbe servire come controllo positivo (Figura 1). I media raccolti erano diluiti e dosati per contenuto di corticosterone, secondo la procedura descritta da Chen et al.11.
Figura 1: la caratterizzazione di cellule adrenali e la risposta di corticosterone alla terapia degli ACTH. (A) foto di contrasto di fase di cellule adrenali giorno-3 primario coltivati del ratto. (B) ADRP macchiatura è mostrata. (C) 3 ° giorno-adrenale cellule coltivate del ratto sono state trattate con ACTH (13 e 1 nM) per 6 h. I media sono stati raccolti e conservati in congelatore a-80 ° C fino all'utilizzo. Analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono stati misurati i livelli di corticosterone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ghiandole surrenali gioca un ruolo chiave nell'adattamento ambientale3. L'ormone che la corteccia surrenale secerne può regolare e regolare le funzioni fisiologiche e omeostasi3. Il modello in vivo riflette gli effetti reali fisiologici nel corpo. Tuttavia, ancora è influenzato da molti fattori complessi, causando effetti instabili negli esperimenti. Al contrario, il modello in vitro delle cellule ha vantaggi che lo rende incomparabile per il modello animale. In primo luogo, la condizione ambientale è facile da controllare nel sistema in vitro. Gli ormoni sono probabili di essere colpiti da qualsiasi stimolo. Esperimenti in vivo solito provocano una reazione non specifica perché gli animali sono inclini a disagio. In secondo luogo, le sostanze non sono facili da monitorare nel corpo ma sono responsabili nel sistema coltivato. In terzo luogo, il sistema in vitro riduce le varianze tra ogni esperimento indipendente. Molti rapporti scientifici mostrano una coltura di cellule corticosurrenali contenente 10 – 20% FBS12,13,14,15, considerando che il protocollo presentato qui utilizza il 5% di FBS e 2,5% di siero equino per mantenere il crescita di cellule adrenali fino ad una settimana.
Steroidogenesi sono iniziato dal clivaggio di colesterolo libero dagli enzimi del citocromo P450 fenditura della catena laterale. Come mostrato in Figura 1AB, le cellule adrenali presentano numerose e diverse dimensioni di goccioline lipidiche, suggerendo che è un buon strumento per lo studio della biologia steroide biosintesi e/o del lipido (fascicolata le cellule hanno grande e prominente del lipido goccioline)1,3. L'ADRP, noto anche come perilipina 2, è una proteina di superficie della gocciolina del lipido che assiste nel deposito di lipidi neutri entro le goccioline del lipido16. A causa di cellule corticosurrenali esibendo una quantità di lipidi, l'ADRP (o altre proteine di superficie della gocciolina del lipido, come perilipina) può essere usata per esaminare se gli agenti testati influenzano ormone sintesi16.
La crescita e la funzione delle ghiandole surrenali sono strettamente controllati da corticotropico-liberando l'ormone ipotalamico e ipofisario ACTH, neuropeptidi, neurotrasmettitori e fattori di crescita, ecc.17. Figura 1 rivela che la produzione di corticosterone significativamente è stata indotta dal trattamento di ACTH in modo concentrazione-dipendente. Inoltre, ACTH a 13 e 1 nM ha stimolato la produzione di corticosterone circa 30 - e 70-fold, rispettivamente. È stato dimostrato che cellule surrenale primarie coltivate giorno-3 presentano una migliore risposta alla stimolazione di ACTH15. Questo è anche il motivo perché la cultura di giorno-3 è stato utilizzato nello studio presente. Inoltre, la misurazione di corticosterone di kit ELISA è anche uno strumento semplice e facile per la ricerca. Pertanto, le cellule adrenali primari di ratto coltivate non solo forniscono la piattaforma per lo studio della steroidogenesi surrenalica ma possono anche applicare allo studio delle malattie infiammatorie.
I passaggi critici nel presente protocollo sono la digestione delle ghiandole surrenali e controllo della contaminazione. Di conseguenza, controllo del tempo di digestione, fisico forza di aspirazione e osservazione del livello di digestione del tessuto sono molto importanti per la sopravvivenza delle cellule. Inoltre, il metodo di taglio pelle e isolando le ghiandole surrenali è anche significativo. Sempre immergere tutti gli strumenti in etanolo al 70% al fine di prevenire qualsiasi contaminazione pelliccia animale. Al fine di ottenere più celle, la frequenza di aspirazione dovrebbe essere controllata meno di dieci volte durante ogni aspirazione. Inoltre, se la condizione dei tessuti non è buona per ulteriori passaggi, l'incubazione in contenente collagenasi medio non deve contenere più di 30 min.
Perché le ghiandole surrenali dei ratti sono piccole, lo strato di glomerulosa potrebbe andare perso durante il peeling della capsula surrenale. È stato dimostrato che decapsulamento ha provocato la rimozione della capsula del tessuto connettivo e l'intera zona glomerulosa18. Le ghiandole surrenali dei ratti maschii sono più piccole di quelle dei ratti femminili. Inoltre, le goccioline di lipidi sembrano essere maggiore in 11 mouse di femmina o maschio week-old6. Per quanto riguarda le celle disponibili, ratti femminili possono essere una buona scelta per gli esperimenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della National Science Consiglio Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) e un National Cheng Kung University Hospital Research Grant (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
