Summary
Her, vi leverer en detaljeret protokol for en oral administration model ved hjælp af barciak larver og hvordan til at karakterisere induceret medfødte immunrespons. Bruger denne protokol, vil forskere uden praktisk erfaring være i stand til at bruge G. mellonella tvangsfodring metode.
Abstract
Undersøgelse af commensal bakterier på immunsystemet vært immunogen potentiale er et vigtigt element når man studerer intestinal vært-mikrobe interaktioner. Det er veletableret, at forskellige latente udviser en anderledes potentiale til at stimulere vært intestinal immunsystemet. Disse undersøgelser omfatter hvirveldyr, især gnavere. Eftersom stigende etiske bekymringer er forbundet med eksperimenter, der involverer hvirveldyr, er der en høj efterspørgsel efter hvirvelløse udskiftninger modeller.
Her give vi et barciak oral administration model ved hjælp af commensal ikke-sygdomsfremkaldende bakterier og de mulige vurdering af latente immunogen potentiale på immunsystemet G. mellonella . Vi demonstrere, at G. mellonella er et nyttigt alternativ hvirvelløse udskiftning model, der giver mulighed for analyse af latente med forskellige immunogen potentiale som Bacteroides vulgatus og Escherichia coli. Interessant, udstillet bakterier ingen dræbende virkning på larverne, der ligner pattedyr. Immunrespons af G. mellonella var sammenlignelige med hvirveldyr medfødte immunrespons og inddrage anerkendelse af bakterier og produktion af antimikrobielle molekyler. Vi foreslår, at G. mellonella var i stand til at gendanne tidligere mikrobiota balance, som er kendt fra sunde pattedyr individer. Selv om at levere sammenlignelige medfødte immunrespons i både G. mellonella og hvirveldyr, havnen G. mellonella ikke en adaptive immunsystem. Da de undersøgte komponenter af den medfødte immunsystem er evolutionær bevaret, modellen giver mulighed for en prescreening og første analyse af bakterielle immunogen egenskaber.
Introduction
Den intestinale microbiome er et væsentligt element for opretholdelsen af homøostase, og involverer både medfødte og adaptive immunrespons1,2. Commensal mikrobiota samfund er karakteriseret ved forskellige commensal hovedbestanddele: symbionter, der giver gavnlige virkninger af vigtigt, immunmodulerende funktioner og pathobionts, som kan have skadelige virkninger genetisk disponerede vært og fremme og udløse tarmbetændelse3,4. Mange undersøgelser på symbionter og pathobionts og deres indflydelse på immunsystemet vært er blevet offentliggjort primært studerer adaptive immunrespons.
Da disse undersøgelser omfatter mange dyr til undersøgelserne og beskyttelse og udskiftning af dyr, der anvendes til forsøg er at øge offentlighedens interesse, søger vi at finde en erstatning model til at tillade en screening af forskellige bakterielle immunogen egenskaber. Insekter, især barciak, er en meget anvendt erstatning model i infektion forskning. G. mellonella kombinerer forskellige fordele såsom lave omkostninger og høj produktivitet; Det giver mulighed for oral administration af bakterier, som er den naturlige eksponeringsvej, og det giver mulighed for systemisk infektion5,6. G. mellonella yderligere muliggør inkubation ved 37 ° C, som er den fysiologiske kropstemperatur af pattedyr og optimalt for bakteriel virulens faktor udtryk5. Den største fordel ved G. mellonella er den bevarede medfødte immunsystem, der giver mulighed for forskelsbehandling af selv fra ikke-selv og koder en bred vifte af mønster anerkendelse receptorer som apolipophorin eller opsonin hemolin6, 7. på mikrobe anerkendelse, G. mellonella kan udløse forskellige downstream humorale immunrespons. Det kan fremkalde oxidativt stress svar og udskiller reaktive ilt arter (ROS), som omfatter aktivitet af NOS (salpetersyre oxidase syntase) og NOX (NADPH oxidase)6,8. Derudover G. mellonella aktiveres en potent antimikrobielt peptid (AMP) svar, hvilket resulterer i udskillelsen af en blanding af forskellige forstærkere som gloverin, moricin, cecropin eller defensin-lignende gallerimycin6, 8,9,10. Generelt, forstærkere har ret brede værtsspecificitet mod Gram-positive og Gram-negative bakterier og svampe og er nødt til at give en potent svar da insekter mangler enhver adaptiv respons10. Gloverin er en AMP aktive mod bakterier og svampe og hæmmer ydre membran dannelse6,11. Moricins udstiller deres antimikrobielle funktion mod Gram-positive og Gram-negative bakterier af gennemtrængende membranen og danner en pore9,11. Cecropins give aktivitet mod bakterier og svampe og permeabilize membran på samme måde som moricins9,10. Gallerimycin er en defensin-lignende peptid med anti-svampe egenskaber9. Interessant, konstateredes det, at kombinationen af cecropin og gallerimycin havde en synergistisk aktivitet mod E. coli10.
På grund af deres let-at-bruge karakter G. mellonella er larver en ofte brugt infektion model til at vurdere bakteriel sygdomsfremkaldende evne. Især korrelerer undersøgelser i hvilke data fra G. mellonella med data fra mus støtte styrken af denne alternative host model. Det konstateredes, at de mest patogene serotyper af Listeria monocytogenes i en musemodel infektion også medføre højere dødelighed i G. mellonella efter systemisk infektion. Yderligere, mindre virulente serotyper viste sig for at være også mindre virulente i G. mellonella model12. Lignende observationer er gjort med de menneskelige patogene svampe Candida albicans. Virulens af forskellige C. albicans stammer, der er blevet vurderet af systemisk infektion og efterfølgende overvågning af larve overlevelse. Musen Avirulente stammer blev også Avirulente eller udstillede reduceret virulens i G. mellonella, mens musen virulente stammer fører også til høj larve dødelighed13. G. mellonella model kan yderligere bruges til at identificere type 3 sekretion system sygdomsfremkaldende faktorer af Pseudomonas aeruginosa14.
Da de fleste undersøgelser der involverer G. mellonella var fokuseret på virulens faktorer ved hjælp af metoden med systemisk infektion var vi især interesseret i at levere en metode egnet for analysen af intestinal latente i en mundtlig tvangsfodring model, vi kan anvende en særskilt dosering af bakterier pr. larver og ikke kun overholde larve dødeligheden men analysere forskellige stempler af medfødte immunrespons at opretholde intestinal homeostase.
Vores metode hjælper med at øge brugen af G. mellonella som en erstatning model, da vi kombinerer anvendelsen af bakterier og analyse af RNA udtryk. Det er ikke kun nyttig til at styrke betydningen af bakteriel patogenese undersøgelser, når herunder analyse af immunrespons efter oral administration og ikke kun observationer af dødelighed efter systemisk infektion. Vores metoder giver mulighed for analyse af immunogen egenskaber af bakteriel apatogene latente da det giver mere komplekse forhold end cellekultur ved at tilbyde en tarm barriere i en levende organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella opdræt og forberedelse af larverne til eksperimenter
Bemærk: Cyklus fra æg til sidste instar larve tager ca 5-6 uger.
- Overføre æg lagt af adult møl til 2 L kasser indeholdende voks møl substrat (22% majs gryn, 22% hvede mel, 17,5% bivoks, 11% skummetmælkspulver, 11% honning, 11% glycerol, 5,5% tørret gær). Udføre hele avl på 30 ° C i mørke.
- Overføre 25 g af substrat, der indeholder larverne i frisk substrat efter ca 1-2 uger hvor ringe og lille larver var synlige. Synkronisere larverne efter 2 uger efter deres størrelse og holde grupper af 30-40 larver i 2 L containere på voks møl substrat for yderligere 2 uger.
- Vælg larver for eksperimenter af vægt. Brug kun bleg og hurtig bevægende larver med en masse på 180-200 mg.
2. dyrkning og forberedelse af Bacteroides vulgatus og Escherichia coli til oral administration
- Vokse obligat anaerob bakterie Bacteroides vulgatus mpk ved 37 ° C anaerobt ved hjælp af krukker og breve for at skabe et anaerobe miljø (Se Tabel af materialer)15,16. Dyrke B. vulgatus i 2 dage og vokse en overnight subkultur i hjernen hjerte infusion (BHI) bouillon.
- Vokse fakultativ anaerob bakterien Escherichia coli mpk under aerobe betingelser i Luria-Bertani (LB) bouillon ved 37 ° C. Dyrke E. coli overnatning i LB bouillon og vokse subkultur i 2 timer ved 37 ° C om dagen af forsøget.
- Høste kulturerne ved centrifugering ved 1.700 x g i 5 min. Resuspend bakterielle træpiller i DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered saltvand). Bestemme det optisk densitet (OD) bakteriel kulturer på OD 600 nm og beregne de bakterielle koncentrationer. De bakterielle koncentrationer blev justeret til 109/mL.
3. tvangsfodring af G. mellonella larver med bakteriel udvisninger
- Force-feed hver larve med 10 µL af den justerede bakteriel suspension indeholdende 107 bakterier pr. dosis. Bruge en insulin sprøjte med en stump-ended nål til oral anvendelse af bakteriel suspension.
- Lave sprøjten i en mikrosprøjte pumpe (figur 1) for at sikre nøjagtigheden af den anvendte suspension volumen til hver larve (Se Tabel af materialer). Indsæt sprøjte omhyggeligt mellem deres hvaltænder. Tving ikke sprøjte mellem hvaltænder. Vent til larver at åbne det mouthparts og indsæt derefter sprøjten.
- Inkuber tvangsfodret larverne i mørke ved 37 ° C mellem 1-24 h. Brug DPBS-administreret larver som mock baggrund kontrol at udelukke potentielle stress reaktioner induceret på grund af håndtering af larverne i løbet af tvangsfodring.
4. behandling af oralt administreret larver og RNA isolering
- Arbejde under en hætte og bære sikkerhedsbriller. Ren hood og spray reagenset for at forhindre RNase forurening.
- Snap-freeze lever larverne efter inkubation i flydende nitrogen og homogeniseres dem. Brug en morter og pistil for homogenisering. Tilsæt flydende kvælstof til mørtel og gitter enkelte larver indtil pulveriseret homogeniseret er produceret.
- Hæld homogenatet til en engangs vejer båden og vente på de flydende kvælstof til at fordampe.
- Bland den flydende nitrogen-fri frosne pulveriseret homogeniseret med 1 mL af Trizol i et 2 mL rør og inkuberes blanding ved stuetemperatur i 1 time.
- Centrifugeres blandingen på 8.000 x g i 15 min. ved stuetemperatur og overføre supernatanten ind i en frisk rør og kassér pelleten. Bland supernatanten med 200 µL af 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP). Vortexes og inkuberes blandingen i 5 min ved stuetemperatur og i 10 min på is.
- Centrifugeres de BCP-tilføjet reaktioner på 18.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Overføre det øverste gennemsigtige lag ind i et nyt 2 mL rør og kassér resten. Bundfald RNA af det overførte øverste lag med 500 µL isopropanol ved blanding og vende røret i 5 min.
- Centrifugeres tube på 18.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Vask det udfældede RNA pellet med 500 µL af 75% ethanol.
- Tørre RNA pellet for 5-10 min. ved RT. Passe på ikke over tørre det som det vil være svært at opløse senere.
- Fortynd ribonuklease-inhibitor (1: 100) i nukleasen-gratis vand og bruge 100 µL af opløsningen til resuspenderes tørrede RNA. Vortex rør forsigtigt indtil pelleten er helt opløst.
- Foranstaltning RNA kvalitet og kvantitet. Sikre at 260/280-forholdet er omkring 2,0 og 260/230 forholdet i rækken af 2,0-2,2 (Se Tabel af materialer).
- Brug 5 µg af den isolerede RNA for DNase fordøjelsen. Mix 5 µL af 10 x buffer, 1 µL af ribonuklease hæmmer enzymet, 2 µL af DNase enzym, 5 µg af RNA, og fyld op med nukleasen-gratis vand op til 50 µL. Incubate for 30 min på RT.
- Tilføj 6 µL inaktivering reagens og inkuberes i 2 min på RT og vortex reaktion lejlighedsvis. Der centrifugeres reaktion på 10.000 x g i 1 min. overførsel supernatanten i frisk 1,5 mL tube.
Bemærk: RNA indeholder larver RNA samt den bakterielle RNA af de respektive stamme bruges til oral administration.
- Tilføj 6 µL inaktivering reagens og inkuberes i 2 min på RT og vortex reaktion lejlighedsvis. Der centrifugeres reaktion på 10.000 x g i 1 min. overførsel supernatanten i frisk 1,5 mL tube.
5. kvantificering af bakteriel 16S kopi numre efter tvangsfodring
Bemærk: Kopi numre af den udtrykte bakteriel 16S blev bestemt ved hjælp af cDNA syntese af RNA ekstraheret i afsnit 4. Endelige kvantificering beregnes ved hjælp af en standardkurve af plasmid som 16S PCR fragment af enten B. vulgatus eller E. coli er klonet.
- Forberedelse af plasmid standarder
- Forstærke 16S fragmenter fra E. coli mpk eller B. vulgatus mpk genomisk DNA ved PCR. Mix 10 µL af 5 x buffer, 1 µL af 10 mM dNTP løsning, 2,5 µL af 10 µM fremad primer og 2,5 µL af 10 µM omvendt primer fortynding, 1 µL af DMSO, 1 µL af genomisk DNA skabelon, 31,5 µL nukleasen-gratis vand og 0,5 µL af korrekturlæsning enzym.
- Køre PCR (indledende denaturering: 98 ° C til 30 s, denaturering: 98 ° C i 10 s, udglødning: 60 ° C i 30 ' erne, forlængelse: 72 ° C i 30 s, endelige udvidelse: 72 ° C i 5 min, Gentag denaturering, udglødning og udvidelse for 30 cykler).
- Bruge 16S E. coli primere (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) eller 16S B. vulgatus primere (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) for forstærkning.
- Bruge E. coli og B. vulgatus 16S PCR fragmenter for blunt-end kloning til en kloning vektor. Oprette ligatur og bland 10 µL af 2 x buffer, 1 µL af ikke-rensede PCR produkt, 1 µL af blunt-end kloning plasmid, 7 µL nukleasen-gratis vand og 1 µL af T4 DNA Ligase. Inkuber ligatur i 10 min på RT.
- Forberede E. coli DH5α kompetente celler.
- Podes 100 mL af LB medium i en Erlenmeyerkolbe med 1 mL af en overnight kultur. Vokse kultur, indtil OD 600 nm er mellem 0,4-0,6. Opdele den resulterende kultur i to 50 mL rør og inkuberes kulturer i isbad i 10 min.
- Centrifugeres kulturer på 1.700 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend hver pellet omhyggeligt med 5 mL af RFI løsning (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM frihedsbevægelse2, justere pH 5,8 med iskold syre, sterile filtreret). Fyld hver tube med yderligere 45 mL af RFI løsning.
- Centrifugeres kulturer på 1.700 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten og resuspend hver pellet omhyggeligt med 6 mL af RFII (10 mM MOPS, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% glycerol, autoklaveres) løsning. Pool begge fraktioner og inkuberes 12 mL suspension på isen til 15 min. Forbered celle suspension delprøver (200 µL). Gemme alikvoter ved-80 ° C.
- Overføre ligatur reaktion på en alikvot af kompetente E. coli DH5α celler og lad reaktionen på is i 15 min. Heat shock celler for 45 s på 42 ° C og tilsættes 1 mL af LB medium.
- Inkuber transformation i 45 min. ved 37 ° C. Tilsæt 100 µL af transformationen til en LB-agar plade der indeholder ampicillin og inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Udføre koloni PCR af 8 resulterende transformants fra LB agar plade af trin 5.1.5. Pick hver koloni med en tandstikker, dyppe den på en frisk LB tallerken med ampicillin (master plade) og så dyppe den samme tandstikker i en godt indeholdende 5,5 µL nukleasen-frit vand i en PCR stribe.
- Tilføje 7,5 µL af 2 x PCR mix, 0,5 µL af 10 µM fremad primer og 0,5 µL af 10 µM omvendt primer fortynding. Brug de samme primer par nævnt i afsnit 5.1.1.
- Køre PCR (indledende denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C i 1 min., udglødning: 60 ° C i 30 ' erne, forlængelse: 72 ° C i 1 min., endelige udvidelse: 72 ° C i 7 min, Gentag denaturering, udglødning og udvidelse til 35 cykler).
- Kontrollér størrelsen af 16S fragmenter på en 1%-agarosegel. Bruge 0,5 x Tris-Borat-EDTA (TBE) buffer til at opløse 1 g af Agarosen og kog det i en mikrobølgeovn. Tilføj 1: 50.000 farvestof for at gel og hæld det. Tilføje koloni PCR reaktioner og en 100 bp DNA stige til gelen, og Kør gelen i 45 min. ved 110 V.
- Podes en 5 mL LB overnight kultur indeholdende ampicillin med en klon fra master pladen (afsnit 5.1.6) for hver E. coli og B. vulgatus 16S plasmid, der indeholder de rigtige skærstørrelse.
- Der centrifugeres de bakterielle overnight kulturer i et 2 mL rør på 1.700 x g. Supernatanten og resuspenderes i 600 µL sterilt vand.
- Tilføje 100 µL lysisbuffer og bland ved at vende røret 6 gange. Tilføje 350 µL koldt (4° C) neutralisering løsning og bland grundigt ved at vende røret.
- Der centrifugeres ved maksimal hastighed i en centrifuge for 3 min. overføre supernatanten (~ 900 µL) til en spin kolonnen og centrifugeres ved maksimal hastighed i en centrifuge for 15 s.
- Kassér flowthrough og tilføje 200 µL af endotoxin fjernelse vask og centrifugeres ved maksimal hastighed i en centrifuge for 15 s.
- Tilføj 400 µL vaskeopløsning til kolonnen og centrifugeres ved maksimal hastighed i en centrifuge for 30 s. overførsel kolonnen til en ren 1,5 mL tube, tilføje 30 µL af eluering buffer til kolonnen Inkuber det i 1 min. ved stuetemperatur.
- Der centrifugeres ved maksimal hastighed i en centrifuge for 30 s (Se Tabel af materialer).
- Bestemme plasmid DNA koncentration ved at blande 1 µL plasmid DNA med 199 µL af brugsopløsning (1 µL af fluorescerende farvestof pr. 199 µL af buffer for hver reaktion). Forbered to standarder ved at blande 10 µL af standard 1 eller 10 µL af standard 2 med 190 µL. Vortex prøven og standard rør og inkuberes reaktion i 2 min. foranstaltning koncentrationen (Se Tabel af materialer).
- Forberede standard koncentrationer i 10-fold serielle fortyndinger i en række 10-100.000 eksemplarer: beregning massen af de enkelt plasmid (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = plasmid størrelse, m = massen). Beregn massen af plasmid DNA skulle indeholde de ønskede kopi numre af interesse (kopier række interesse x massen af enkelt plasmid = masse af plasmid DNA behov).
- Forberedelse af prøver til kvantificering
- Syntetisere cDNA. Bland 2 µL af 7 x buffer, 1 µL af DNase-fordøjet RNA fra afsnit 4 og 11 µL nukleasen-gratis vand. Der inkuberes i 2 min på 42 ° C.
- Placer reaktion straks på is. Mix 4 µL af 5 x RT Buffer, 1 µL af RT (Reverse transkriptase) primer mix, 1 µL af RT enzym og reaktionen fra trin 5.2.1. Inkuber i 15 min på 42 ° C. Inkuber i 3 min. ved 95° C til at inaktivere RT enzym.
- Kvantificere cDNA koncentrationer fluorometrically som beskrevet i trin 5.1.9.
- Syntetisere cDNA. Bland 2 µL af 7 x buffer, 1 µL af DNase-fordøjet RNA fra afsnit 4 og 11 µL nukleasen-gratis vand. Der inkuberes i 2 min på 42 ° C.
- Måling af bakteriel belastning
- Justere cDNA koncentrationer til 5 ng pr. 12 µL reaktion for kvantitativ PCR. Bland 2 x RT-PCR mix, 0,25 µL af 100 µM fremad primer, 0,25 µL af 100 µM omvendt primer (5.1.1) og 12 µL af justerede cDNA. Køre qPCR (indledende denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C til 10 s, udglødning: 60 ° C i 30 s, Gentag denaturering og udglødning til 35 cykler, smeltning: 95 ° C, køle ned til 4 ° C).
- Plot log10 koncentrationer af plasmid standardkurven (10-100.000 eksemplarer), dvs 1-5 (x-akse), mod de tilsvarende ct-værdier (y-aksen). Udføre lineær regression for at opnå regressionsligningen. Løse ligningen for x (koncentration). Bruge formlen til at beregne log10 kopi numre ved at indsætte ct-værdien i formlen. Beregn antilogaritmen for at hente kopi numre.
6. bestemmelse af medfødte immun markørgen bruger kvantitativ RT-PCR
- Kontrollere primere for gen-specificiteten af PCR og efterfølgende Agarosen gel elektroforese for at kontrollere den korrekte fragment størrelse. Udføre PCR som beskrevet i afsnit 5.1.5.
Ubiquitin 130 bp: levering TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, reverse CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (rengøring)
Nox-4 159 bp: levering TGGCACGGCATCAGTTATCA, omvendt ACAGCGACTGTCATGTGGAA8
Ændringsforslag 76 bp: levering ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, omvendt GCCATTTTACAATCGCCACAA8
Gst 156 bp: levering GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, omvendt TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8
ApoIII 265 bp: levering AGACTTGCACGCCATCAAGA, omvendt TGCATGCTGTTTGTCACTGC8
hemolin 267 bp: levering CTCCCTCACGGAGGACAAAC, omvendt GCCACGCACATGTATTCACC8
gallerimycin 161 bp: levering GAAGTCTACAGAATCACACGA, omvendt ATCGAAGACATTGACATCCA8
cecropin 158 bp: levering CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, omvendt GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8
gloverin 101 bp: levering GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, omvendt CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8
moricin 124 bp: levering GCTGTACTCGCTGCACTGAT, omvendt TGGCGATCATTGCCCTCTTT8) - Vurdere primer effektivitet for at være E = 2.
- Pulje 2 µL af 5-10 forskellige positive prøver (dvs. prøver, der udtrykker genet som primer parret skal undersøges).
- Forberede en 1:5 fortyndingsrække prøve pool: standard 1 (S1): ufortyndet pool; S2: 2 µL af S1 + 8 µL nukleasen-gratis vand; S3: 2 µL af S2 + 8 µL nukleasen-gratis vand; S4: 2 µL af S3 + 8 µL nukleasen-gratis vand.
- Anvende 1 µL af S1-S4 og en ikke-template control (nukleasen-gratis vand) til en 96-brønd qPCR plade. Tilsæt 5 µL af RT master mix, 0,1 µL af hver 100 µM frem og bak primer, 3,7 µL nukleasen-gratis vand og 0,1 µL af RT mix pr. brønd.
- Køre kvantitativ RT-PCR (reverse transkription: 50 ° C i 10 min, indledende denaturering: 95 ° C i 5 min, denaturering: 95 ° C til 10 s, udglødning: 60 ° C i 30 s, Gentag denaturering og udglødning til 40 cykler, smeltning: 95 ° C, køle ned til 4 ° C).
- Plot log10 relative enheder til S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0,008) (x-aksen) mod de tilsvarende ct-værdier (y-aksen). Udføre lineær regression og bestemme hældningen af standardkurven. Beregne effektivitet E: E = 10-(1/slope). 20
Bemærk: En skråning af-3.32 angiver ideelle reaktionsbetingelser og primer effektivitet af E = 2,00. Det betyder: mængden af PCR produkt fordobles i løbet af hver cyklus.
- Brug 100 ng af fordøjet RNA (100 ng/µL) som en skabelon for RT-PCR. Mix RT-PCR reagenser og køre RT-PCR som nævnt i afsnit 6.2. Måle alle bakterier - og DPBS-administreret prøver med både rengøring primer par og target primer par. Altid køre S1-S4 fortyndinger med husførelse primer par og S1-S4 med target primer par på den samme plade til bestemmelse af effektiviteten.
- Beregn forholdet (R) af RNA genekspression efter følgende formel ved hjælp af både husholdningen og target primer par eksperimentelt bestemte primer effektivitet. Normalisere bakterier stimuleret prøver at håne kontrol20.
R: forholdet
Emål: effektivitet af S1-4 målt med target primer par
Erengøring: effektivitet af S1-4 målt med husførelse primer par
Δctmål(kontrolprøve): Δct (CT DPBS-fed prøve)-(ct af bakterier-fed prøve) målt med target primer par
Δctrengøring(kontrolprøve): Δct (CT DPBS-fed prøve)-(ct af bakterier-fed prøve) målt med husførelse primer par
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. mellonella hemolymph infektion model i almindeligt anvendt til at analysere virulens faktorer i et stort udvalg af patogener. De fleste målinger omfatter analyse af larver dødelighed, som er en ganske let metode. Ikke desto mindre, denne metode ikke tillade konklusioner om immunrespons i almindelighed og sammenkæde resultaterne af G. mellonella immunrespons med hvirveldyr immun mekanismer. G. mellonella oral administration model bruges på den anden side kun sjældent til oral infektion eller kolonisering af larver fordi var vanskeligt for at opnå nøjagtige infektion dosering9. Yderligere, kun lidt er kendt om G. mellonella medfødte immunrespons mod ikke-patogene bakterier især mammale tarm latente.
I modsætning til patogener, latente udfordre immunrespons vært og udløser men værten immun ordning er købedygtig påstå immun homøostase. G. mellonella er i stand til at klare den indledende tvangsfodret bakteriemængde indtil endelig ingen bakterier var spores længere (figur 2)8. 16s gen kopi numre af B. vulgatus og E. coli faldet betydeligt inden for 24 timer.
Vi viste at kommensale-administreret G. mellonella larver fremkalde RNA genekspression af forskellige medfødt immunitet markørgener: LPS-anerkendelse molekyler - apolipophorin (ApoIII) og hemolin (fig. 3A, B) var vist skal udtrykkes generelt højere i E. coli-administreret larver i forhold til B. vulgatus-administreret larver8. Yderligere, markør genekspression af to former for antimikrobiel molekyler kan overvåges. Produktion af reaktive oxygen og nitrogen arter (ROS/RNS) kan bestemmes ved måling af Nos og Nox-4 Gen-ekspression, som påvistes at være stærkt upregulated ved E. coli tvangsfodring i forhold til B. vulgatus (figur 4A, B)8. Derudover kunne genekspression af antioxidative Gst observeres (fig. 4C). 8
Endvidere viste vi, at forskellige antimikrobielle peptid udtryk blev induceret stærkere efter E. coli administration end i svar til B. vulgatus tvangsfodring. Vi observerede opregulering af defensin-lignende gallerimycin peptid, LPS-interagere gloverin peptid, cecropin og moricin (figur 5A, B, C, D)8.
Figur 1 : Tvangsfodring opsætning ved hjælp af en mikrosprøjte pumpe. En stump-ended nål er justeret ind mikrosprøjte pumpen, som giver mulighed for præcis injektion af bakterier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Persistens af bakteriemængde i barciak larverne efter tvangsfodring. Kopiere numre af B. vulgatus- og E. coli-specifikke 16s rDNA gener blev bestemt ud fra 5 ng af cDNA på forskellige tidspunkter ved hjælp af RT-PCR. Datapunkter er vist med angivelse af medianen. Ændret fra reference 8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Differential mønster anerkendelse af bakterier af G. mellonella. Larverne var administreres med to forskellige intestinal latente, RNA blev isoleret efter 1-6 h, og mRNA udtryk af LP'ER anerkendelse molekyle apolipophorin (ApoIII) (A) og hemolin (B) blev fastsat. Datapunkter repræsenterer geometrisk middel med standard fejl af middelværdien (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). 8 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : ROS markør genekspression efter bakterielle udfordring. E. coli og B. vulgatus blev tvangsfodret og ROS forsvar markør genekspression blev analyseret over tid. NOS (A), Nox-4 (B) og Gst (C) mRNA udtryk blev målt i isolerede larve RNA. Datapunkter repræsenterer geometrisk middel med standard fejl af middelværdien (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Ændret fra reference 8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Kommensale-induceret defensin-lignende antimikrobielle peptid udtryk i G. mellonella larver og humane epitelceller. Larverne blev oralt administreret med B. vulgatus eller E. coli, immunrespons blev observeret over tid og RNA blev isoleret fra larve individer. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA udtryk blev fastsat. Datapunkter repræsenterer geometrisk middel med standard fejl af middelværdien (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Ændret fra reference 8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella model er en hyppigt anvendt model til at vurdere bakteriel virulens faktorer i en systemisk infektion tilgang21. Da mange patogener og bakterier Indtast vært via mundtlige kolonisering eller infektion rute, skal ny indsigt findes til at evaluere G. mellonella som en model for mundtlige kolonisering og infektion.
Muligheden for at bageste G. mellonella mellem 15-37 ° C er en stor fordel, da de fleste pattedyr modeller opretholde kroppens temperatur på 37 ° C5. G. mellonella larver kan købes fra forskellige leverandører, men oprettelsen af en egen ynglebestand giver mange fordele som fravær af antibiotika, der forstyrrer assays, bedre skøn når at starte eksperimenter da leverandørerne ikke giver altid undgås larver i en klar-til-brug fase og stress reaktioner som følge af transport eller temperaturændringer. På grund af temperatur tolerancen af G. mellonella er det temperaturområde, hvor avl kan udføres høj. Højere temperaturer føre til hurtigere udvikling af larverne og efter avls temperatur, vi kan estimere livscyklus fra æg til sidste instar larve. Når larver var valgt for eksperimenter, blev kun bleg og hurtige enkeltpersoner valgt til at undgå enhver stress og immun reaktioner til at blande sig med eksperimenterne.
For at fastslå den tvangsfodring model, skal det sikres, at den mundtlig ansøgning var vellykket. Det var derfor nyttigt at konfigurere flere forsøg som en stærk bromophenol dye blev føjet til den løsning, der er beregnet til tvangsfodring. Dette medvirker til at udelukke eventuelle tilskadekomne larver og marker til de larver, der har det blå farvestof kun inden for deres gut22.
Med denne model, fandt at G. mellonella larver er nyttige til at undersøge medfødte immunrespons kinetik af visse markørgener. Under oprettelsen af oral administration model og studiet af immunrespons kinetik fandt vi genekspression skal udtrykkes ikke lokalt i midgut. Første eksperimentelle forsøg til at udtrække midgut RNA efter oral administration af commensal bakterier har ikke givet afgørende resultater. Derfor blev immunrespons fastlagt "globalt" i hele individer. Disse resultater støtter hypotesen om global anerkendelse via intestinal receptorer, transmission af signalet og udløse extraintestinal genekspression. Generelt, G. mellonella er stand til at inducere ampere hovedsagelig i selve fedt, men yderligere i hemocytes og tarmsystemet9. Da der er ingen præcise oplysninger om væv-specifikke produktion af antimikrobielle molekyler i G. mellonella larver efter infektion, blev den hele larve RNA udvundet fra komplet enkeltpersoner og anvendes til boltpistoler RNA gen udtryk. En yderligere fordel af hele larve RNA udvinding er fuldstændig indeslutning af levende bakterier inde i tarmen og muligheden for at kvantificere den bakteriemængde. Dissektion af tarmen kan føre til tab af bakterier på grund af forberedelse.
Da de fleste G. mellonella forskning udføres på bakteriel virulens træk var vi især interesseret, hvis og hvordan larverne udløse immunrespons mod ikke-sygdomsfremkaldende bakterier, som er en del af de pattedyr mikrobiota. For nylig, viste vi, at både G. mellonella og pattedyr del lignende komponenter af den medfødte immunrespons, der er homologe og evolutionære bevares. Salpetersyre oxid syntase (Nos) og NADPH oxidase (Nox) gener deler en høj grad af lighed8. G. mellonella havne yderligere en defensin-lignende antimikrobielle peptid gallerimycin, som deler strukturelle ligheder med pattedyr β-defensin 28.
Efter oral administration modellen var det muligt at påvise differential bakteriel anerkendelse af enten anti-inflammatoriske symbiotisk B. vulgatus eller pro-inflammatoriske pathobiotic E. coli. Desuden var downstream oxidativt stress svar og antimikrobielle peptid produktion højere induceret efter E. coli administration i forhold til B. vulgatus administration8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af DFG (SPP1656), uddannelse i DFG forskningsgruppen 1708, yder støtten Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) og den tyske Center for infektion forskning (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S.
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
