Summary
هرمون يفرز من قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. وهنا نقدم بروتوكولا لثقافة الفئران الابتدائي خلايا الغدة الكظرية. يمكن أن يكون منبرا جيدا في المختبر للتحقيق في آليات كاشف الفائدة في الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس والحيوي الدهن.
Abstract
الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية حيوية بالنسبة للحيوانات ضد الإجهاد والأمراض. الأسلوب الموصوفة هنا هو الإجراء من خلايا الغدة الكظرية الأولية الفئران مثقف والاختبارات الوظيفية ذات الصلة (الفلورة تلطيخ الدهني الحبرية البروتين السطحية، فضلا عن تحليل القشري). خلافا لنموذج في الحية، وتفاوت إينتيريكسبيريمينتس في ثقافات أحادي الطبقة الغدة الكظرية أقل وحالة تجريبية من السهل التحكم. وعلاوة على ذلك، أيضا مصدر للفئران أكثر استقرارا من غيرها من الحيوانات مثل الأبقار منها. وهناك أيضا عدة خطوط الخلايا البشرية الغدة الكظرية (NCI-H295، NCI-H295R، SW13، إلخ) التي يمكن استخدامها في الدراسات الغدة الكظرية. بيد سيتأثر إنتاج المنشطات من هذه الخطوط لا تزال بعوامل عديدة، والتي تشمل رقم الشحنة المصل، رقم مرور المسخ/فقدان الجينات متميزة، إلخ. باستثناء تفتقر إلى 17α-hydroxylase، ثقافة الفئران البطاني الخلايا الأولية تقنية أفضل وأكثر ملاءمة لدراسة فيزيولوجيا الغدة الكظرية. وباختصار، يمكن الثقافات الغدة الكظرية الأولية الفئران منصة في المختبر جيدة للباحثين للتحقيق في آليات الكاشف للفائدة في نظام الغدة الكظرية.
Introduction
نظام الغدد الصماء المسؤولة عن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية والتوازن1. الغدد الكظرية الموجودة في القطب الجمجمة الكلي هي أحد الأجهزة الرئيسية الغدد الصماء التي تفرز مينيرالوكورتيكويدس والكورتيزون الاندروجين2،3. هناك اثنين من الأجزاء المميزة في الغدة الكظرية: القشرة ولب. قشرة الغدة الكظرية تتكون من ثلاث طبقات: glomerulosa الخارجي، فاسسيكولاتا المتوسط، و قد الداخلية3. جلوميرولوسا زونا هو موقع المبيضي الأصلي الدوستيرون، مينيرالوكورتيكويد، الذي يساعد في استيعاب أيون الصوديوم والماء في الكلي3. وتنتج فاسسيكولاتا زونا أساسا مستوى القاعدي الكورتيزون في الظروف الفسيولوجية العادية3. القشرية في القوارض وهرمون الكورتيزول في قانون البشر مساعدة الهيئة في التعامل مع الإجهاد بتنظيم الجلوكوز في الدم3. إلى حد ما، أنها تمنع الردود التحريضية وتنظيم الجهاز المناعي4،5. خلافا لغيرها من الثدييات، والفئران والجرذان لا تملك قد زونا فنية نظراً لعدم وجود تعبير 17α-hydroxylase في6،الغدة الكظرية7. وهكذا، الغدة الكظرية من الفئران والجرذان تخلو من إفراز الغدة الكظرية C-19 المنشطات (هرمون الكورتيزول ومنشطات الغدة الكظرية).
خلايا البطاني مثقف الأولية أظهرت أن تكون مفيدة للتحقيق في آليات مراقبة فيزيولوجيا الغدة الكظرية8. مثل الأنسجة الأخرى ستيرويدوجينيك، يجمع كل منطقة الغدة الكظرية المنشطات من الكوليسترول الحرة9. عند تنشيط هرمون ﻫﺭﻣﻭﻧ (ACTH)، الكوليسترول الحر أطلق سراحه من قطرات الدهن انهيار، وهكذا، يعزز إنتاج الستيرويد في فاسسيكولاتا وقد10.
وحاولت العديد من المجموعات إنشاء خطوط الخلايا مستقرة من الأورام السرطانية البطاني. ومع ذلك، العديد من الشواغل محدودة استخدام خطوط الخلية البطاني كما هو الحال في المختبر نماذج8. قد تختلف الردود ستيرويد من خطوط الخلايا بين الممرات، والعدد الكثير من المصل، ونوعية المصل، إلخ. وعلاوة على ذلك، خطوط خلايا الغدة الكظرية التجارية (Y1 و SW13) لا تفرز القشري، مما يجعل من الصعب أكثر دراسة الغدة الكظرية ستيرويدوجينيسيس8. استخدام الغدة الكظرية الأبقار والخيول كما السابقين فيفو نماذج قد يكون اختياراً جيدا، على الرغم من الأنسجة من هذه الأسواق قد يحجب بعض المخاطر غير معروف. مقارنة لهم، إدارة الغدد الكظرية الجرذ أسهل والمصدر نسبيا أكثر استقرارا وخالية من مسببات الأمراض. أخذت معا، يمكن استخدام هذا الأسلوب الموصوفة هنا للتحقيق ذات الصلة إليه التوليف القشري في خلايا الغدة الكظرية فاسسيكولاتا الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة كاوشيونغ الطبية الجامعية.
1-الإجراء التجريبية
- التضحية الفئران SD الإناث والذكور البالغين (8 إلى 12 أسبوع من العمر) بالقتل الرحيم2 CO.
- تطبيق الإيثانول 70% والسماح لها يتم استيعابهم في الجلد ومن ثم مسح الجلد بورقة الأنسجة.
- وضعت الفئران في صفيحة بلاستيكية نظيفة في موقف ضعيف.
- رفع الجلد مع الملقط منحنى "الخارجية" في خط الوسط والقيام تشريح كليلة بإنشاء شكل "Y" (من مستوى الفخذ للزاوية سوبكوستال).
- شطف مقص مع الإيثانول 70%، وثم قطع العضلات، أيضا إنشاء شكل "Y".
-
البحث عن الغدة الكظرية اليسرى خلف المعدة.
ملاحظة: يمكن العثور على الغدة الكظرية اليمنى العميق وراء الكبد.- استخدام زوج واحد من الملقط لرفع المعدة أو الكبد وعزل الغدة الكظرية مع الملقط منحنى آخر.
- بعد وضع الغدد الكظرية في طبق عقيمة، بعناية إزالة الكبسولة الغدة الكظرية مع الملقط غرامة.
- مع زوج حساس من مقص، قص الغدة الكظرية إلى قطع صغيرة مع القليل القليل من دولبيكو خالية من المصل تعديل المتوسطة النسر (دميم)/F-12 المتوسطة.
-
إعداد ثلاثة مختلفة الحجم المسام باستور بيبيتس واستخدم بيبيت باستور الأولى لنضح كل قطعة الغدة الكظرية في أنبوب 50 مل مخروطية تحتوي على المتوسط مع كولاجيناز الثاني (~0.5–0.8 mg/mL).
- تريتوراتي بلطف قطع الأنسجة حول 10 x. استخدام باقي بيبيتس وكرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى تصبح كل قطعة أصغر.
ملاحظة: يمكن إنشاء أحجام مختلفة المسام بيبيتس باستور بتدفئة لهم بالنار. بيبيت الأول هو الحجم الأصلي (حوالي 1 ملم) وحجم المسام والثانية حوالي 0.8 ملم بيبيت باستور الثالث حوالي 0.5 ملم. أثناء الهضم، سيصبح أصغر القطع من الغدة الكظرية. وهكذا، عن طريق الإجراء الميكانيكية، الغدة الكظرية يمكن هضمها أكثر أكمل. احتضان الأنبوبة في حمام مائي (عند 37 درجة مئوية) واهتز كل 5 دقائق، x 4 في المجموع.
- تريتوراتي بلطف قطع الأنسجة حول 10 x. استخدام باقي بيبيتس وكرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى تصبح كل قطعة أصغر.
- وبعد تفريخ 20 دقيقة، إضافة متوسطة طازجة وباردة (ستة إضعاف حجم؛ وعلى سبيل المثال، 5 مل من الأنسجة + 25 مل من بارد دميم/و-12 المتوسطة) تحتوي على 2.5% الجنيني البقري المصل (FBS) ومصل الحصان 5% لوقف مفعول إنزيم.
- جمع الكريات الخلية باستخدام الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق.
- إضافة وحدة تخزين مناسبة من المتوسطة تعليق الخلايا.
ملاحظة: يمكن جعل كل الغدة حوالي ~ 3 × 105 إلى ~ 4 × 105 خلايا. - لوحة الخلايا في لوحات المطلوب أو أطباق مع متوسط النمو (1:1 [v/v] مزيج من دميم ولحم الخنزير في المتوسط F-12، تستكمل مع البنسلين هيبيس و 1% 25 مم وستربتوميسين) بين عشية وضحاها (يوم 0) عند 37 درجة مئوية، في بيئة هوميديفيد من 95% الهواء و 5% CO2.
ملاحظة: عادة، نحن لوحة خلايا في لوحات 24-جيدا (أربعة الغدد في اللوحة) للمقايسة القشري وفي 35 مم الأطباق (واحد غدة/حوالي واحد إلى اثنين من الأطباق) الغربية لطخة تحليل. - أغسل بعناية الخلايا 2 x مع خالية من مصل الدم الحار دميم/و-12 المتوسطة (1 يوم). استبدال المتوسطة النمو الجديدة.
- الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة هوميديفيد من 95% الهواء و 5% CO2 حتى يوم 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الإجراء الموضح هنا، يمكن تمييز خلايا الغدة الكظرية مثقف أولية تحت مجهر تباين مرحلة (الشكل 1A). لزيادة التأكيد على أن الحويصلات داخل السيتوبلازم قطرات الدهن، تلطيخ الفلورة من البروتينات الدهنية المتصلة بالتمايز (أدرب) يمكن أن تجري على الثقافات اليوم-3 (الشكل 1B). وقد نمت الخلايا على كوفيرسليبس الزجاج. الخلايا تم غسلها ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) والثابتة مع بارافورمالدهيد 4%. بعد الغسيل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، سدت الخلايا وبيرميبيليزيد مع 0.1% X-100 تريتون في اللبن الخالي 5%. جسم أدرب الابتدائي المخفف (01:50) في اللبن الخالي 5% وكان المحتضنة بين عشية وضحاها. بعد ثلاث مرات من الغسيل برنامج تلفزيوني، كانت المحتضنة الخلايا مع الماعز الأرنب المضادة الأجسام المضادة أليكسا فلور 488 الثانوي (1: 100). بعد تكرار الخطوات الغسيل، الخلايا تم تركيبة مع "إطالة أنتيفادي الذهب" تصاعد المتوسطة وبحثت تحت المجهر الأسفار. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تحددها القدرة المنتجة للهرمون من خلايا الغدة الكظرية الفئران القشري المقايسة. الحث على ACTH في خلايا الغدة الكظرية الفئران تصلح كعنصر إيجابي (الشكل 1). الوسائط التي تم جمعها كانت تضعف وجزيئي لمحتوى القشري، وفقا للإجراء المبين بها تشن et al.11.
رقم 1: توصيف خلايا الغدة الكظرية ورد القشري على علاج ACTH. (أ) صورة المرحلة-على النقيض من خلايا الغدة الكظرية الفئران مثقف الابتدائي يوم 3. (ب) أدرب تلطيخ يرد. (ج) يوم-3 خلايا الغدة الكظرية الفئران مثقف يعاملون مع ACTH (01:00 م و 1 نانومتر) ح 6. وسائل الإعلام تم جمعها وتخزينها في ثلاجة-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم قياس مستويات القشري بمقايسة الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الغدد الكظرية دوراً رئيسيا في التكيف مع البيئة3. ويمكن تنظيم الهرمونات التي تفرز قشرة الغدة الكظرية وضبط الوظائف الفسيولوجية والتوازن3. ويعكس نموذج المجراة في الآثار الفسيولوجية الحقيقية في الجسم. بيد أنها لا تزال تتأثر بالعديد من العوامل المعقدة، تتسبب في آثار غير مستقرة في التجارب. وفي المقابل، مزايا نموذج الخلايا في المختبر مما يجعله لا تضاهي لنموذج الحيوان. أولاً، الظروف البيئية من السهل التحكم في النظام في المختبر. الهرمونات التي يحتمل أن تتأثر بأي حافز. عادة ما ينتج التجارب المجراة في رد فعل غير محدد لأن الحيوانات المعرضة للخطر. ثانيا، هذه المواد ليست سهلة لرصد في الجسم لكن مسؤولاً في نظام مثقف. ثالثا، النظام في المختبر يقلل من الفروق بين كل تجربة مستقلة. إظهار التقارير العلمية العديد من وسائط الثقافة البطاني الخلايا التي تحتوي على 10 – 20% FBS12،13،،من1415، بينما قدم البروتوكول هنا يستخدم مصل الحصان FBS و 2.5% 5% للحفاظ على نمو خلايا الغدة الكظرية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
ستيرويدوجينيسيس الكاتب من الانقسام والكولسترول مجاناً السيتوكروم P450 الانقسام الجانب سلسلة الإنزيمات. كما هو مبين في الشكل 1 ألف، باء، خلايا الغدة الكظرية المعرض العديدة وأحجام مختلفة من قطرات الدهن، مما يوحي بأنها أداة جيدة لتحقيق البيولوجيا الحيوي و/أو المحتوى الدهني ستيرويد (الخلايا فاسسيكولاتا قد أبرز وأكبر في الدهون قطرات)1،3. أدرب، المعروف أيضا بيريليبين 2، هو سطح الحبرية دهن بروتين الذي يساعد في تخزين الدهون محايدة داخل قطرات دهن16. سبب البطاني الخلايا العارضة كمية من الدهون، وفي أدرب (أو البروتينات السطحية الحبرية الدهون الأخرى، مثل بيريليبين) يمكن استخدامها لفحص ما إذا كان وكلاء اختبار تؤثر على هرمون توليف16.
تخضع لرقابة مشددة على النمو ووظيفة الغدد الكظرية طائي كورتيكوتروبيك الإفراج عن هرمون الغدة النخامية ACTH، neuropeptides، والعصبية وعوامل النمو، إلخ17. 1 الشكل يكشف عن أن إنتاج القشري كبيرة حملت بعلاج ACTH بطريقة تعتمد على التركيز. وعلاوة على ذلك، ACTH في 01:00 م و 1 نانومتر وحفز إنتاج القشري حوالي 30--و 70-fold، على التوالي. وقد ثبت أن خلايا الغدة الكظرية الأولية مثقف اليوم-3 يحمل استجابة أفضل ل تحفيز ACTH15. هذا هو أيضا السبب لماذا استخدمت الثقافة اليوم-3 في هذه الدراسة. وباﻹضافة إلى ذلك، قياس القشري بطقم أليسا أيضا أداة سهلة وبسيطة للبحث. ولذلك، خلايا الغدة الكظرية الأولية الفئران مثقف ليس فقط توفير المنهاج لدراسة ستيرويدوجينيسيس الغدة الكظرية لكن قد تنطبق أيضا على التحقيق في الأمراض المرتبطة بالالتهابات.
الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول هي عملية الهضم من الغدة الكظرية، والسيطرة على التلوث. ولذلك، عنصر تحكم وقت الهضم وقوة الشفط المادية، ومراقبة مستوى الهضم الأنسجة مهمان جداً لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، طريقة قطع الجلد وعزل الغدة الكظرية أيضا كبيرة. دائماً تزج جميع الصكوك في الإيثانول 70% لمنع أي تلوث من فرو الحيوانات. وللحصول على المزيد من الخلايا، ينبغي التحكم تكرار الشفط أقل من عشر مرات خلال كل شفط. أيضا، إذا كان شرط الأنسجة ليست جيدة للمزيد من الخطوات، في الحضانة في احتواء كولاجيناز المتوسطة يجب أن لا تكون أطول من 30 دقيقة.
لأن الغدد الكظرية للفئران الصغيرة، قد تضيع طبقة جلوميرولوسا أثناء تقشير الكبسولة الغدة الكظرية. وقد ثبت أن إلغاء التغليف أسفرت عن إزالة الكبسولة النسيج الضام و كامل zona glomerulosa18. الغدد الكظرية للفئران الذكور أصغر من تلك التي لإناث الفئران. بالإضافة إلى ذلك، تظهر قطرات الدهن لتكون أكبر في الأسبوع من العمر 11 الفئران الذكور أو الإناث6. فيما يتعلق بالخلايا المتوفرة، إناث الفئران قد يكون خياراً جيدا لإجراء تجارب عليها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل بمنحه من تايوان مجلس العلوم الوطني (NSC102-2320-B-037-008-MY3) والوطني تشنغ-الكونغ "جامعة مستشفى منحة بحثية" (نكوه-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
