Summary
Det hormon, der udskilles af binyrebarken er afgørende for dyr mod stress og sygdomme. Vi præsenterer her, en protokol til kultur den primære rotte adrenal celler. Det kunne være en god in vitro-platform for at undersøge mekanismerne af reagens interesse for adrenal steroidogenesis og lipid biosyntesen.
Abstract
Det hormon, som binyrebarken udskiller er afgørende for dyr mod stress og sygdomme. Metoden beskrevet her er proceduren for primære kulturperler rotte adrenal celler og relaterede funktionelle assays (immunofluorescens farvning af lipid droplet overflade proteiner samt corticosterone analyse). I modsætning til en in vivo model, variation af interexperiments i adrenal éncellelag kulturer er mindre og den eksperimentelle betingelse er nemme at kontrollere. Desuden er kilde til rotter også mere stabil end andre dyr som kvæg ones. Der er også flere menneskelige adrenal cellelinjer (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.), der kan bruges i adrenal undersøgelser. Steroid produktion af disse linjer vil dog stadig påvirkes af mange faktorer, som omfatter serum lotnummer, passage nummer, mutant/tab af forskellige gener, osv. Bortset fra mangler 17α-hydroxylase, er den primære kultur af rotte binyrebarkhormon celler en bedre og mere bekvem teknik til at studere adrenal fysiologi. I Resumé, kan primære rotte adrenal kulturer være en god in vitro-platform for forskere at efterforske mekanismerne af reagens interesse i binyrerne system.
Introduction
Det endokrine system er ansvarlig for at regulere fysiologiske aktiviteter og homøostase1. Binyrerne ligger på den kranielle pol i nyrerne er en af de største endokrine organer, som udskiller mineralkortikoider og glukokortikoider androgen2,3. Der er to adskilte dele af binyrerne: cortex og medulla. Binyrebarken består af tre lag: den ydre glomerulosa, den mellemliggende fasciculata og indre reticularis3. Zona glomerulosa er den oprindelige secernerende af aldosteron, en mineralocorticoid, som aids i reabsorbing natrium ion og vand i nyrerne3. Zona fasciculata producerer primært en basal grad af glukokortikoider i normale fysiologiske forhold3. Kortikosteroider i gnavere og cortisol hos mennesker handle for at hjælpe kroppen med at klare stress ved at regulere blod glucose3. Til en vis grad kan hæmme inflammatoriske respons og regulere immunsystemet4,5. I modsætning til andre pattedyr, mus og rotter ikke har en funktionel zona reticularis på grund af manglen på en 17α-hydroxylase udtryk i binyrerne6,7. Binyrer fra mus og rotter er således blottet for udskillelsen af adrenal C-19 steroider (kortisol og adrenale androgener).
Primære kulturperler binyrebarkhormon celler har vist sig at være nyttige for efterforskningen mekanismer kontrollerende adrenal fysiologi8. Ligesom andre steroidogene væv syntetiserer hver adrenal zone sin steroider fra gratis kolesterol9. Ved adrenocorticotropt (ACTH) hormonstimulation, gratis kolesterol slippes fra fordelingen lipid dråber, og dermed forbedrer steroid produktion i fasciculata og reticularis10.
Mange grupper har forsøgt at etablere stabile cellelinjer fra binyrebarkhormon karcinomer. Men flere bekymringer har begrænset brug af binyrebarkhormon cellelinjer som in vitro modeller8. De steroid svar af cellelinjer kan variere mellem passager, lotnummeret for serum og kvaliteten af serum, osv. Derudover udskiller kommercielle adrenal cellelinjer (Y1 og SW13) ikke corticosteron, hvilket gør det vanskeligere at studere adrenal steroidogenesis8. Ved hjælp af kvæg og enhovede dyr binyrer som ex vivo modeller kan være et godt valg, selvom væv fra disse markeder kan sløre nogle ukendte risici. Sammenlignet med dem, forvaltningen af rotte binyrerne er lettere og kilden er relativt mere stabil og patogenfrie. Tilsammen, kunne den nuværende metode beskrevet her bruges til at undersøge den relaterede mekanisme af corticosterone syntese i rotte adrenal fasciculata celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de procedurer, herunder animalske emner er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Kaohsiung medicinske universitet.
1. eksperimentel Procedure
- Ofre voksen (8 til 12 uger gamle) kvinde/mand SD rotter af CO2 eutanasi.
- Anvende 70% ethanol og lad det blive absorberet i huden, og derefter tørre hud med en silkepapir.
- Sæt rotten på en ren plast plade i den liggende stilling.
- Løft huden med "eksterne" buet pincet på midterlinjen og udføre en stump dissektion ved at skabe et "Y" form (fra niveauet af låret til den subcostal vinkel).
- Skyl saks med 70% ethanol, og derefter skære den muskel, også at skabe et "Y"-form.
-
Find den venstre binyre kirtel bag maven.
Bemærk: den højre binyre kan findes dybt bag leveren.- Brug et par pincet til at løfte maven eller leveren og isolere binyrer med en anden buet pincet.
- Efter at sætte binyrerne i en steril skål, Fjern forsigtigt den adrenal kapsel med fine pincet.
- Med en delikat saks, skåret binyrer i små stykker med en lille smule af serumfrit Dulbecco ændrede Eagle's medium (DMEM) / F-12 medium.
-
Forberede tre forskellige pore-størrelse Pasteur pipets og bruge den første Pasteur pipette til Opsug de adrenal stykker i en 50 mL konisk rør indeholdende medium med collagenase II (~0.5–0.8 mg/mL).
- Forsigtigt hakkede væv stykker omkring 10 x. Brug resten af pipets og Gentag ovenstående trin, indtil alle brikkerne bliver mindre.
Bemærk: De forskellige pore størrelser af Pasteur pipets kan oprettes ved at opvarme dem med ild. Den første pipette er den oprindelige størrelse (ca. 1 mm), porestørrelse af den other sig er omkring 0,8 mm, og den tredje Pasteur pipette er ca 0.5 mm. Under fordøjelsen bliver stykker af adrenal mindre. Således via proceduren mekaniske kan binyrer fordøjes mere gennemført. Inkuber rør i et vandbad (ved 37 ° C) og ryst det hvert 5 min, 4 x i alt.
- Forsigtigt hakkede væv stykker omkring 10 x. Brug resten af pipets og Gentag ovenstående trin, indtil alle brikkerne bliver mindre.
- Efter 20 min inkubation, tilføje frisk og kølig medium (seksdobling volumen; for eksempel, 5 mL af væv + 25 mL af cool DMEM/F-12 medium) indeholdende 2,5% føtal bovint serum (FBS) og 5% hest serum til at stoppe effekten enzym.
- Indsamle celle pellets ved centrifugering ved 800 x g i 10 min.
- Tilsættes en passende mængde af medium til at suspendere cellerne.
Bemærk: Hver kirtel kan gøre omkring ~ 3 x 105 ~ 4 x 105 celler. - Plade celler i ønskede plader eller retter med vækstmediet (1:1 [v/v] blanding af DMEM og skinkes F-12 medium, suppleret med 25 mM HEPES og 1% penicillin og streptomycin) overnatning (dag 0) ved 37 ° C i en fugtig miljø af 95% luft og 5% CO2.
Bemærk: Normalt, vi plade celler i 24-godt plader (fire kirtler/plade) for corticosterone analysen og i 35 retter (en kirtel/ca 1-2 retter) for western blot mm analyse. - Forsigtigt vaske celler 2 x med serumfrit varm DMEM/F-12 medium (dag 1). Erstatte den nye vækstmediet.
- Vedligeholde celler ved 37 ° C i en fugtig miljø af 95% luft og 5% CO2 indtil dag 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den beskrevne procedure her, kunne primære kulturperler adrenal celler skelnes under et fasekontrast mikroskop (figur 1A). For at bekræfte yderligere at vesikler i cytoplasma er lipid dråber, kunne immunofluorescens-farvning af fedt differentiering-relaterede protein (ADRP) udføres på dag-3 kulturer (figur 1B). Celler blev dyrket på glas coverslips. Cellerne blev vasket tre gange med fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og fast med 4% PARAFORMALDEHYD. Efter vask tre gange med PBS, cellerne blev blokeret og permeabilized med 0,1% Triton X-100 i 5% nonfat mælk. Den primære ADRP antistof blev fortyndet (1:50) i 5% nonfat mælk og blev inkuberet natten over. Efter tre gange med PBS vask, blev cellerne inkuberes med ged anti-kanin Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer (1: 100). Efter gentagne vask trin, cellerne var monteret med forlænge guld Antifade montering medium og blev undersøgt under fluorescens mikroskop. Desuden kunne mulighed for hormon-producerende binyre celleområde rotte bestemmes af corticosterone assay. Stimulation af ACTH på rotte adrenal celler kunne tjene som positiv kontrol (figur 1 c). De indsamlede medier blev fortyndet og analyseres for corticosterone indhold, efter proceduren beskrevet af Chen et al.11.
Figur 1: karakterisering af adrenal celler og corticosteron reaktion på ACTH behandling. (A) fase-kontrast billede af dag-3 primære kulturperler rotte adrenal celler. (B) ADRP farvning er vist. (C) dag-3 kulturperler rotte adrenal celler blev behandlet med ACTH (1 pM og 1 nM) til 6 h. Medierne blev indsamlet og lagret i-80 ° C køleskab indtil brug. Corticosterone niveauer blev målt ved enzymmaerket assay (ELISA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Binyrerne spiller en nøglerolle i miljømæssig tilpasning3. Hormon som binyrebarken udskiller kan regulere og justere fysiologiske funktioner og homøostase3. In vivo modellen afspejler de reelle fysiologiske virkninger i kroppen. Det er dog stadig påvirket af mange komplicerede faktorer, forårsager ustabilt effekter i eksperimenter. Derimod har in vitro celle model fordele som gør det mageløse dyr model. Først, den miljømæssige tilstand er nemme at kontrollere i in vitro-systemet. Hormoner er sandsynligvis vil blive berørt af eventuelle stimulus. In vivo forsøg resultere normalt i en uspecifik reaktion, fordi dyrene er udsat for nød. For det andet stofferne er ikke let at overvåge i kroppen men hæfter i kulturperler systemet. For det tredje, in vitro-systemet reducerer afvigelser mellem hver uafhængig eksperiment. Mange videnskabelige rapporter viser en kultur medier af binyrebarkhormon celler, der indeholder 10-20% FBS12,13,14,15, der henviser til, at protokollen præsenteres her bruger 5% FBS og 2,5% hest serum til at opretholde den vækst af adrenal celler i op til en uge.
Steroidogenesis er startet fra kavalergang gratis kolesterol af cytokrom P450 side-chain kavalergang enzymer. Som vist i figur 1AB, adrenal celler udviser mange og forskellige størrelser af lipid dråber, tyder på, det er et godt redskab for undersøgelse af steroid biosyntese og/eller lipid biologi (fasciculata celler har fremtrædende og større lipid dråber)1,3. ADRP, også kendt som perilipin 2, er et lipid droplet overflade protein, som bistår i opbevaring af neutrale lipider i lipid dråber16. På grund af binyrebarkhormon celler udstiller et beløb af lipid, ADRP (eller andre lipid droplet overflade proteiner, som perilipin) kan bruges til at undersøge, om de testede agenter påvirker hormon syntese16.
Vækst og funktion af binyrerne er stramt kontrolleret af hypothalamus corticotropic-releasing hormon og hypofysens ACTH, neuropeptider, neurotransmittere og vækstfaktorer, etc.17. Figur 1 c viser, at corticosterone produktion væsentligt blev induceret af ACTH behandling i en koncentration-afhængige mode. Derudover ACTH kl 1 og 1 nM stimuleret corticosterone produktion omkring 30 - og 70-fold, henholdsvis. Det er blevet påvist, at dag-3 kulturperler primære adrenal celler udviser en bedre reaktion på ACTH stimulation15. Dette er også grunden til hvorfor dag-3 kultur blev brugt i den foreliggende undersøgelse. Måling af corticosterone af ELISA kit er derudover også en enkel og let værktøj til forskning. Derfor, de primære kulturperler rotte adrenal celler ikke kun give platformen til at studere adrenal steroidogenesis men kan også anvendes til undersøgelse af inflammatoriske-relaterede sygdomme.
De kritiske trin i denne protokol er fordøjelsen af binyrer og bekæmpelse af forurening. Kontrol af fordøjelsestid, fysiske suge kraft og observation af væv fordøjelsen plan er derfor meget vigtigt for celle overlevelse. Desuden, metoden til skære huden og isolere binyrer er også betydelig. Altid nedsænke alle instrumenter i 70% ethanol til at forhindre enhver forurening af dyrehår. For at opnå flere celler, bør den suge frekvens kontrollerede mindre end ti gange under hvert sug. Også, hvis betingelsen af væv ikke er godt for yderligere trin, inkubation i collagenase-holdige medium bør ikke være længere end 30 min.
Fordi binyrerne af rotter er små, gå laget glomerulosa tabt under peeling af adrenal kapslen. Det er blevet påvist, at udpakning resulteret i fjernelsen af bindevæv kapsel og hele zona glomerulosa18. Binyrerne af mandlige rotter er mindre end de af hunrotter. Derudover synes lipid dråber at være større i 11 uge-forhenværende kvindelig eller mandlig mus6. Med hensyn til de ledige celler, kan hunrotter være et godt valg for eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Science Rådet Taiwan (NSC102-2320-B-037-008-MY3) og nationale Cheng Kung University Hospital forskning tilskud (NCKUH-10102045).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female/male, SD/Wistar rats (8-12 weeks) | BioLASCO | male or femal rats are suitable for experiments. Female's adrenal glands are larger than male rats, however, female rats own the oestrous cycles that may influence the experiments | |
| Collagenase, type II | Sigma | C-6885 | isolation of adrenal cells |
| DMEM | ThermoFisher | 12800-017 | powder media for adrenal cells |
| Ham's F12 | ThermoFisher | 21700-075 | powder media for adrenal cells |
| HEPES | JT.baker | 4018 | buffer (powder) |
| NaHCO3 | JT.baker | 3506-1 | |
| Horse serum | Hyclone | 16050014 | |
| Fetal bovine serum | SAFC | 12103C | |
| Penicillin (10,000 U)-streptomycin (10,000 ug/mL) | Corning | 30-002-Cl | antibiotics |
| Curved forceps | BRAUN | BD343R | |
| Forceps | BRAUN | BD331R | |
| Scissor | BRAUN | BC224R | cut rat skin and muscle |
| Delicate scissor | BRAUN | BC101R | cut adrenal glands |
| Adipose-differentiation related protein | Abcam | ab108323 | antibody for lipid droplet associated protein |
| Corticosterone ELISA kit | cayman | 500655 | assay for corticosterone synthesis |
| Inverted light microscopy | Leica | ||
| Fluorescence microscope | Nikon | ||
| Triton X-100 | JT.baker | X198-07 | for immunofluorescence staining |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 488 Fluor secondary antibody | ThermoFisher | A-11034 | for immunofluorescence staining |
| Anti-ADFP | Abcam | 108323 | for immunofluorescence staining |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher | P36935 | for immunofluorescence staining |
References
- Frith, C. H. Histology, Adrenal Gland, Mouse. Endocrine System. Monographs on Pathology of Laboratory Animals. Jones, T. C., Mohr, U., Hunt, R. D., Capen, C. C. , Springer. Berlin, Heidelberg. 8-12 (1983).
- Keegan, C. E., Hammer, G. D. Recent insights into organogenesis of the adrenal cortex. Trends in Endocrinology Metabolism. 13 (5), 200-208 (2002).
- Marieb, E., Wilhelm, P. B., Mallatt, J. Chapter 17: The Endocrine System. , 558-581 (2017).
- Chrousos, G. P. The hypothalamic-pituitary-adrenal axis and immune-mediated inflammation. New England Journal Medicine. 332 (20), 1351-1362 (1995).
- Bornstein, S. R., Rutkowski, H., Vrezas, I.
- Bielohuby, M., et al. Growth analysis of the mouse adrenal gland from weaning to adulthood: time- and gender-dependent alterations of cell size and number in the cortical compartment. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 293 (1), E139-E146 (2007).
- van Weerden, W. M., Bierings, H. G., van Steenbrugge, G. J., de Jong, F. H., Schroder, F. H. Adrenal glands of mouse and rat do not synthesize androgens. Life Sciences. 50 (12), 857-861 (1992).
- Wang, T., Rainey, W. E. Human adrenocortical carcinoma cell lines. Molecular and Cellular Endocrinology. 351 (1), 58-65 (2012).
- Payne, A. H., Hales, D. B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones. Endocrine Review. 25 (6), 947-970 (2004).
- Ruggiero, C., Lalli, E. Impact of ACTH Signaling on Transcriptional Regulation of Steroidogenic Genes. Frontiers in Endocrinology. 7, 24 (2016).
- Chen, Y. C., Liang, Y. L., Huang, Y. L., Huang, B. M. Mechanism of Toona sinensis-stimulated adrenal steroidogenesis in primary rat adrenal cells. Journal of Functional Foods. 14 (2015), 318-323 (2015).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. I. Culture conditions for optimal growth and function. In Vitro. 17 (7), 599-604 (1981).
- Rybak, S. M., Ramachandran, J. Primary culture of normal rat adrenocortical cells. II. Quantitation of steroid dehydrogenase stain. In Vitro. 17 (7), 605-611 (1981).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Steroid metabolism by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 58 (3), 447-462 (1973).
- Di Blasio, A. M., Fujii, D. K., Yamamoto, M., Martin, M. C., Jaffe, R. B. Maintenance of cell proliferation and steroidogenesis in cultured human fetal adrenal cells chronically exposed to adrenocorticotropic hormone: rationalization of in vitro and in vivo findings. Biology of Reproduction. 42 (4), 683-691 (1990).
- Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. Journal of Lipid Research. 48 (12), 2547-2559 (2007).
- Hoeflich, A., Bielohuby, M. Mechanisms of adrenal gland growth: signal integration by extracellular signal regulated kinases1/2. Journal of Molecular Endocrinology. 42 (3), 191-203 (2009).
- O'Hare, M. J., Neville, A. M. Morphological responses to corticotrophin and cyclic AMP by adult rat adrenocortical cells in monolayer culture. Journal of Endocrinology. 56 (3), 529-536 (1973).
