Summary
Hier bieden wij een gedetailleerd protocol voor een model van de orale toediening met behulp van de larven van de wasmot en hoe te karakteriseren geïnduceerde aangeboren immuunresponsen. Met behulp van dit protocol, zal onderzoekers zonder praktische ervaring kunnen gebruiken de G. mellonella dwangvoeding methode.
Abstract
Het onderzoek van het immunogene potentieel van commensale bacteriën op het immuunsysteem van de gastheer is een essentieel onderdeel bij de studie van intestinale host-microbe interacties. Het is reeds lang gevestigd dat verschillende commensals een verschillende potentieel vertonen ter stimulering van de intestinale immuunsysteem van de gastheer. Dergelijke onderzoeken betrekking hebben op gewervelde dieren, vooral knaagdieren. Aangezien steeds meer ethische bezwaren zijn gekoppeld aan experimenten met gewervelde dieren, is er een grote vraag naar ongewervelde vervangingen modellen.
Wij bieden hier een wasmot orale toediening model met behulp van commensale niet-pathogene bacteriën en de mogelijke evaluatie van de immunogene potentieel van commensals op het immuunsysteem G. mellonella . We laten zien dat G. mellonella is een nuttig alternatief-ongewervelde vervanging model waarmee de analyse van commensals met verschillende immunogene potentieel zoals Bacteroides vulgatus en Escherichia coli. Interessant, tentoongesteld de bacteriën geen effect van de moord op de larven, die lijkt op zoogdieren. De immuunrespons van G. mellonella waren vergelijkbaar met gewervelde aangeboren immuunresponsen en erkenning van de bacteriën en de productie van antimicrobiële moleculen te betrekken. Wij stellen voor dat G. mellonella kon vorige microbiota evenwicht, dat bekend van gezonde zoogdieren individuen is te herstellen. Hoewel het verstrekken van vergelijkbare aangeboren immuunresponsen bij zowel G. mellonella en gewervelde dieren, doet G. mellonella niet haven een adaptieve immuunsysteem. Aangezien de onderzochte componenten van het aangeboren immuunsysteem evolutionaire bewaard zijn, het model laat toe een prescreening en eerste analyse van bacteriële immunogene eigenschappen.
Introduction
De intestinale microbiome is een essentieel onderdeel voor onderhoud van homeostase, en omvat zowel aangeboren en adaptieve immuunresponsen1,2. De commensale microbiota Gemeenschap wordt gekenmerkt door verschillende commensale hoofdbestanddelen: symbionten die gunstige effecten door belangrijke immunomodulerende functies en pathobionts die nadelige gevolgen kunnen hebben, genetisch vatbaar verlenen gastheren en bevorderen en leiden tot darmontstekingen3,4. Veel studies over symbionten en pathobionts en hun invloed op het immuunsysteem van de gastheer verschenen hoofdzakelijk het bestuderen van adaptieve immuunrespons.
Aangezien deze studies veel dieren voor het onderzoek en de bescherming omvatten en vervanging van dieren die voor experimenten is van toenemende publieke belangstelling, willen wij een vervanging model te staan voor een screening van verschillende bacteriële immunogene vinden Eigenschappen. Insecten, vooral wasmot, zijn een gebruikte vervanging model in het onderzoek van de infectie. G. mellonella combineert verschillende voordelen zoals lage kosten en hoge doorvoer; Hierdoor orale toediening van bacteriën, die de natuurlijke blootstellingsroute is, en het zorgt voor systemische infectie5,6. G. mellonella verder kunt incubatie bij 37 ° C, oftewel de fysiologische lichaamstemperatuur van zoogdieren en de optimale voor bacteriële virulentie factor expressie5. Het belangrijkste voordeel van G. mellonella is het geconserveerde ingeboren immune systeem waarmee de discriminatie van het zelf van niet-zelf en codeert een verscheidenheid van patroon erkenning receptoren zoals apolipophorin of de opsonin hemolin6, 7. bij microbe opname, G. mellonella kan leiden tot verschillende downstream humorale immuunreacties. Het kan induceren oxidatieve stress reacties en afscheiden van reactieve zuurstof soorten (ROS), waarbij de activiteit van de NOS (nitraat oxidase synthase) en NOX (NADPH oxidase)6,8. Bovendien, G. mellonella activeert een potente antimicrobiële peptide (AMP) antwoord, wat in de afscheiding van een mengsel van verschillende versterkers zoals gloverin, moricin, cecropin of de defensin-achtige gallerimycin6, resulteert 8109,,. In het algemeen, versterkers hebben nogal breed gastheerspecificiteit tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën en schimmels en hebben een krachtig antwoord geven aangezien insecten een adaptieve reactie10 ontbreken. Gloverin is een versterker actief tegen bacteriën en schimmels en remt de buitenmembraan vorming6,11. Moricins exposeren hun antimicrobiële functie tegen gram-positieve en gram-negatieve bacteriën door het membraan te penetreren en de vorming van een porie9,11. Cecropins bieden activiteit tegen bacteriën en schimmels en het membraan ook zoals moricins9,10permeabilize. Gallerimycin is een defensin-achtige peptide met anti-schimmel eigenschappen9. Interessant, bleek dat de combinatie van cecropin en gallerimycin had een synergetische activiteit tegen E. coli10.
Dank zij hun easy-to-use-karakter G. mellonella zijn larven een model van de vaak gebruikte infectie te beoordelen van bacteriële pathogeniteit. In het bijzonder correleren onderzoeken in welke gegevens verkregen uit G. mellonella met gegevens die zijn verkregen uit muizen ondersteuning de sterkte van deze alternatieve hostmodel. Bleek dat de meest pathogene serotypes van Listeria monocytogenes in een muismodel infectie ook tot hogere sterftecijfers in G. mellonella na systemische infectie leiden. Verder, minder virulente serotypen bleek te zijn ook minder virulente in de G. mellonella model12. Vergelijkbare waarnemingen hebben geboekt met de menselijke pathogene schimmels Candida albicans. Virulentie van verschillende C. albicans stammen is beoordeeld door systemische infectie en de daaropvolgende monitoring van larval survival. Muis Avirulente stammen waren ook Avirulente of tentoongestelde verminderde virulentie in G. mellonella, overwegende dat de muis virulente stammen ook tot hoge larvale sterfte13 leiden. De G. mellonella model kan verder worden gebruikt type 3 secretie systeem pathogeniteit factoren van Pseudomonas aeruginosa14te identificeren.
Aangezien de meeste onderzoeken waarbij G. mellonella richtten op virulentiefactoren met behulp van de systemische infectie aanpak waren we vooral geïnteresseerd in het verstrekken van een methode die geschikt is voor de analyse van intestinale commensals in een mondelinge dwangvoeding model waarin we kunnen een duidelijke dosering van bacteriën per larven toepassing en niet alleen het observeren van het larvale sterftecijfer maar analyseren verschillende kenmerken van aangeboren immuunresponsen te handhaven van intestinale homeostase.
Onze methode helpt bij het verhogen van het gebruik van G. mellonella als een vervanging model aangezien we de toepassing van de bacteriën en de analyse van RNA expressie combineren. Het is niet alleen nuttig voor het versterken van de zin van bacteriële pathogenese studies wanneer met inbegrip van de analyse van immuunresponsen na orale toediening en niet alleen de observatie van sterftecijfers na systemische infectie. Onze werkwijze zorgt voor de analyse van immunogene eigenschappen van bacteriële niet-pathogene commensals omdat het biedt meer complexe voorwaarden dan de cultuur van de cel door het aanbieden van een intestinale barrière in een levend organisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella fokken en voorbereiding van de larven van de experimenten
Opmerking: De cyclus van ei tot de laatste instar larve duurt ongeveer 5-6 weken.
- Breng de eieren gelegd door volwassen vlinders en aan 2 L dozen met grisella substraat (22% maïs grutten, 22% tarwe maaltijd, 17,5% bijenwas, 11% magere-melkpoeder, 11% honing, 11% glycerol, 5,5% gedroogd gist). De gehele fokken bij 30 ° C in het donker uit te voeren.
- Overdracht van 25 g van substraat met de larven in vers basismateriaal na ongeveer 1-2 weken wanneer kleine en kleine larven zichtbaar waren. De larven synchroniseren na 2 weken volgens hun grootte en groepen van 30-40 larven in 2 L containers op grisella substraat voor extra 2 weken houden.
- Selecteer de larven voor experimenten door gewicht. Gebruik alleen bleek en snel bewegende larven met een massa van 180-200 mg.
2. teelt en voorbereiding van Bacteroides vulgatus en Escherichia coli voor orale toediening
- Groeien de obligate anaerobe bacterie Bacteroides vulgatus mpk bij 37 ° C anaëroob potten en zakjes gebruiken voor het maken van een anaëroob milieu (Zie Tabel van materialen)15,16. Cultiveren van B. vulgatus voor 2 dagen en een overnachting subcultuur in hersenen hart infusie (BHI) Bouillon groeien.
- Groeien de facultatief anaerobe bacterie Escherichia coli mpk onder aërobe omstandigheden in Luria Bertani (LB) Bouillon bij 37 ° C. Cultiveren van E. coli's nachts in de pond-Bouillon en groeien subcultuur gedurende 2 uur bij 37 ° C op de dag van het experiment.
- Oogst de culturen door centrifugeren bij 1700 x g gedurende 5 min. resuspendeer de bacterietelling pellets in DPBS (Dulbecco de Phosphate-Buffered zoute). Bepaal van de optische dichtheid (OD) van de bacteriële culturen bij OD 600 nm en bereken de bacteriële concentraties. De bacteriële concentraties werden aangepast aan 109/mL.
3. vetmesten van G. mellonella larven met bacteriële schorsingen
- Force-feed elke larve met 10 µL van de gecorrigeerde bacteriële suspensie met 107 bacteriën per dosis. Gebruik een insuline-injectiespuit met een naald van bot-eindigde voor orale toepassing van de bacteriële suspensie.
- Bevestigen van de spuit in een microsyringe pomp (Figuur 1) om de juistheid van het volume van de toegepaste schorsing aan elke larve (Zie Tabel van materialen). Plaats de injectiespuit goed tussen hun kaken. Forceer niet de spuit tussen de kaken. Wacht totdat de larven openen monddelen en steek en daarna de spuit.
- Incubeer de dwangvoeding larven in het donker bij 37 ° C tussen 1-24 h. gebruik DPBS bestuurde larven als mock achtergrond controles uit te sluiten van de mogelijke reacties van de stress geïnduceerde als gevolg van de behandeling van de larven tijdens dwangvoeding.
4. verwerking van oraal toegediende larven en RNA isolatie
- Werken onder een motorkap en veiligheidsbril dragen. Reinig de kap en spray reagens om te voorkomen dat RNase besmetting.
- Module-freeze de larven leven na incubatie in vloeibare stikstof en meng ze. Gebruik een mortier en een stamper voor homogenisering. Toevoegen van vloeibare stikstof aan de mortel en het raster larvale ieder totdat poedervorm homogenates worden geproduceerd.
- Giet het homogenaat aan een wegwerp gewicht van de boot en wachten op de vloeibare stikstof te verdampen.
- Meng de stikstofvrije bevroren poedervorm homogenates met 1 mL van Trizol in een tube 2 mL vloeistof en Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Centrifugeer het mengsel bij 8.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en breng de bovendrijvende substantie in een verse buis en negeren de pellet. Meng het supernatant met 200 µL van 1-Bromo-3-chloorpropaan (BCP). Vortex en Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gedurende 10 minuten op het ijs.
- Centrifugeer de BCP-toegevoegd reacties bij 18.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. De transparante bovenlaag overboeken naar een nieuwe 2 mL-buis en negeren de rest. Het RNA van de overgedragen bovenlaag met 500 µL isopropanol en neerslag door het mengen en het omkeren van de buis gedurende 5 minuten.
- Centrifugeer de buis bij 18.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Wassen van de neergeslagen RNA pellet met 500 µL van 75% ethanol.
- Droog de RNA-pellet voor 5-10 min op RT. Zorg niet over droog het als het moeilijk zijn zal om later te ontbinden.
- Ribonuclease remmer (1:100) in nuclease-gratis water verdunnen en resuspendeer de pellet RNA gedroogde met 100 µL van de oplossing. Vortex de buis zorgvuldig totdat de pellet volledig is opgelost.
- Maatregel RNA kwaliteit en kwantiteit. Ervoor zorgen dat de verhouding tussen de 260/280 ongeveer 2.0 en 260/230 verhouding in het bereik voor 2.0-2.2 (Zie Tabel van materialen).
- Gebruik de geïsoleerde RNA 5 µg voor DNase spijsvertering. Meng 5 µL van 10 x 1 µL van ribonuclease remmer enzym, buffer, 2 µL van DNase enzym, 5 µg van RNA, en vullen opwaarts met nuclease-gratis water maximaal 50 µL. Incubate gedurende 30 minuten op RT.
- Voeg 6 µL van inactivatie reagens en incubeer gedurende 2 min op RT en vortex reactie af en toe. Centrifugeer reactie bij 10.000 x g gedurende 1 min. overdracht supernatant in verse 1,5 mL-buis.
Opmerking: De RNA bevat de larvale RNA evenals de bacteriële RNA van de respectieve stam gebruikt voor orale toediening.
- Voeg 6 µL van inactivatie reagens en incubeer gedurende 2 min op RT en vortex reactie af en toe. Centrifugeer reactie bij 10.000 x g gedurende 1 min. overdracht supernatant in verse 1,5 mL-buis.
5. kwantificering van de bacteriële 16S kopie getallen na dwangvoeding
Opmerking: De nummers van de kopie van de geuite bacteriële 16S werd bepaald met behulp van cDNA gesynthetiseerd uit het RNA gehaald in sectie 4. Definitieve kwantificering wordt berekend met behulp van een standaard curve van plasmide waarin het 16S PCR fragment van B. vulgatus of E. coli werd gekloond.
- Opstelling van normen van de plasmide
- Amplify 16S fragmenten uit E. coli mpk of B. vulgatus mpk genomic DNA door PCR. Mix 10 µL van 5 x buffer, 1 µL van 10 mM dNTP oplossing, 2.5 µL van 10 µM voorwaartse primer en 2.5 µL van 10 µM omgekeerde primer verdunning, 1 µL van DMSO, 1 µL van genomic DNA sjabloon, 31.5 µL van nuclease-gratis water en 0,5 µL van bewijs lezing enzym.
- Uitvoeren van de PCR (eerste denaturatie: 98 ° C gedurende 30 s, denaturatie: 98 ° C gedurende 10 s, gloeien: 60 ° C gedurende 30s, extensie: 72 ° C gedurende 30 s, de laatste uitbreiding: 72 ° C gedurende 5 min, herhaal denaturatie, gloeien en uitbreiding voor 30 cycli).
- Gebruik 16S E. coli inleidingen (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) of 16S B. vulgatus inleidingen (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) voor versterking.
- Gebruik de E. coli en B. vulgatus 16S PCR fragmenten voor bot-end klonen in een klonen vector. Instellen van afbinding en meng 10 µL van 2 x 1 µL van het PCR-product niet-gezuiverd, buffer, 1 µL van bot-end klonen plasmide, 7 µL van nuclease-gratis water en 1 µL van T4 DNA Ligase. Incubeer afbinding voor 10 min op RT.
- Bereiden van E. coli DH5α bevoegde cellen.
- Inoculeer 100 mL voor LB medium in een erlenmeyer met 1 mL van een overnachting cultuur. Groeien de cultuur tot OD 600 nm tussen 0,4-0,6 is. De resulterende cultuur gesplitst in twee 50 mL tubes en de culturen op het ijs gedurende 10 minuten uit te broeden.
- Centrifugeer de culturen bij 1700 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet zorgvuldig met 5 mL RFI-oplossing (30 mM CH3COOK, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, breng pH 5,8 met glaciale zuur, steriele gefilterd). Vul elke buis met extra 45 mL van RFI oplossing.
- Centrifugeer de culturen bij 1700 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer elke pellet zorgvuldig met 6 mL RFII (MOPS van 10 mM, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, 15% glycerol, gesteriliseerde met autoclaaf) oplossing. Beide breuken te bundelen en de opschorting van de 12 mL op ijs voor 15 min. voorbereiden cel schorsing aliquots (200 µL) uit te broeden. Opslaan van de aliquots bij-80 ° C.
- Overdracht van de reactie van de afbinding op één aliquot van bevoegde E. coli DH5α cellen en laat de reactie op het ijs voor 15 min. warmte schok de cellen voor 45 s bij 42 ° C en voeg vervolgens 1 mL van LB medium.
- Incubeer transformatie gedurende 45 minuten bij 37 ° C. Voeg 100 µL van de transformatie aan een LB agarplaat met ampicilline en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
- Uitvoeren van 8 resulterende transformants PCR van de kolonie van de LB agarplaat van stap 5.1.5. Kies elke kolonie met een tandenstoker, dompel het op een verse LB bord met ampicilline (master plaat) en duik vervolgens de dezelfde tandenstoker in een goed met 5.5 µL van nuclease-gratis water in een PCR-streep.
- Voeg 7,5 µL van 2 x PCR-mix, 0,5 µL van 10 µM voorwaartse primer en 0,5 µL van 10 µM omgekeerde primer verdunning. Gebruik de zelfde primerparen genoemd in paragraaf 5.1.1.
- Uitvoeren van PCR (eerste denaturatie: 95 ° C gedurende 5 min, denaturatie: 95 ° C gedurende 1 min, gloeien: 60 ° C gedurende 30s, extensie: 72 ° C gedurende 1 minuut, de laatste uitbreiding: 72 ° C gedurende 7 min, herhaal denaturatie, gloeien en uitbreiding voor 35 cycli).
- Controleer of de grootte van het 16S fragmenten op een 1% agarose gel. Gebruik 0.5 x Tris-boraat-EDTA (FSME) buffer los 1 g agarose te koken in een magnetron. 1:50,000 kleurstof om gel en giet het toevoegen. De kolonie PCR reacties en een 100 bp DNA-ladder toevoegen aan de gel, en de gel voor 45 min draaien op 110 V.
- Inoculeer een 5 mL LB overnachting cultuur met ampicilline met een kloon van de master plaat (sectie 5.1.6) voor elke E. coli en B. vulgatus 16S plasmide die de grootte van de juiste invoegen bevat.
- De overnachting bacteriele kweken in een tube 2 mL bij 1700 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 600 µL steriel water.
- Voeg 100 µL lysis-buffermengsel en meng door het omkeren van de buis 6 keer. Voeg 350 µL van koud (4° C) neutralisatie oplossing en meng grondig door het omkeren van de buis.
- Centrifuge op maximale snelheid in een centrifuge voor 3 min. het supernatant (~ 900 µL) overbrengen in een kolom van de spin en centrifuge op maximale snelheid in een centrifuge voor 15 s.
- Negeren van de flowthrough en voeg 200 µL van endotoxinen verwijdering wassen en centrifuge op maximale snelheid in een centrifuge voor 15 s.
- Voeg 400 µL van wassen oplossing toe aan de kolom en centrifugeer bij maximale snelheid in een centrifuge voor 30 s. overdracht de kolom tot een schone 1,5 mL koker, Voeg 30 µL van elutie buffer naar de kolom het Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
- Centrifuge op maximale snelheid in een centrifuge voor 30 s (Zie Tabel van materialen).
- Bepaal de plasmide DNA concentratie door het mengen van 1 µL van plasmide DNA met 199 µL van de werkoplossing (1 µL van fluorescente kleurstof per 199 µL van buffer voor elke reactie). Twee normen bereid door het mengen van 10 µL van standaard 1 of 10 µL van standaard 2 met 190 µL. Vortex het monster en de standaard buizen en incubeer reactie voor 2 min. maatregel de concentratie (Zie Tabel van materialen).
- Standaard concentraties in 10-fold seriële verdunningen in een bereik van 10-100.000 exemplaren bereiden: berekening van de massa van de enkele plasmide (m = (n) x (1.096x10-21 g/bp), n = afmeting van de plasmide, m = massa). Bereken de massa van de plasmide DNA die nodig zijn om de gewenste kopie getallen van belang (aantal kopieën van belang x de massa van één plasmide = massa van de plasmide DNA nodig).
- Bereiding van de monsters voor kwantificering
- CDNA synthetiseren. Meng 2 µL van 7 x buffer, 1 µL van RNA van sectie 4 en 11 µL van water nuclease-vrije DNase-verteerd. Incubeer gedurende 2 min op 42 ° C.
- Plaats reactie onmiddellijk op ijs. Mix 4 µL van 5 x RT Buffer, 1 µL van RT (Reverse-Transcriptase) primer mix, 1 µL van RT enzym en de reactie van stap 5.2.1. Incubeer gedurende 15 min op 42 ° C. Incubeer gedurende 3 min bij 95° C tot de inactivering van RT enzym.
- CDNA concentraties fluorometrically zoals beschreven in stap 5.1.9 te kwantificeren.
- CDNA synthetiseren. Meng 2 µL van 7 x buffer, 1 µL van RNA van sectie 4 en 11 µL van water nuclease-vrije DNase-verteerd. Incubeer gedurende 2 min op 42 ° C.
- Meting van bacteriële verontreiniging
- Aanpassen van cDNA concentraties tot en met 5 ng per 12 µL reactie voor kwantitatieve PCR. Meng 2 x rechts-PCR-mix, 0,25 µL van 100 µM voorwaartse primer, 0,25 µL van 100 µM omgekeerde primer (5.1.1) en 12 µL van aangepaste cDNA. Uitvoeren van qPCR (eerste denaturatie: 95 ° C gedurende 5 min, denaturatie: 95 ° C gedurende 10 s, gloeien: 60 ° C gedurende 30 s, herhaal denaturatie en gloeien voor 35 cycli, smelten: 95 ° C, koel tot 4 ° C).
- Log10 concentraties van plasmide standaard curve (10-100.000 exemplaren), dat wil zeggen 1-5 (x-as), uitgezet tegen de bijbehorende ct-waarden (y-as). Lineaire regressie om te verkrijgen van de regressievergelijking uitvoeren De vergelijking voor x (concentratie) oplossen. Gebruik de formule voor het berekenen van de log-10 van de moleculen door de ct-waarde invoegen in de formule. Bereken de antilogaritme om te verkrijgen van de moleculen.
6. bepaling van het aangeboren immuun marker gene met behulp van kwantitatieve RT-PCR
- Controleer inleidingen voor gen-specificiteit van PCR en latere agarose gel elektroforese om te controleren of de juiste fragment grootte. Uitvoeren van PCR als beschreven in punt 5.1.5.
Ubiquitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC toekomen, reverse CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (huishouden)
Nox-4 159 bp: TGGCACGGCATCAGTTATCA, omgekeerde ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 toekomen
Nos 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, omgekeerde GCCATTTTACAATCGCCACAA8 toekomen
Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, omgekeerde TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 toekomen
ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, omgekeerde TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 toekomen
hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, omgekeerde GCCACGCACATGTATTCACC8 toekomen
gallerimycin 161 bp: GAAGTCTACAGAATCACACGA, omgekeerde ATCGAAGACATTGACATCCA8 toekomen
cecropin 158 bp: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, omgekeerde GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 toekomen
gloverin 101 bp: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, omgekeerde CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 toekomen
moricin 124 bp: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, omgekeerde TGGCGATCATTGCCCTCTTT8toekomen) - Primer efficiëntie te beoordelen E = 2.
- Zwembad 2 µL van 5-10 verschillende positieve monsters (dat wil zeggen, monsters die zijn die het gen uitdrukt waarvoor het paar primer moet worden onderzocht).
- Bereiden van een verdunningsreeks van 1:5 van de monster-pool: standaard 1 (S1): onverdund pool; S2: 2 µL van S1 + 8 µL nuclease-gratis water; S3: 2 µL van S2 + 8 µL nuclease-gratis water; S4: 2 µL van S3 + 8 µL nuclease-gratis water.
- Breng 1 µL van S1-S4 en de controle van een niet-sjabloon (nuclease-gratis water) een qPCR van 96-wells-plaat. Voeg 5 µL van RT master mix, 0.1 µL van elke 100 µM-primer voor forward en reverse, 3.7 µL van nuclease-gratis water en 0.1 µL van RT mix per putje.
- Uitvoeren van kwantitatieve RT-PCR (reverse transcriptie: 50 ° C gedurende 10 min, eerste denaturatie: 95 ° C gedurende 5 min, denaturatie: 95 ° C gedurende 10 s, gloeien: 60 ° C gedurende 30 s, herhaal denaturatie en gloeien voor 40 cycli, smelten: 95 ° C, koel tot 4 ° C).
- Perceel10 van relatieve eenheden voor de S1-S4 (1 0.2, 0.04, 0,008) log (x-as) tegen de bijbehorende ct-waarden (y-as). Lineaire regressie uitvoeren en de helling van de standaard curve te bepalen. Berekenen van de efficiëntie E: E = 10-(1/slope). 20
Opmerking: Een helling van-3.32 geeft ideale omstandigheden en primer efficiëntie van E = 2,00. Dit betekent: de hoeveelheid PCR product verdubbelt tijdens elke cyclus.
- Gebruik 100 ng van verteerd RNA (100 ng/µL) als een sjabloon voor RT-PCR. Mix RT-PCR Reagentia en stormloop RT-PCR, zoals vermeld in punt 6.2. Meet alle bacteriën en DPBS-bestuurde monsters met zowel huishouden primer pair en doel primerparen. Altijd draaien de S1-S4 verdunningen met het huishouden primer pair en S1-S4 met het doel primer paar op de dezelfde plaat voor bepaling van de efficiëntie.
- Verhouding (R) van RNA genexpressie volgens de volgende formule met behulp van de efficiëntie van experimenteel bepaalde primer van zowel het huishouden als het doel primer paar berekenen. Normaliseren van bacteriën gestimuleerd te bespotten besturingselementen20monsters.
R: verhouding
Edoel: efficiëntie van S1-4 gemeten met doel primer paar
Ehuishouden: efficiëntie van S1-4 gemeten met huishouden primer paar
Δctdoel(controlemonster): Δct van (ct van monster DPBS-fed)-(ct van bacteriën gevoed monster) gemeten met doel primer paar
Δcthuishouden(controlemonster): Δct van (ct van monster DPBS-fed)-(ct van bacteriën gevoed monster) gemeten met huishouden primer paar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De G. mellonella Hemolymfe infectie model in op grote schaal gebruikt voor het analyseren van de virulentiefactoren van een groot aantal ziekteverwekkers. De meeste metingen omvatten de analyse van larven sterfte, dat een vrij gemakkelijke methode is. Echter deze methode niet tot conclusies over immuunresponsen in het algemeen en de resultaten van G. mellonella immuunresponsen koppelen met gewervelde immuun mechanismen. Het model G. mellonella orale toediening wordt aan de andere kant slechts zelden gebruikt voor mondelinge infectie of kolonisatie van de larven als gevolg van de moeilijkheden om exacte infectie dosering9. Verder, is slechts weinig bekend over G. mellonella aangeboren immuunresponsen naar niet-pathogene bacteriën met name zoogdieren intestinale commensals.
In tegenstelling tot de pathogenen, commensals daag de immuunrespons van de gastheer en trigger maar het immuunsysteem van de gastheer vermag immuun homeostase te handhaven. G. mellonella vermag duidelijk van het initiële dwangvoeding bacteriële laden totdat ten slotte geen bacteriën meer waarneembaar waren (Figuur 2)8. De 16s gene kopie nummers van zowel B. vulgatus en E. coli aanzienlijk gedaald binnen de 24u.
We laten zien dat Commensalisme bestuurde G. mellonella larven induceren RNA genexpressie van verschillende aangeboren immuniteit markers: LPS-erkenning moleculen - apolipophorin (ApoIII) en hemolin (Figuur 3A, B) moet worden over het algemeen hoger uitgedrukt in E. coliwerden getoond-toegediend larven in vergelijking met B. vulgatus-larven8toegediend. Verder, marker genexpressie van twee soorten antimicrobiële moleculen kan worden gecontroleerd. De productie van reactieve zuurstof en stikstof soorten (ROS/RNS) kan worden geschat door het meten van Nos en Nox-4 genexpressie die werden gedemonstreerd worden sterk upregulated bij E. coli dwangvoeding t.o.v. B. vulgatus (Figuur 4A, B)8. Bovendien, de expressie van genen voor antioxidatieve Gst kon worden waargenomen (Figuur 4C). 8
Bovendien toonden we dat verschillende antimicrobiële peptide expressie na toediening van de E. coli dan in reactie op B. vulgatus dwangvoeding sterker werd opgewekt. We waargenomen opregulatie van defensin-achtige gallerimycin peptide, peptide van gloverin LPS-interactie, cecropin en moricin (Figuur 5A, B, C, D)8.
Figuur 1 : Dwangvoeding instellen met behulp van een pomp microsyringe. Een bot-ended naald wordt aangepast in microsyringe pomp waarmee nauwkeurige injectie van bacteriën. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Persistentie van bacteriële verontreiniging in de larven van de wasmot na dwangvoeding. Kopieer nummers van B. vulgatus- en E. coli-specifieke 16s rDNA genen werden bepaald door 5 ng van cDNA op verschillende tijdstippen met behulp van de RT-PCR. Gegevenspunten worden weergegeven met vermelding van de mediaan. Uit de verwijzing 8 gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Differentiële patroonherkenning van bacteriën door G. mellonella. De larven werden beheerd met twee verschillende intestinale commensals, RNA werd geïsoleerd na 1-6 h en mRNA uitdrukking van LPS erkenning molecuul apolipophorin (ApoIII) (A) en hemolin (B) werd bepaald. Gegevenspunten vertegenwoordigen meetkundige middelen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM) (p > 0,05; *, p < 0.05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). 8 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : ROS marker genexpressie na bacteriële uitdaging. E. coli en B. vulgatus waren dwangvoeding en ROS verdediging marker genexpressie werd geanalyseerd na verloop van tijd. NOS (A), Nox-4 (B) en Gst (C) mRNA uitdrukking werd gemeten in geïsoleerde larvale RNA. Gegevenspunten vertegenwoordigen meetkundige middelen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM) (p > 0,05; *, p < 0.05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Uit de verwijzing 8 gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Defensin-achtige antimicrobiële peptide Commensalisme-geïnduceerde expressie in G. mellonella larven en menselijke epitheliale cellen. Larven werden oraal toegediend met B. vulgatus of E. coli, immuunresponsen werden waargenomen na verloop van tijd en RNA werd geïsoleerd uit de larvale individuen. gallerimycin (A), cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA uitdrukking werd bepaald. Gegevenspunten vertegenwoordigen meetkundige middelen met de standaardfout van het gemiddelde (SEM) (p > 0,05; *, p < 0.05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001). Uit de verwijzing 8 gewijzigd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het model van G. mellonella is een vaak gebruikte model te beoordelen van bacteriële virulentiefactoren in een systemische infectie aanpak21. Aangezien veel ziekteverwekkers en bacteriën voer de host via de orale toediening van kolonisatie of infectie, moeten nieuwe inzichten worden gevonden om te evalueren van G. mellonella als een model voor mondelinge kolonisatie en infectie.
De mogelijkheid tot achterzijde G. mellonella tussen 15-37 ° C is een groot voordeel omdat de meeste zoogdieren modellen behouden lichaam temperatuur van 37 ° C5. G. mellonella larven kunnen worden gekocht bij verschillende leveranciers, maar de oprichting van een eigen fok bevolking biedt vele voordelen zoals het ontbreken van antibiotica die interfereren met de tests, betere schatting toen experimenten om te starten Aangezien de leveranciers niet altijd larven in een kant-en-klare fase bieden en stress reacties worden vermeden als gevolg van vervoer of temperatuurveranderingen. Als gevolg van de temperatuur tolerantie van G. mellonella is het temperatuurbereik waartegen fokken kan worden uitgevoerd hoog. Hogere temperaturen leiden tot snellere ontwikkeling van het larven en afhankelijk van de temperatuur van de fok, kunnen we schatten de levenscyclus van ei tot de laatste instar larve. Wanneer de larven werden geselecteerd voor experimenten, werden alleen bleek en snel bewegende personen gekozen om te voorkomen dat de stress en de immuunreacties te bemoeien met de experimenten.
Teneinde het vetmesten model, moet worden verzekerd dat het mondelinge verzoek succesvol was. Dus, het was nuttig voor het instellen van verschillende proeven waarvoor een sterke bromophenol kleurstof is toegevoegd aan de oplossing die bestemd zijn voor het vetmesten. Dit helpt uit te sluiten van een gewonde larven en selecteren voor de larven die de blauwe kleurstof alleen binnen hun gut22hebben.
Met behulp van dit model, vonden we dat G. mellonella larven nuttig zijn voor het onderzoeken van de ingeboren immune reactie-kinetiek van bepaalde markers. Tijdens de oprichting van het model van de orale toediening en de studie van immune reactie-kinetiek vonden we genexpressie aan niet lokaal worden uitgedrukt in de middendarm. Eerste experimentele proeven om te pakken middendarm RNA na orale toediening van commensale bacteriën hebben geen overtuigende resultaten verstrekt. Daarom werden de immuunrespons "wereldwijd" vastbesloten in hele individuen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese van wereldwijde erkenning via intestinale receptoren, transmissie van het signaal en triggering extraintestinal genexpressie. G. mellonella is in het algemeen, kunnen voor het opwekken van versterkers voornamelijk in het lichaam vet, maar verder in de hemocytes en het intestinale systeem9. Want er geen exacte informatie beschikbaar over weefsel-specifieke productie van antimicrobiële moleculen in G. mellonella larven na infectie is, werd de hele larvale RNA gewonnen uit volledige individuen en gebruikt voor het analyseren van RNA gen expressie. Een ander voordeel van hele larvale RNA extractie is de volledige inperking van de levende bacteriën in de darm en de mogelijkheid om het kwantificeren van de bacteriële belasting. De dissectie van de darm kan leiden tot het verlies van bacteriën toe te schrijven aan de voorbereiding.
Aangezien de meeste G. mellonella onderzoek wordt uitgevoerd op bacteriële virulentie trekken waren we vooral geïnteresseerd als en hoe de larven trigger immuun reacties naar niet-pathogene bacteriën die deel van de zoogdieren microbiota uitmaken. Onlangs, toonden we dat zowel G. mellonella en zoogdieren delen vergelijkbare onderdelen van de aangeboren immuunrespons, die homologe zijn en evolutionaire geconserveerd. De vorm van nitraat oxid synthase (Nos) en NADPH oxidase (Nox) genen delen een hoge mate van gelijkenis8. G. mellonella havens verder de gallerimycin van een defensin-achtige antimicrobiële peptide die structurele gelijkenissen met zoogdieren β-defensin 2 deelt8.
Met behulp van de orale toediening model bleek het mogelijk om aan te tonen van differentiële bacteriële erkenning van anti-inflammatoire symbiotische B. vulgatus of pro-inflammatoire pathobiotic E. coli. Stroomafwaarts oxidatieve stress reacties en antimicrobiële peptide de productie waren bovendien hoger geïnduceerde na toediening van de E. coli in vergelijking met B. vulgatus administratie8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de DFG (SPP1656), het hulpprogramma voor het opleiding van de DFG-onderzoeksgroep 1708, het Bundesministerium für Bildung und Forschung (goedgekeurd) en het Duitse centrum voor onderzoek (DZIF) van de infecties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S.
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
