Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Bu iletişim kuralı ile lizin-tirozin-fenilalanin (KYF) tripeptit stabilize bir oleik acids-platinum(II) eşlenik nanoemulsion sentezlemek için verimli bir yöntem açıklanır. Nanoemulsion formlar KYF ve eşlenik olmasını, kendinden montajlı yolu ile hafif sentetik koşullar altında.

Abstract

Biz bir oleik acids-Pt(II) çekirdek ve lizin-tirozin-fenilalanin (KYF) kaplama (KYF-Pt-NE) oluşan bir nanoemulsion üretmek için bir yöntem açıklanmaktadır. KYF-Pt-NE Pt(II) 10 Wt % saklar, 107 ± 27 nm ve negatif bir yüzey yük çapındadır. KYF-Pt-NE su ve serum stabil ve biyolojik olarak aktif. Bir fluorophore KYF için konjugasyon biyolojik görüntüleme için uygun bir floresan nanoemulsion sentezini sağlar. Nanoemulsion sentezi sulu bir ortam ve kısa bir KYF peptid ve oleik acids-platinum(II) eşlenik, kendinden montajlı KYF-Pt-NE formları yoluyla gerçekleştirilir. Kendinden montajlı işlem bağlıdır çözüm sıcaklığını yüzeylerde molar oranı ve akış hızı substrat ilavesi. Çok önemli adımlar sentezi sırasında en iyi karıştırma oranı korumak, kendinden montajlı için yeterli zaman izin ve nanoemulsion yavaş yavaş santrifüj yoğunlaştırıcı içinde ön zenginleştirme içerir.

Introduction

Son yıllarda, ilaç dağıtım ve bioimaging1,2,3,4Biyomedikal gibi uygulamalar için nano tanecikleri mühendislik büyüyen bir ilgi olmuştur. Nanoparçacık tabanlı sistemler Çokişlevlilik kez bir formülasyon içinde birden çok bileşeni ekleme gerektirir. Lipidler veya polimerler kez temel yapı taşlarını fizikokimyasal özellikleri yanı sıra Biyouyumluluk ve sonuçta nanostructure1, işlevini etkileyebilir biodegradability açısından farklılık 5,6. Proteinler ve peptidler, gibi biyolojik olarak türetilen malzeme uzun onların sıra esneklik7,8nedeniyle çok fonksiyonlu nanoyapıların umut verici bileşenleri olarak kabul edilmiştir. Peptidler Helisel oluşturan yüksek sıralı supramolecular mimarileri kendi kendine araya şerit9,10, fibröz iskele11,12ve adl daha, böylece bina önünü bir alt-up kullanarak biomolecule tabanlı melez nanoyapıların13yaklaşım.

Peptidler için ilaç ve biyoteknoloji, özellikle antikanser terapi14 ve antibiyotik geliştirme16,17, metabolik gelince kalp-damar hastalıkları15 de uygulamaları incelemiş bulunuyoruz bozuklukları18ve enfeksiyonlar19. Üzerinde yüzlerce klinik çalışmalar20geçiren küçük-peptid tedavi vardır. Peptidler değiştirmek için ve düşük maliyetle hızlı sentezlemek için kolaydır. Buna ek olarak, hangi büyük ölçüde onların biyolojik ve ilaç uygulamaları21,22kolaylaştırır biyolojik olarak parçalanabilir, bunlar. Duyarlı, peptid tabanlı nano tanecikleri ve hidrojel depoları kontrollü yayın23,24,25,26 mühendislik peptidler yapısal bileşenleri olarak kullanımını içerir , 27, peptid tabanlı biyosensörler28,29,30,31veya bio-elektronik aygıtlar32,33,34. Önemlisi, fenilalanin içeren iki ya da üç amino asit kalıntıları eklenmesi ile bile kısa peptidler kılavuzu bulundu kendinden montajlı35,36,37 işler ve stabilize emülsiyonlar38 oluşturmak .

Onların yüksek etkinlik sayesinde Platin bazlı ilaçlara birçok kanser tedavi rejimleri hem tek başına hem de diğer ajanlar39,40ile birlikte kullanılır. Platin bileşikler, monoadducts ve intrastrand veya interstrand çapraz bağlantılar oluşturarak DNA hasar ikna etmek. Pt-DNA lezyonlar hücresel makine tarafından tanınır ve eğer tamir değil, hücresel apoptosis için yol. Hangi Pt(II) kanser hücre ölümüne katkıda en önemli, DNA transkripsiyon41,42inhibisyonu mekanizmadır. Ancak, Platin tedavisinin yararları ciddi yan etkileri tetikler Pt(II) Sistemik toksisite tarafından azalır. Bu Pt(II)43kez DNA ulaşan Platinum alt terapötik konsantrasyonlarda sonuçları, alt klinik dozaj için yol açar. Sonuç olarak, izleyen DNA tamiri kanseri hücre yaşam ve Pt(II) direnç elde katkıda bulunmaktadır. Antikanser terapi ve tedavi başarısızlığı44,45ana nedeni Platin kemoterapi direnci önemli bir sorundur.

Sistemik dolaşıma koruyucu bir etki sağlamak ve Pt II kaynaklı yan etkileri azaltmak için Pt(II) Ajan kapsüller istikrarlı bir nanosystem geliştirdik. Sistem bir nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46oluşturmak için KYF tripeptit ile stabilize bir oleik acids-Pt(II) çekirdek temel alır. KYF-Pt-NE, tripeptit hem de oleik asit, amino asitler yapı taşları ile gıda ve İlaç Dairesi (FDA) genel olarak tanınan olarak güvenli (GRAS) durumunda. KYF-Pt-NE bir nanoprecipitation yöntemi47kullanılarak hazırlanır. Kısacası, oleik acids-Pt(II) eşlenik organik bir çözücü içinde çözünmüş ve sonra dropwise 37 ° C'de sulu bir KYF çözüm (şekil 1) eklendi Çözümü birkaç saat KYF-Pt-ne kendinden montajlı izin karıştırılır Nanoemulsion 10 kDa santrifüj yoğunlaştırıcıları içinde konsantre ve üç kere su ile yıkanır. Bir fluorophore ile KYF kimyasal modifikasyonu floresan FITC-KYF-Pt-NE sentezi Biyomedikal görüntüleme için uygun sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. oleik Acids–Platinum(II) eşlenik sentezi

  1. Sisplatin aktivasyonu
    1. 60 ° C'de 50 mg (0,167 mmol) sisplatin 4 ml su (örneğin, nanopure) askıya
    2. Dropwise 55.2 mg (0.325 mmol) AgNO3 sisplatin 0.5 mL su ekleyin ve en az 2 h için tepki 60 ° C'de ilave edin. AgCl beyaz çökelti tepki ilerlemesini gösteren oluşturacak.
    3. Testi ile % 10 harekete geçirmek reaksiyon tamamlandıktan belirlemek için HCl ücretsiz Ag+ iyon çözümde varlığı için. Testin negatif olması gerekir (hiçbir ek AgCl çökelti oluşturması gerektiğini).
    4. 3,220 x g 10 min için tepki karisimin santrifüj kapasitesi ve AgCl beyaz çökelti kaldırın.
    5. Süpernatant toplamak ve 0.2 mm şırınga filtre ile filtre. Süpernatant Platin varlığı için eriyik yolu ile Pasteur pipet 2-3 damla SnCl2 kristal uygulayarak test edin. Kalay platinum ile koordinat karmaşık rengini koyu sarı/turuncu ise pozitif bir testtir.
    6. Süpernatant ile aktif Pt(II) ikinci adım için kullanın.
  2. Aktif Pt(II) ile oleik asitin reaksiyonu
    1. Oleik asitin esterleri (0.333 mmol) 94.2 mg 3 mL su 60 ° C'de askıya
    2. 13,3 mg (0.333 mmol) NaOH ile 1 mL su ve harekete geçirmek Pt(II) adım 1.1 çözüm ile karıştırın
    3. Reaksiyon 2s için 60 ° C'de ve oda sıcaklığında sonraki gecede karıştırın. Yağlı bir sarı/kahverengi küçülmesinihızlandırmalı ham ürünüdür.
    4. 3,220 x g 10 min için tepki karisimin santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın. Rotary Evaporatör kullanarak 25 ° C'de ham ürün kuru. Asetonitril ile birden fazla yıkama tarafından ürün arındırmak. Son saf oleik acids–Pt(II) eşlenik soluk sarı renktedir.

2. KYF-Pt-NE sentezi ve FITC etiketli Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. KYF tripeptit ve fluorescently etiketli tripeptit FITC-KYF sentezi
    1. Çift katı hal peptid kimya kullanarak KYF sentez. Her amino asit bağlamak için aşağıdaki standart koşullar kaplin kullanın: Wang reçine (2,19 mmol), korumalı Fmoc amino asit (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4,38 mmol) ve diisopropylethylamine (DIPEA) (8,76 mmol). Dimethylformamide (DMF) TBTU ile amino asitlerin dağıtılması ve DIPEA.
    2. DMF 25 ml 1 kullanılmadan önce s için Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alkol reçine (0.382 meq/g) 5,7 gram soak.
    3. L-fenilalanin amino asit Amin grubu 15 mL 5 min için % 20 Piperodin/DMF çözeltisi ile deprotect, solvent atmak ve yıkama 20 dk döngüsü ile yineleyin.
    4. Aşağıdaki maddeleri ile 1 dk. için reçine yıkama: DMF, izopropil alkol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Çözücü her yıkama sonra atın.
    5. Ücretsiz NH2 grup reçine üzerinde varlığını belirlemek için Kaiser testi (adımlar bakınız) ve pozitif (reçine tohum mor), Fmoc-L-tirozin amino asit ekler ve kaplin gerçekleştirmek bir gecede.
      1. Kaiser test çözümleri ayrı şişelerde hazırlayın.
      2. 100 ml etanol ninhydrin 5 g geçiyoruz.
      3. Fenol 20 ml etanol 80 g geçiyoruz.
      4. 2 mL potasyum siyanür ile 0,001 M sulu çözüm mix
        pyridine 98 mL.
      5. 2-3 damla her Kaiser çözümleri örnek ve ısı 5 min için kaynar suda ekleyin.
    6. Üzerine başarılı kaplin ikinci amino asitin Kaiser testi gerçekleştirmek ve negatif deprotection Protokolü (Adım 2.1.3-2.1.5) ile devam ederseniz. Fmoc-fenilalanin amino asit ile işlemi tekrarlayın.
      1. Her yıkama atmak sonra çözücü üzerine kaplin tüm amino asitlerin reçine DMF, IPA, DMF, metanol, diklorometan ve Dietil eter, 5 mL ile 1 dakika yıkayın. Daha fazla işlem için reçine kaydedin.
      2. Reçine yarısı peptid FITC ile değiştirmek için sonraki adımlar (2.1.7-2.1.9) için kullanın. Değiştirilmemiş KYF tripeptit elde etmek için 2.1.10 başlatma yordamı izleyin.
    7. KYF KYF-N3 6-azidohexanoic asit ile N-terminal amino asit değiştirin. Bu amaçla, 1 g (0.382 mmol) KYF Wang reçine ve 120.1 mg (0.764 mmol) 6-azidohexanoic asit 245.2 mg (0.764 mmol) ile TBTU ve DMF 30 ml 197.1 mg (1.528 mmol) DIPEA karıştırın. Reaksiyon gecede oda sıcaklığında karıştırın.
    8. KYF-FITC propargyl floresein üzerinden bir tıklama tepki ile KYF-N3 sentezi ile alın. Bu amaçla, 253 mg (0,097 mmol) KYF N3 / Wang reçine 3.78 mg (0,019 mmol) CuI katı, 71.9 mg (0,193 mmol) propargyl floresein ve 2,24 mg (0.017 mmol) DIPEA ile karıştırın. Reaksiyon kahverengi yeşil renk değiştirir.
    9. 24 saat sonra reçine için 1 dk 5 mL metanol ve üç kere su, DMF ve su üç kez, beş kere DMF ve IPA ile dönüşümlü olarak ve diklorometan ve Dietil eter ile üç kez yıkayın. Çözücü her yıkama sonra atın.
    10. Reçine trifluoroacetic asit (TFA) bir çözüm ile gelen KYF-FITC veya KYF peptid ayırmak / triisopropylsilane (/ h2O 95/2.5/2.5 oranında 3 saatten fazla ipuçları).
    11. Bir soğuk Dietil eter, üç kez soğuk eter ile yıkama ve daha sonra kuru vakum altında ham peptid çökelti.
  2. FITC KYF stabilize nanoemulsion Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) ve KYF-Pt-NE ile sentezi
    1. 10 mg (0.0126 mmol) oleik acids–Pt(II) eşlenik isopropanol 1,5 ml ve 5 mL şırınga yerinde geçiyoruz.
    2. Oleik acids–Pt(II) eşlenik şırınga bir enjektör pompası yerleştirin ve akışını 0.1 mL/dk için ayarlayın.
    3. FITC-KYF-Pt-NE sentezlemek için 1 mg (0.00105 mmol) FITC-KYF ve 1 mg (0.00219 mmol) KYF çözmek (FITC molar oranı 1:2-KYF:KYF) 20 ml su ve çözüm ile 37 ° c sıcaklık ayarlama Kapsayıcı FITC fluorophore photobleaching önlemek için alüminyum folyo ile duvarlar kapsayacak. KYF-Pt-NE sentezlemek için KYF tripeptit 20 ml su, 2 mg (0.0044 mmol) dağıtılması ve çözüm ile 37 ° c sıcaklık ayarlama
    4. Oleik acids–Pt(II) eşlenik dropwise FITC-KYF/KYF veya KYF tripeptit çözüme ekleyin. Başlık altında bu adımı gerçekleştirin.
    5. Çözüm gecede oda sıcaklığında izin veren ve organik çözücüler buharlaşır için heyecan FITC-KYF-Pt-ND veya KYF-Pt-ne, kendinden montajlı
    6. FITC-KYF-Pt-ND veya KYF-Pt-NE bir santrifüj yoğunlaştırıcı konsantre (10k MWCO) ve üç kez 4 mL nanopure su ile yıkayın.
    7. KYF-Pt-NE ve FITC-KYF-Pt-NE sulu çözümler 4 ° C'de depolayın
    8. Atomik Absorpsiyon spektroskopisi (AAS), üretici Kılavuzu48takip kullanarak Platin içerik için analiz.
      1. Platin standartları % 10 HCl çözümünde kalibrasyon eğrisi için hazırlamak (AAS için etkili menzili olan 100 ila 1.200 app (milyar başına parçaları) arasında).
      2. KYF-Pt-NE eriyik--dan adım 2.2 100 µL aqua regia (3:1 konsantre hidroklorik asit, nitrik asit karışımı), 50 µL dağıtılması ve oda sıcaklığında gece bırakın. 850 µL son numune hacmi 1 ml ulaşmak için su ekleyin. AAS kullanarak örneğini analiz. Son asit konsantrasyonu %10 tüm analiz örnekleri içinde olmalıdır.
      3. App içinde Pt konsantrasyon okuma kaydetmek ve son Platin içeriği örnek (Numune dilüsyonu ve nanoemulsion ilk hacmi için hesabı) hesaplamak.

3. confocal görüntüleme FITC-KYF-Pt-NE hücresel Alım

  1. 6 yumurtalık kanseri hücre satır (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G ve ES2), 4,7 x odası başına 104 hücre yoğunluğu 4 iyi-odası confocal yemeklerinin içine tohum ve gecede 37 ° C'de önceden kültür
  2. 24 saat sonra fosfat tampon serum (PBS) üç kez hücrelerle yıkama ve FITC-KYF-Pt-NE hücre kültürü ortamında kuluçkaya (bkz. Adım 6.1 hücre için belirli ayrıntıları satır) 37 ° C'de 15 dakika
  3. Sonra kuluçka, medyayı çıkarın ve hücreleri üç kez PBS ile yıkayın.
  4. -20 ° C'de 5 min için soğuk metanol ile hücreleri tamir ve üç kez PBS 1 mL ile yıkayın.
  5. 1 mL 0.1 hücrelerle permeabilize % Triton-X 10 dakika oda sıcaklığında ve yıkama için üç kez ile 1 mL PBS.
  6. Alexa Fluor 647 (1 mL) ile 1:50 Birleşik LAMP1 antikor ile 90 dk için hücreleri kuluçkaya PBS, seyreltme, oda sıcaklığında. Daha sonra 3 kez PBS içeren hücreleri yıkayın.
  7. DAPI hisse senedi çözüm (1 mg/mL) 1 mg/mL PBS sulandırmak. Daha sonra her odasına seyreltilmiş çözeltinin 1 mL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Hücreleri 3 kez PBS ile yıkayın.
  8. Mount coverslips kullanarak montaj orta bir slayttaki.
  9. 405 uyarma dalga boyu canlı hücre confocal mikroskop kullanarak hücreleri görüntü nm, 488 nm ve 633 nm. Algılama parametreleri takip ayarla: % 0.2 ve en fazla % 1 Pinole 1 havadar birim, lazer güç kazanmak ana 650-750, dijital ofset 0.
  10. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı, görüntü aç. Altında görüntülenen resim, grafik ve görüntü ölçek çubuğu eklemek için, Ekle ölçek çubuğu, seçin.

4. ilaç yayın Araştırmaları

  1. PBS uyuşturucu yayın çalışmaları yürütmek. Üç PBS arabellekleri 7.4, 6,8 ve 5.0 için pH değerlerini sırasıyla ayarlamak.
  2. KYF-Pt-NE 5 μL uygun pH PBS arabelleği 180 μL içinde seyreltik, 3,5 kDa MWCO mini diyaliz kupasına aktarmak ve PBS 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. Her üç mini diyaliz tüpler 2, 4, 6, 24, 48 ve 140 h arabellek kaldırmak ve AAS tarafından platin konsantrasyonları ölçün. Tüm örnekleri adım 2.2.8 göre hazırlayın ama 500 µL örneğe son seviyesini ayarlamak.

5. hücre kültür yöntemleri

  1. Kültür hücre hatları A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21 G, ES-2 hücre kültür (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) % 10 veya % 15 (TOV - 21 G, OV-90) fetal sığır serum (FBS), ile desteklenmiş orta (DMEM)'l-Glutamine ve penisilin/streptomisin ile. Büyümek tüm hücreleri % 5 CO2, su doymuş atmosfer 37 ° C'de
  2. Tohum 3 x 105 hücrelerde her 96-şey plaka ve öncesi kültür gecede tüp bebek kuluçka deneyler için. Su KYF-Pt-NE, sisplatin ve carboplatin çözümlerinde hazırlayın. Carboplatin ve sisplatin her hücre satırı için konsantrasyon eşleştirmek için KYF-Pt-NE Pt(II) konsantrasyonu ayarlayın. 37 ° C'de 72 saat için kuluçkaya
  3. Kuluçka sonra Renkölçer tahlil (ÇMT hücre çoğalması tahlil) kullanarak hücresel canlılığı değerlendirin. Kısaca, orta kaldırın ve MTT her ortamda iyi ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya % 10 110 μL ekleyin O zaman her şey için 100 μL deterjan ekleyin ve 37 ° C'de 5 h için kuluçkaya
  4. 570 Absorbans kontrol plaka okuyucu kullanarak nm. Z-test ve P-testi ile istatistiksel analiz kullanarak sonuçları analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

KYF-Pt-NE bu iletişim kuralını kullanan hazırlanan temsilcisi TEM görüntüsü şekil 2Agösterilir. KYF-Pt-NEs de dağınık, Morfoloji, küresel ve üniforma içinde büyüklük. KYF-Pt-doğrudan doğruya--dan 200 ölçümleri yapılır, en az üç TEM görüntülerle ölçülen NEs, göbek çapı 107 ± 27 nm olduğunu. KYF-Pt-NE, dinamik ışık spektroskopisi (DL), kullanılarak analiz hidrodinamik çapını 240 bulundu nm ile 0.156 bir polydispersity dizin. KYF-Pt-NE su Zeta potansiyel-60.1 ortalama değerini içeren üç bağımsız immobilizasyonu için kararlıydı mV. Potansiyeli yüksek büyüklüğü formülasyon iyi kolloidal kararlılık gösterir ve negatif yüzey yük iyonize COO- yüzey gruplarına oleik asit atfedilir. 8.59 KYF isoelectric noktası olduğunu ve bu nedenle bu olumlu nötr pH ücret uygulanır.

Nanoemulsions hücresel membran çapraz yeteneği fluorescently etiketli FITC-KYF-Pt-NE ve yumurtalık kanseri hücre hatları kullanarak incelenmiştir. Sonuçlar şekil 2Biçinde sunulur. Açıkça FITC-KYF-Pt-NEs (yeşil) içinde sitozol dağıtılır ancak henüz organellerin (kırmızı) ile ilişkili değildi görülebilir. Bu sonuç gösteriyor ki KYF-Pt-NEs hücreleri girin ve hücre içi uyuşturucu dağıtım aracı olarak hizmet verebilir.

KYF-Pt-NEs ve FITC-KYF-Pt-NEs istikrarı DLS ile değerlendirildi. Birkaç ay içinde su nanoemulsions çapı ölçüldü ve sonuçları şekil 3' te sunulmaktadır. Her iki formülasyonları hidrodinamik çapını yavaş yavaş artan depolama, 320 için 4 ay boyunca nm (KYF-Pt-NE) ve 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE) ama Nano Boyutlar korunmuş. Bu sonuç KYF tripeptit uzun süreler etkili bir şekilde nanoemulsions stabilize öneriyor.

Pt(II) sarma verimliliği ve serbest bırakmak--dan nanoemulsion AAS ile ölçüldü. KYF-Pt-NE Pt(II) konsantrasyon 10 wt.% olmak için kurulmuştur. Pt(II) yayın KYF-Pt-NE pH 7,4 (fizyolojik), 6,8 (tümör interstitium)49ve 5.0 (endosomal)50 şekil 4Asundu. Pt(II) pH 7.4 sadece %20,8 ile pH 6.8 ve 5.0 serbest %32.8 ve % 47.5, sırasıyla iken 4 h sonra serbest Pt(II), en yavaş sürümüdür. Aynı eğilim 24 saat sonra ve 6 gün sonra devam etti. Bu sonuç pH bağımlı KYF-Pt-NE Pt(II) sürümüdür ve sistemik dolaşımda gecikmeli ve olması nanoemulsions tümör translocate bir kez hızlandırılmış gösterir.

KYF-Pt-NE biyolojik aktivitesi aynı yumurtalık kanseri hücre hatları görüntüleme çalışmaları olduğu gibi kullanarak tüp kurulmuştur. Hücreleri IC50 her hücre satırı için karşılık gelen KYF-Pt-NE konsantrasyonlarda 72 h için KYF-Pt-NE ile inkübe. Canlılığı MTT tahlil kullanarak değerlendirildi ve sonuçları yalnızca hücreleri, KYF NE, oleik acids-Pt(II) eşlenik, carboplatin ve sisplatin için karşılaştırıldı. KYF-Pt-NE biyolojik aktivitesi sonuçları şekil 4B' gösterilir. KYF-Pt-NE canlılık isogenic hücre hatları A2780 (Pt duyarlı) ve CP70 (Pt dayanıklı) % 44.3 ve %46.2 sırasıyla azalttı. Carboplatin, klinik analog, %18,5 (A2780) ve %9,6 (CP70) sadece canlılığı azalmıştır. Hücre ölümü üzerinde büyük KYF-Pt-NE etkisi aynı eğilim diğer hücre hatları üzerinden de gözlendi. Carboplatin canlılığı sadece 16.5 oranında düşürülmesi sonuçlandı iken Pt(II) hassas TOV - 21 G hücre canlılığı ile KYF-Pt-NE, kuluçka sonra 55.9 oranında azaldı. Ara Pt(II) dirençle OV-90 hücrelerde canlılığı %55.3 (KYF-Pt-NE) ve %23,9 (carboplatin) tarafından indirdi. İki dayanıklı kanser hücre hatları, ES-2 ve SKOV-3, canlılığı içinde 45.9 ve % 54,3 tarafından sırasıyla, KYF-Pt-NE ve %10,3 (ES-2) ve %16,8 (SKOV-3) carboplatin için gösterdi.

KYF-Pt-NE biyolojik aktivitesi sisplatin karşı da karşılaştırıldı. Sisplatin Pt II tabanlı artık onun toksisite profil51nedeniyle klinikte tercih edilir ilk nesil ajandır. İki hücre hatları, SKOV-3 ve TOV - 21G, canlılığı azaltma sırasıyla, KYF-Pt-NE için sisplatin için % 15 ve % 40, daha büyük. Kalan hücre hatlarında KYF-Pt-NE etkinlik sisplatin (A2780, CP70, OV-90) karşılaştırılabilir veya biraz (ES-2) azaltın. Oleik acids-Pt(II) eşlenik de biyolojik olarak aktif olduğu anlaşıldı. Ancak, KYF-Pt-NE daha yüksek azaltma canlılığı eşlenik olmasını daha nanoformulation önemini Pt(II) faaliyet gösteren çoğunluğu test, hücre satırlarını içinde gösterdi.

Nanoparticulate sistemlerinin biyolojik uygulamalar biyolojik ilgili medya istikrarı gerektirir, böylece KYF-Pt-NE kararlılığını % 20 fetal sığır serum içinde (FBS) değerlendirildi ve sonuçları şekil 4 csunulmaktadır. KYF-Pt-NE opsonizasyonla izine rastlanmadı kuluçka bir gün sonra serum içinde tespit ettik.

Figure 1
Şekil 1. Nanoemulsions (üst) ve şematik nanoemulsion hazırlık (alt) bileşenlerinin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. KYF-Pt-NE (A) ve confocal mikroskop görüntüleri FITC-KYF-Pt-NE (yeşil) Alım yumurtalık kanseri hücreleri tarafından TEM görüntüsü (çekirdek mavi ve organellerin kırmızı) (B). Ölçek barlar 10 mikron vardır. Bu rakam ile izin Bioconjugate kimya 2018, 29, 2514-2519 benimsemiştir. 46 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. KYF-Pt-NE ve FITC-KYF-Pt-NE su kararlılığını. Ortalama ve standart sapma p ve N = 3 her noktasını gösteren <0,005. Bu rakam ile izin Bioconjugate kimya 2018, 29, 2514-2519 benimsemiştir. 46 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4. KYF-Pt-NE istikrar ve biyolojik aktivitesi. (A)Pt(II) PBS arabelleği farklı pHs (PBS, 37 ° C), KYF-Pt-NE yayın. Hücresel canlılığı farklı yumurtalık kanseri hücre hatları 72 h kuluçka KYF-Pt-NE (B) ile sonra. Ortalama ve standart sapma / N = 3 her sütun temsil eder ve p <0,005. Konsantrasyonları her hücre satır sabittir ve aşağıda listelenmişlerdir: 4,92 mM (A2780), 8,80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9.84 mM (SKOV3), 7.38 mM (ES-2), 19.7 mM (OV-90). KYF-Pt-NE ve oleik acids–Pt(II) eşlenik konsantrasyonu AAS tarafından ölçülen Pt(II) içeriği ile ilgili olarak ayarlandı. Kısaltmalar: "Carbpt" – carboplatin; "KYF-NE" – KYF tripeptit kaplı nanoemulsion; "KYF-Pt-NE" – Pt(II) içeren KYF tripeptit kaplı nanoemulsion; Cispt – sisplatin; PT-oleik – oleik acids–Pt(II) eşlenik. (C) KYF-Pt-NE istikrar Serumda. Bu rakam ile izin Bioconjugate kimya 2018, 29, 2514-2519 benimsemiştir. 46 telif hakkı 2018 Amerikan Kimya Derneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nanoemulsion sentez kritik adımlar içerir yüzeylerde molar oranını ayarlama, oleik acids–Pt(II) eklenmesi sırasında sıcaklık ve akış hızı denetimi sürdürmek için yeterli süre kendinden montajlı sağlayan ve ürün kullanarak arındırıcı bir santrifüj yoğunlaştırıcı sütun. Bu parametreler KYF-Pt-NE morfolojisi ve boyutu etkiler; Böylece, uygun molar oranını korumak ve sentetik koşullar doğru ayarlamak özellikle önemlidir.

Nanoemulsion sentezi (Adım 3) sırasında yüzeylerde oranını kendinden montajlı için süreç çok önemlidir ve ürün son boyutunu belirler. KYF oleik acid-Pt(II) molar oranı 1:3 ve KYF tripepide su en iyi konsantrasyon 0.2 mM. Buna ek olarak, oleik acid-Pt(II) eşlenik adım 3.1 dağıtılması için kullanılan organik çözücü su filtrasyon sistemi ile uyumlu ile karışan ve Evaporatif kolayca oda sıcaklığında olmalı.

Bir kritik adım KYF çözüm (Adım 3.4) oleik acid-Pt(II) eşlenik dropwise eklenmesidir. Alt-optimal bir hız nanoemulsion yağış teşvik edebilirsiniz çünkü 0.1 mL/dk daha ve değil 0.2 mL/dk, daha hızlı akış yavaş olmamalıdır. Ayrıca, oleik acids–Pt(II) eşlenik 37 ° C'de KYF çözüm 600 rpm'de heyecan tabakta karışımı karıştırma sırasında eklenmelidir. Bir kez tüm oleik acid-Pt(II) eklendi, oda sıcaklığında ve 150 rpm azaltılmış karıştırma hızı çözüm tutulmalıdır. Adım 3.5 oda sıcaklığında yapılmalıdır. İçin en uygun zaman kendinden montajlı KYF-Pt-ND'nin (Adım 3.5) 24 saat açıktır.

Nanoemulsion önceden konsantre olması ise bu ürünü çökelti riski vardır. Bu nedenle, bu nanoemulsion bir santrifüj yoğunlaştırıcı centrifuged önce ek su ile seyreltilmiş ve 2,465 x gdaha hızlı döndü tavsiye edilir. Seyreltilmiş nanoemulsions aliquots spin arasında santrifüj yoğunlaştırıcısına eklenmesi gerektiğini ve bir sonraki bölümü eklenmeden önce filtrede nanoemulsion karışık.

Form nanoemulsions yağ asitleri oleik asit dışında türevleri ile yeteneğini test etmemiştir ve henüz tespit olmaktır. Gelecekteki uygulamalar oleik asit ile ortak derleme kolaylaştırmak için farklı peptidler kullanımı içerebilir. Ayrıca, oleik asit conjugates Platin tabanlı olmayan ilaçlarla nanoemulsions potansiyel çekirdek kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa etmek çatışması var mı.

Acknowledgments

Ulusal Kanser Enstitüsü mali desteği minnetle anıyoruz SC2CA206194 verin. Hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirilir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Biyomühendislik sayı: 144 Nanoemulsion oleik asit tripeptit antikanser terapisi biyolojik görüntüleme ilaç dağıtım
Tripeptit stabilize Nanoemulsion oleik asit
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter