Summary
Burada, biz Galleria mellonella larva kullanarak bir sözlü yönetim modeli için detaylı bir protokol sağlar ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı nasıl karakterize indüklenen. Bu iletişim kuralını kullanan, pratik deneyimi olmayan araştırmacılar G. mellonella yöntemi kuvvet kullanmak mümkün olacak.
Abstract
Ana bağışıklık sistemi üzerinde Komensal bakteriler immünojenik potansiyelinin incelenmesi bir temel bağırsak ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri okurken bileşenidir. De farklı commensals ana bağırsak bağışıklık sistemini uyarmak için farklı bir potansiyel sergi kuruldu. Bu tür araştırmalar omurgalı hayvanlar, özellikle kemirgenler içerir. Beri artan etik kaygılar omurgalılar içeren deneyler ile bağlantılı, omurgasız yedek modelleri için yüksek bir talep vardır.
Burada, biz komensal sigara Patojen bakteriler ve commensals immünojenik potansiyelini ortaya çıkarmak mümkün değerlendirmenin G. mellonella bağışıklık sistemi üzerinde kullanarak Galleria mellonella sözlü yönetim modeli sağlar. G. mellonella Bacteroides vulgatus ve Escherichia coligibi farklı immünojenik potansiyeli olan commensals analiz sağlar model yararlı alternatif omurgasız değiştirme olduğunu ispat. İlginçtir, bakteri öldürme etkilemez larvalar, memeliler için benzer olduğu sergiledi. G. mellonella bağışıklık yanıtı omurgalı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ile karşılaştırılabilir ve bakteri tanınması ve antimikrobiyal moleküllerin üretimini içerir. Önerdiğimiz G. mellonella sağlıklı memeli bireylerin bilinen önceki microbiota dengeyi yeniden başardı. G. mellonella ve omurgalıların karşılaştırılabilir doğuştan gelen bağışıklık yanıtları sağlayan rağmen G. mellonella edinilmiş bağışıklık sistemi liman değil. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin incelenen bileşenleri korunmuş evrimsel olduğundan, model bakteriyel immünojenik özellikleri prescreening ve ilk analiz sağlar.
Introduction
Bağırsak microbiome homeostazı bakım için gerekli bir bileşenidir ve her ikisi de doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı1,2içerir. Komensal microbiota toplum tarafından farklı ana komensal bileşenlerinin karakterizedir: yararlı etkileri önemli immunomodulatory fonksiyonları ve zararlı etkileri genetik olarak yatkın olabilir pathobionts tarafından tevdi simbiont ev sahipliği yapan ve teşvik ve bağırsak iltihabı3,4tetikler. Birçok çalışma simbiont ve pathobionts ve onların etkisi ana bağışıklık sistemi esas olarak edinilmiş bağışıklık yanıtı eğitim yayınlanmıştır.
İncelemeler ve korunması için birçok hayvan dahil bu çalışmaları ve kamu yararı artan deney için kullanılan hayvanların yerini beri immünojenik farklı bakteriyel bir tarama için izin vermek için model değiştirme bulmak için aramak özellikleri. Böcekler, özellikle Galleria mellonella, enfeksiyon araştırma bir çok kullanılan yedek modeli olan. G. mellonella düşük maliyet ve yüksek işlem hacmi gibi farklı avantajlarını birleştiren; bakteri doğal poz yol olan sözlü yönetimine izin verir ve sistemik enfeksiyon5,6için sağlar. G. mellonella daha da kuluçka 37 ° c °, memeliler ve bakteriyel virülans faktörü ifade5için optimum fizyolojik vücut sıcaklığını sağlar. Korunmuş doğuştan gelen bağışıklık sistemi kendi kendine ayırımcılığa karşı olmayan kendine sağlar ve desen tanıma reseptörleri apolipophorin veya bağlar hemolin6, gibi çeşitli kodlar G. mellonella büyük avantajı olduğunu 7. mikrop tanıma farklı akış aşağı humoral bağışıklık yanıtı G. mellonella tetikleyebilir. Bu oksidatif stres yanıt teşvik ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) NOS (nitrik oksidaz synthase) ve NOX (NADPH oksidaz)6,8aktivite içeren salgılar. Buna ek olarak, gloverin, moricin, cecropin veya defensin benzeri gallerimycin6, gibi farklı amper karışımı salgılanmasını sonuçlanan bir güçlü antimikrobiyal peptid (AMP) yanıt G. mellonella etkinleştirir 8,9,10. Genellikle, amper gram pozitif ve gram-negatif bakteri ve mantar karşı oldukça geniş ana bilgisayar özgüllük ve böcekler herhangi bir adaptif yanıt10eksik olan bu yana güçlü bir yanıt sağlamak zorunda. Gloverin bakteri ve mantar karşı etkin bir AMFİ ve dış membran oluşumu6,11engeller. Moricins membran delici ve gözenek9,11şekillendirme antimikrobiyal işlevlerine gram pozitif ve gram-negatif bakteri karşı sergi. Cecropins bakteri ve mantar karşı etkinliği sağlamak ve membran moricins9,10gibi benzer şekilde permeabilize. Gallerimycin anti-mantar özellikleri9defensin benzeri peptid var. İlginçtir, bu cecropin ve gallerimycin ile birlikte E. coli10karşı sinerjik bir etkinlik vardı bulundu.
Onların kullanımı kolay karakter G. mellonella nedeniyle larva bakteriyel patojenitesi değerlendirmek için bir sık kullanılan enfeksiyon modeli vardır. Özellikle, G. mellonella elde edilen veri çalışmalarda fareler çekmek--dan bu alternatif ana modeli gücünü elde edilen verilerle aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Listeria Monositogenez en patojenik serotipleri bir fare enfeksiyon modelinde de G. mellonella yüksek mortalite oranları için sistemik enfeksiyon sonra yol bulundu. Daha fazla, daha az öldürücü serotipleri de G. mellonella model12' daha az zehirli olduğu ortaya çıktı. Benzer gözlemler insan patojenik mantarlar Candida albicansile yapılmıştır. Virülans farklı C. albicans suşları değerlendirildi sistemik enfeksiyon ve sonraki larva yaşama izleyerek. Fare olmayan suşlar da olmayan ya da sergilenen fare öldürücü soy da yüksek larva ölüm13kurşun ise G. mellonella, virülans azaltılmış. G. mellonella modeli daha fazla tür 3 salgı sistemi patojenitesi faktörler Pseudomonas aeruginosa14tanımlamak için kullanılabilir.
Çoğu araştırmalar G. mellonella içeren sistemik enfeksiyon yaklaşımı kullanarak virülans faktörleri üzerinde durulmuştur beri biz bir sözlü kuvvet içinde bağırsak commensals analizi için uygun bir yöntem sağlayan özellikle ilgi vardı hangi biz bakteri larva başına ayrı bir doz uygulanır ve larva ölüm oranı sadece gözlemlemek ama doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bağırsak homeostazı korumak için farklı işaretlerinden analiz modeli.
Bizim yöntem biz bakteri uygulanması ve RNA ifade analizi birleştirmek beri model değiştirme olarak G. mellonella kullanımını artırmak için yardımcı olur. Sadece sözlü yönetim ve sadece ölüm oranları gözlem sistemik enfeksiyon sonra sonra bağışıklık yanıtı analizi de dahil olmak üzere zaman bakteriyel Patogenez çalışmalar anlamını güçlendirmek yararlı değildir. Bizim yöntemleri sağlar bakteriyel immünojenik özellikleri analiz için patojenik olmayan bu yana commensals yaşayan bir organizma bir bağırsak bariyer sunarak hücre kültürü daha daha karmaşık koşullar sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. G. mellonella yetiştirme ve deneyler için larvalar hazırlanması
Not: Son larva biçim yumurtadan döngüsü yaklaşık 5-6 hafta sürer.
- Balmumu güve substrat (% 22 Mısır ezmesi, % 22 buğday yemek, % 17.5 balmumu, % 11 yağsız süt tozu, % 11 tatlım, % 11 gliserol, kurutulmuş % 5.5 Maya) içeren 2 L kutularına yetişkin güveler barındırmanın yumurtaları aktarın. Karanlıkta 30 ° C'de ıslahı bütün gerçekleştirin.
- Yaklaşık 1-2 ne zaman küçük ve küçücük larva görünür hafta sonra taze substrat larva içeren substrat 25 g aktarın. Onların büyüklüğüne göre 2 hafta sonra larva eşitlemek ve 30-40 larva grupları 2 L konteynırları balmumu güve substrat üzerine ek 2 hafta boyunca tutun.
- Larvalar deneyler için ağırlık olarak seçin. Sadece soluk ve hızlı hareketli larvalar 180-200 mg bir kitle ile kullanın.
2. yetiştirme ve Bacteroides vulgatus ve Escherichia coli hazırlanması sözlü Yönetim için
- Anaerobik kavanoz ve paketler anaerobik bir ortam oluşturmak için kullanarak 37 ° C'de zorunlu anaerobik bakteri Bacteroides vulgatus mpk büyümek (bakınız Tablo reçetesi)15,16. B. vulgatus yetiştirmek için 2 gün ve bir gecede alt kültür beyin kalp infüzyon (BHI) et suyu içinde büyür.
- Fakültatif anaerobik bakteri Escherichia coli mpk Luria-Bertani (LB) suyu 37 ° C'de aerobik koşullarda büyümek E. coli LB suyu geceleme yetiştirmek ve 37 ° C'de 2 h için alt kültür denemenin gün büyümek.
- Kültürler tarafından Santrifüjü 1.700 x g 5 dk. Resuspend bakteriyel DPBS (Dulbecco'nın Phosphate-Buffered serum fizyolojik) granül, hasat. OD 600 nm, bakteriyel kültürlerde optik yoğunluk (OD) belirlemek ve bakteri konsantrasyonu hesaplayın. Bakteriyel konsantrasyonları 109/mL için ayarlandı.
3. G. mellonella larvaları ile bakteri süspansiyonlar, kuvvet
- Her larva 10 µL doz başına 107 bakteri içeren ayarlanan bakteriyel süspansiyon ile yedirin. Oral uygulama bakteriyel süspansiyon için künt uçlu iğneyle bir insülin şırınga kullanın.
- Microsyringe pompa (şekil 1her larva uygulanan süspansiyon birime doğruluğunu sağlamak için) içine şırınga düzeltmek ( Tablo malzemelerigörmek). Şırınga dikkatle arasında onların sapa takın. Sapa arasında şırınga zorlamayın. Larvalar ağız açmak ve şırınga eklemek bekleyin.
- 1-24 h. kullanım DPBS tarafından idare edilen larvaların potansiyel stres yanıt-e doğru kuvvet sırasında larvalar işlenmesi nedeniyle indüklenen dışlamak için sahte arka plan denetimleri arasında 37 ° C'de karanlıkta force-fed larvalar kuluçkaya.
4. sözlü olarak yönetilen larva ve RNA izolasyon işleme
- Bir başlık altında iş ve koruyucu gözlük giymek. Hood ve sprey reaktif RNase kontaminasyonu önlemek için temizlemek.
- Ek-yaşayan larva kuluçka sonra sıvı azot donma ve onları lunaparkçı. Bir harç ve pistil homojenizasyon için kullanın. Toz homogenates üretilen kadar sıvı azot larva her bireyin harç ve kılavuz için ekleyin.
- Homogenate tekne ağırlığında bir tek kullanımlık için dökün ve sıvı azot buharlaşır bekleyin.
- Sıvı nitrojen içermeyen dondurulmuş Trizol 1 mL 2 mL tüp ile toz homogenates mix ve 1 h için oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya.
- 8000 x g 15 dakika oda sıcaklığında karisimin santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz bir tüpün içine aktarmak ve Pelet atın. Süpernatant 1-Bromo-3-sersemletici (BCP) 200 µL ile karıştırın. Girdap ve karışımı oda sıcaklığında 5 min için ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya.
- BCP eklendi reaksiyonlar, 18.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Üst şeffaf katman yeni bir 2 mL tüp içine aktarmak ve dinlenme atın. Karıştırma ve 5 min için tüp ters çevirme tarafından transfer edilen üst tabaka ile 500 µL isopropanol RNA çökelti.
- Tüp, 18.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi Çöktürülmüş RNA Pelet 500 µL % 75 etanol ile yıkayın.
- 5-10dk RT., RNA Pelet Makinası Bitmedi daha sonra çözmek zor olacak gibi kuru için dikkat ediniz.
- Ribonükleaz inhibitör (1: 100) nükleaz ücretsiz su sulandırmak ve kurutulmuş RNA Pelet resuspend için 100 µL çözüm kullanın. Girdap tüp kadar dikkatle Pelet tamamen çözülür.
- Ölçü RNA kalite ve miktar. 260/280 oranı yaklaşık 2.0 ve 260/230 oranı 2.0-2.2 ( Tablo malzemelerigörmek) aralığında olduğundan emin olun.
- İzole RNA'ın 5 µg Dnaz sindirim için kullanın. Mix 5 µL 10 x arabellek, ribonükleaz inhibitör enzim 1 µL, 2 µL Dnaz enzim RNA ve doldurmak nükleaz ücretsiz ile 5 µg su 50 µL. Incubate 30 dk RT. az için
- 6 µL inactivation reaktif ekleyin ve RT ve girdap reaksiyon, 2 min için bazen kuluçkaya. Taze 1,5 mL tüp içine 10.000 x g 1 dk. Transfer süpernatant için de tepki santrifüj kapasitesi.
Not: RNA larva RNA gibi sözlü yönetimi için kullanılan ilgili zorlanma bakteriyel RNA içerir.
- 6 µL inactivation reaktif ekleyin ve RT ve girdap reaksiyon, 2 min için bazen kuluçkaya. Taze 1,5 mL tüp içine 10.000 x g 1 dk. Transfer süpernatant için de tepki santrifüj kapasitesi.
5. miktar kuvvet sonra bakteriyel 16S kopya sayıların
Not: Bölüm 4 çıkarılan RNA sentez cDNA kullanarak ifade bakteriyel 16S kopya numaralarını tespit edilmiştir. Son miktar içinde B. vulgatus veya E. coli 16S PCR parçası klonlanmış plazmid standart bir eğri yardımı ile hesaplanır.
- Plazmid standartların hazırlanması
- 16s parçaları E. coli mpk veya B. vulgatus mpk genomik DNA PCR tarafından yükseltmek. Mix 10 µL tampon, 10 mM dNTP çözüm, 2.5 µL 10 µM ileri astar ve 10 µM ters astar seyreltme 2.5 µL 1 µL, DMSO, genomik DNA şablonunun 1 µL, nükleaz ücretsiz su 31,5 µL ve ispat okuma enzim 0.5 µL 1 µL x 5.
- PCR çalıştırmak (ilk denatürasyon: 98 ° C 30 s, denatürasyon: 10 98 ° C s, tavlama: 30s, uzantısı için 60 ° C: 72 ° C 30 s, son uzantısı: 72 ° C 5 dk, tekrar denatürasyon, tavlama ve 30 döngüleri için uzantısı için).
- 16s E. coli astar kullanmak (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) veya 16S B. vulgatus astar (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) için amplifikasyon.
- E. coli ve B. vulgatus 16S PCR parçaları künt uçlu bir klonlama vektör klonlama için kullanın. Tüp ligasyonu ayarla ve 2 tampon, 1 µL PCR ürünü olmayan saf, künt uçlu klonlama plazmid, nükleaz ücretsiz su 7 µL ve T4 DNA ligaz 1 µL 1 µL x 10 µL karıştırın. Tüp ligasyonu RT., 10 min için kuluçkaya
- E. coli DH5α yetkili hücreleri hazırlayın.
- Bir Erlenmeyer flask ortamda LB 100 mL 1 mL bir gecede kültür ile aşılamak. OD 600 nm 0.4-0.6 arasında olana kültür büyümek. Elde edilen kültür iki 50 mL tüpler içine split ve kültürler 10 min için buz üzerinde kuluçkaya.
- 1.700 x g 4 ° C'de 10 dakika için de kültürler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak ve her Pelet dikkatle 5 mL RFI çözeltisi ile resuspend (30 mM CH3aşçı, 100 mM KCl, 10 mM CaCl, 50 mM MnCl2, ayarlamak filtre pH 5,8 buzul asitle steril). Her tüpün ek 45 mL RFI çözeltisi ile doldurun.
- 1.700 x g 4 ° C'de 10 dakika için de kültürler santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak ve her Pelet dikkatle 6 mL RFII (10 mM BEZLERİ, 15 mM CaCl2, 10 mM KCl, % 15 gliserol, autoclaved) ile resuspend çözüm. Her iki kesirler havuz ve 12 mL süspansiyon 15 dk. hazırla hücre süspansiyon aliquots (200 µL) için buz üzerinde kuluçkaya. Aliquots-80 ° C'de depolayın
- Bir aliquot için ligasyonu tepki yetkili E. coli transfer DH5α hücreleri ve buz 15 dk. ısı için tepki izinli şok hücreler için 45 s 42 ° c ve 1 mL LB orta ekleyin.
- 37 ° C'de 45 dk için dönüşüm kuluçkaya Ampisilin içeren LB agar plaka 100 µL dönüştürme ekleyin ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Koloni 8 elde edilen transformants PCR adım 5.1.5 LB agar tabaktan gerçekleştirin. Her koloni bir kürdan ile almak, Ampisilin (ana plaka) içeren bir taze LB tabağa daldırma ve sonra bir de içeren 5.5 µL PCR şeritlerinin nükleaz ücretsiz suyun içine aynı kürdan batır.
- 2 x PCR Mix 7.5 µL, 0.5 µL 10 µM ileri astar ve 10 µM ters astar seyreltme 0.5 µL ekleyin. 5.1.1 bölümünde açıklanan aynı astar çiftleri kullanın.
- PCR çalıştırmak (ilk denatürasyon: 95 ° C 5 min için denatürasyon: 95 ° C için 1 dakika, tavlama: 30s, uzantısı için 60 ° C: 72 ° C için 1 dakika, son uzantısı: 7 dk, tekrar denatürasyon, tavlama ve 35 döngüleri için uzantısı için 72 ° C).
- 16S parçaları üzerinde % 1'özel jel boyutunu doğrulayın. Özel 1 g dağıtılması ve bir mikrodalga fırında kaynatın 0.5 x Tris-Bor-EDTA (TBE) arabellek kullanın. Jel ve dökmek için 1:50,000 boya ekleyin. Koloni PCR reaksiyonları ve 100 bp DNA merdivenle jöleye ekleyin ve 45 dk için jel 110 V çalıştırın.
- Ampisilin ile bir klon değil INSERT boyutu içeren her E. coli ve B. vulgatus 16S plazmid için ana plaka (Bölüm 5.1.6) içeren 5 mL LB gecede kültürü aşılamak.
- 2 mL tüp 1.700 x gde gecede bakteriyel kültürlerde santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet 600 µL steril su resuspend.
- 6 kez tüp ters çevirme tarafından 100 µL lizis arabellek ve karışımı ekleyin. Soğuk (4 ° C) 350 µL eklemek nötralize çözüm ve tüp ters çevirme tarafından iyice karıştırın.
- Santrifüj 3 dakika süreyle santrifüj maksimum hızda Transfer süpernatant (~ 900 µL) bir spin sütun ve santrifüj bir santrifüj 15 için maksimum hızda s.
- Flowthrough atmak ve bir santrifüj 15 için maksimum hızda endotoksin Temizleme yıkama ve santrifüj 200 µL eklemek s.
- Yıkama çözüm 400 µL sütununu ekleyin ve temiz 1.5 mL tüp kolona 30 s. Transfer için bir santrifüj maksimum hızda santrifüj kapasitesi, elüsyon arabellek sütuna 30 µL kuluçkaya oda sıcaklığında 1 dk. için ekleyin.
- Santrifüj bir santrifüj 30 için maksimum hızda s ( Tablo malzemelerigörmek).
- Plazmid DNA konsantrasyonu ile çalışma çözüm (floresan boya arabelleği her reaksiyon için 199 µL başına 1 µL) 199 µL plazmid DNA 1 µL karıştırılarak belirlemek. Standart 2 standart 1 ya da 10 µL 10 µL 190 µL. ile karıştırılarak iki standartları hazırlamak girdap örnek ve standart borular ve tepki 2 dk. ölçü konsantrasyonu için kuluçkaya ( Tablo malzemelerigörmek).
- Standart 10 kat seri dilutions 10-100.000 kopya çeşitli konsantrasyonlarda hazırlamak: hesaplama tek plazmid kütlesi (m = (n) (1.096x10-21 g/bp), x n = plazmid boyutu, m kütle =). Plazmid DNA ilgi istenen kopya sayıları içeren için gerekli kitle hesaplamak (kopya sayısı faiz tek plazmid kütlesi x plazmid DNA gerekli kütlesi =).
- Miktar için örnek hazırlanması
- CDNA sentez. Mix 2 µL 7 x arabelleği, Bölüm 4 ve 11 µL nükleaz ücretsiz su üzerinden Dnaz sindirilmiş RNA'ın 1 µL. 42 ° C'de 2 min için kuluçkaya
- Tepki hemen buza koyun. Mix 4 µL 5 x RT arabellek, 1 µL RT (ters transkriptaz) astar karıştırın, 1 µL RT enzim ve adım 5.2.1 tepki. 42 ° C'de 15 dakika kuluçkaya RT enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 95 ° c 3 min için kuluçkaya.
- 5.1.9. adımda anlatıldığı gibi konsantrasyonları fluorometrically cDNA ölçmek.
- CDNA sentez. Mix 2 µL 7 x arabelleği, Bölüm 4 ve 11 µL nükleaz ücretsiz su üzerinden Dnaz sindirilmiş RNA'ın 1 µL. 42 ° C'de 2 min için kuluçkaya
- Bakteriyel yük ölçümü
- CDNA konsantrasyonları 5'e ayarlamak ng başına kantitatif PCR 12 µL tepki. Mix 2 x RT-PCR karışımı, 0,25 µL 100 µM ileri astar, 100 µM ters astar (5.1.1) 0,25 µL ve düzeltilmiş cDNA 12 µL. QPCR çalıştırın (ilk denatürasyon: 95 ° C 5 min için denatürasyon: 10 95 ° C s, tavlama: 30 60 ° C s, tekrar denatürasyon ve erime 35 devredir tavlama: 95 ° C, serin aşağı 4 ° C).
- Günlük10 konsantrasyonları plazmid standart eğri (10-100.000 kopya), yani 1-5 (x ekseni), karşılık gelen ct değerlerini karşı (y ekseni) arsa. Regresyon denklemi elde etmek için doğrusal regresyon gerçekleştirmek. (Konsantrasyon) x Denklemi çözmek. Formülün formüle ct-değer ekleyerek kopya sayıların günlük10 hesaplamak için kullanın. Kopya numaralarını elde etmek için antilogarithm hesaplayın.
6. doğuştan gelen bağışıklık marker gen kantitatif RT-PCR kullanarak tespiti
- Astar için gen-özgüllük PCR ve sonraki özel Jel Elektroforez doğru parça boyutu doğrulamak için denetleyin. PCR gibi 5.1.5 bölümünde açıklanan gerçekleştirin.
Ubikuitin 130 bp: TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC ileri, ters CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (düzeni)
Nox-4 159 bp: TGGCACGGCATCAGTTATCA, geriye doğru ACAGCGACTGTCATGTGGAA8 ileri
Nos 76 bp: ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, geriye doğru GCCATTTTACAATCGCCACAA8 ileri
Gst 156 bp: GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, geriye doğru TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA8 ileri
ApoIII 265 bp: AGACTTGCACGCCATCAAGA, geriye doğru TGCATGCTGTTTGTCACTGC8 ileri
hemolin 267 bp: CTCCCTCACGGAGGACAAAC, geriye doğru GCCACGCACATGTATTCACC8 ileri
gallerimycin 161 bp: GAAGTCTACAGAATCACACGA, geriye doğru ATCGAAGACATTGACATCCA8 ileri
cecropin 158 bp: CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, geriye doğru GTAGCTGCTTCGCCTACCAC8 ileri
gloverin 101 bp: GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, geriye doğru CCGTGCATCTGCTTGCTAAC8 ileri
moricin 124 bp: GCTGTACTCGCTGCACTGAT, geriye doğru TGGCGATCATTGCCCTCTTT8ileri) - Astar verimliliği olmak değerlendirmek E = 2.
- 5-10 farklı olumlu örnekleri (yani, astar çifti araştırılması gerekiyor gen ifade örnekleri) 2 µL havuz.
- Örnek Havuzu 1:5 seyreltme dizi hazırlamak: Standart 1 (S1): su katılmamış Havuzu; S2: 2 µL S1 + 8 µL nükleaz ücretsiz su; S3: 2 µL S2 + 8 µL nükleaz ücretsiz su; S4: 2 µL S3 + 8 µL nükleaz ücretsiz su.
- 1 µL S1-S4 ve bir şablon kontrol (su nükleaz içermeyen) bir 96-şey qPCR plaka için geçerlidir. 5 µL RT ana karıştırın, her 100 µM ileriye ve geriye doğru astar 0.1 µL, 3.7 µL nükleaz ücretsiz su ve RT Mix iyi başına 0.1 µL ekleyin.
- Kantitatif RT-PCR çalıştırmak (ters transkripsiyon: 50 ° C 10 dk, ilk denatürasyon: 95 ° C 5 min için denatürasyon: 10 95 ° C s, tavlama: 30 60 ° C s, tekrar denatürasyon ve erime 40 devredir tavlama: 95 ° C, serin aşağı 4 ° C).
- Arsa oturum10 S1-S4 (1, 0,2, 0,04, 0.008) için göreli birimlerinin (x ekseni) karşılık gelen ct-değerleri (y ekseni). Doğrusal regresyon gerçekleştirmek ve standart eğrinin eğimini belirler. E: E = 10-(1/slope)verimlilik hesaplamak. 20
Not:-3.32 eğimi ideal reaksiyon koşulları ve E = 2,00 verimliliğini astar gösterir. Bu anlamına gelir: PCR ürün miktarını iki katına her döngüsü sırasında.
- Kullanım 100 ng sindirilir RNA'ın (100 ng/µL) RT-PCR için bir şablon olarak. Mix RT-PCR reaktif ve çalışma RT-PCR belirtilen bölüm 6.2 gibi. Tüm bakteri ve DPBS yönetilen örnekleri ev astar çifti ve hedef astar çiftleri ile ölçmek. Her zaman S1-S4 dilutions ev astar çifti ve S1-S4 ile hedef astar çifti ile verimliliği tayini için aynı plaka üzerinde çalışır.
- Oranı (R) RNA gen ekspresyonu temizlik ve hedef astar çifti deneysel olarak kararlı astar verimliliğini kullanarak aşağıdaki formüle göre hesaplar. Bakteri normalize uyarılmış örnekleri denetimler20alay etmek.
R: oranı
Ehedef: S1-4 verimliliğini hedef astar çifti ile ölçülen
Eev: S1-4 verimliliğini ev astar çifti ile ölçülen
Δcthedef(Denetim örnekli): Δct (DPBS beslemeli örnek ct)-(bakteri beslemeli örnek ct) hedef astar çifti ile ölçülen
Δctev(Denetim örnekli): Δct (DPBS beslemeli örnek ct)-(bakteri beslemeli örnek ct) ev astar çifti ile ölçülen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
G. mellonella hemolymph enfeksiyon modelinde çok çeşitli patojenler virülans faktörleri analiz için yaygın olarak kullanılan. Çoğu ölçümleri oldukça kolay bir yöntem larva ölüm analizini içerir. Yine de, bu yöntem değil genel olarak bağışıklık yanıtı hakkında sonuçlar izin ve G. mellonella bağışıklık yanıtı sonuçlarını omurgalı bağışıklık mekanizmasını kullanarak bağlayın. G. mellonella sözlü yönetim modeli diğer taraftan sadece nadiren oral enfeksiyon veya larva zorluklar nedeniyle kolonizasyon için tam enfeksiyon dozaj9elde etmek için kullanılır. Ayrıca, sadece az G. mellonella doğuştan gelen bağışıklık yanıtı olmayan Patojen bakteriler özellikle memeli bağırsak commensals doğru hakkında bilinir.
Patojenler, aksine commensals ev sahibi ve tetikleyici bağışıklık yanıtı meydan ama ana bağışıklık sistemi bağışıklık homeostazı korumak yapabiliyor. G. mellonella sonunda bakteri artık tespit kadar ilk force-fed bakteri yükü (Şekil 2)8temizlemek yapabiliyor. 16s B. vulgatus ve E. coli Gen kopya numaraları 24 h içinde önemli ölçüde azalmıştır.
Komensal yönetilen gösterdi G. mellonella larva neden RNA gen ekspresyonu farklı doğuştan gelen bağışıklık marker gen: LPS-tanıma moleküller - apolipophorin (ApoIII) ve hemolin (şekil 3A, B) genellikle daha yüksek E. coliifade edilecek gösterildi- B. vulgatusiçin karşılaştırıldığında larva yönetilen-larva8yönetilen. Ayrıca, marker gen ekspresyonu antimikrobiyal molekülleri iki türlü izlenebilir. Reaktif oksijen ve azot türler (ROS/RNS) B. E. coli kuvvet üzerine upregulated güçlü olmak karşılaştırıldığında gösterdi Nos ve Nox-4 gen ekspresyonu ölçümü tarafından tahmin edilebilir vulgatus (şekil 4A, B)8. Ayrıca, antioxidative Gst gen ekspresyonu (şekil 4C) gözlenen. 8
Ayrıca farklı antimikrobiyal peptid ifade daha güçlü E. coli yönetiminde B. vulgatus kuvvet yanıt sonra akımıdır olduğunu gösterdi. Biz upregulation defensin benzeri gallerimycin peptid, LPS etkileşim gloverin peptid, cecropin ve moricin (şekil 5A, B, C, D)8gözlenen.
Resim 1 : Microsyringe pompa kullanarak kurulum kuvvet. Bir künt uçlu iğne bakterilerin hassas enjeksiyon sağlayan microsyringe pompa ayarlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kuvvet sonra sebat, Galleria mellonella larva bakteriyel seferdeki. B. vulgatus- ve E. colinumaraları kopyalama-belirli 16s rDNA genler 5 tespit cDNA RT-PCR kullanarak farklı zaman noktalarda ng. Veri noktaları ortanca gösterge ile gösterilir. Yapılan başvuruyu 8 değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Fark örüntü tanıma G. mellonellatarafından bakteri. Larva ile iki farklı bağırsak commensals idare, RNA 1-6 h sonra izole edildi ve LPS tanıma molekül apolipophorin (ApoIII)(a)ve hemolin (B) mRNA ifadesi belirlendi. Veri noktalarını temsil eden standart hata ortalamaya araçlarla geometrik (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0.001). 8 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : ROS marker gen ekspresyonu bakteriyel meydan sonra. E. coli ve B. vulgatus force-fed ve ROS savunma marker gen ekspresyonu zaman içinde analiz edildi. No'ları (A) Nox-4 (B) ve Gst (C) mRNA ifade izole larva RNA ölçülen. Veri noktalarını temsil eden standart hata ortalamaya araçlarla geometrik (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0.001). Yapılan başvuruyu 8 değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : G. mellonella larva ve insan epitel hücreleri defensin benzeri antimikrobiyal peptid komensal kaynaklı ifadede. Larva sözlü B. vulgatus veya E. coliile yönetilen, bağışıklık yanıtı zamanla gözlendi ve RNA larva bireyler izole edildi. gallerimycin(a)cecropin (B), gloverin (C), moricin (D) mRNA ifade kararlıydım. Veri noktalarını temsil eden standart hata ortalamaya araçlarla geometrik (SEM) (p > 0,05; *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0.001). Yapılan başvuruyu 8 değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
G. mellonella modeli bir sistemik enfeksiyon yaklaşım21bakteriyel virülans faktörleri değerlendirmek için sık kullanılan bir modeldir. Bu yana birçok patojenler ve bakteri ana bilgisayar yolu ile sözlü kolonizasyon veya enfeksiyon yol girin, yeni anlayışlar G. mellonella sözlü kolonizasyon ve enfeksiyon için bir model olarak değerlendirmek için bulunmak gerekiyor.
Vücut sıcaklığı 37 ° C5en memeli modelleri korumak beri olasılığını arka G. mellonella 15-37 ° C arasında büyük bir avantajdır. G. mellonella larva farklı tedarikçiler satın alınabilir ama kendi üreme nüfus kurulması deneyleri ile müdahale, tahmini daha çok başlatmak için deneyler antibiyotikler yokluğu gibi birçok avantaj sağlar beri tedarikçiler her zaman kullanıma hazır aşamasında larva sağlamaz ve stres yanıt ulaşım veya sıcaklık değişiklikleri nedeniyle kaçınılmalıdır. G. mellonella sıcaklık toleransı nedeniyle ıslah yapılabilir Sıcaklık aralığı yüksektir. Daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı geliştirme larva ve üreme sıcaklığına göre yol, yaşam döngüsü son larva biçim yumurtadan tahmin edebilirsiniz. Larva deneyler için seçildiğinde yalnızca soluk ve hızlı hareket eden bireyler herhangi bir stres ve bağışıklık ile deneyler girişimine reaksiyonları önlemek için seçilmiştir.
Force-feeding modeli kurmak için oral uygulama başarılı olduğunu emin olmak gerekir. Bu nedenle, çeşitli denemeler için kuvvet için amaçlanan çözüm bir güçlü bromophenol boya eklendi kurmak yardımcı oldu. Bu yaralı herhangi bir larva dışlamak ve sadece onların gut22içinde mavi boya var larva için seçmek için yardımcı olur.
Bu modeli kullanarak, G. mellonella larva doğuştan gelen bağışıklık yanıtı Kinetik belirli marker gen araştırmak yararlı bulundu. Sözlü yönetim modelinin kurulması ve bağışıklık yanıtı Kinetik incelenmesi sırasında yerel olarak midgut ifade değil için gen ekspresyonu bulduk. Midgut RNA Komensal bakteriler sözlü yönetim sonra ayıklamak için ilk deneysel çalışmalarda kesin sonuç vermedi. Bu nedenle, bağışıklık yanıtı "genel olarak" Bütün bireylerde belirlenmiştir. Bu bulgular destek bağırsak reseptörleri üzerinden küresel tanıma hipotezi, iletim sinyal ve extraintestinal gen ekspresyonu tetikliyor. Genel olarak, G. mellonella amper esas olarak yağ vücutta ikna etmek mümkün, ama daha fazla hemocytes ve bağırsak sistemi9. G. mellonella larva antimikrobiyal molekülleri doku özel üretim enfeksiyon sonra ilgili kesin bilgi yok olduğundan, Bütün larva RNA tam bireylerin ayıklanmış ve RNA geni raporlaması için kullanılan ifade. Bir daha bütün larva RNA ekstraksiyon gut ve bakteri yükü ölçmek için olasılık içinde yaşayan bakterilerin tam kapsama avantajdır. Gut diseksiyon bakteri nedeniyle hazırlık kaybına neden olabilir.
Çoğu G. mellonella araştırma bakteriyel virülans özellikleri üzerinde gerçekleştirilen bu yana özellikle eğer ve nasıl larvaları memeli microbiota parçası olan patojenik olmayan bakteri karşı bağışıklık yanıtı tetiklemek idi. Son zamanlarda, G. mellonella ve memeliler homolog olan benzer bileşenleri doğuştan gelen bağışıklık yanıtının paylaşmak ve evrimsel korunmuş gösterdi. Nitrik oxid synthase (Nos) ve NADPH oksidaz (Nox) gen benzerliği8yüksek derecede paylaşır. G. mellonella limanları daha fazla yapısal benzerlikler memeli β defensin 2 ile hisse defensin benzeri antimikrobiyal peptid gallerimycin8.
Sözlü yönetim modelini kullanarak anti-inflamatuar simbiyotik B. vulgatus veya pro-inflamatuar pathobiotic E. colifark bakteriyel tanınması göstermek mümkündü. Ayrıca aşağı akım oksidatif stres yanıt ve antimikrobiyal peptid üretim daha yüksek B. vulgatus yönetim8' e göre E. coli yönetim sonra indüklenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser enfeksiyon araştırma (DZIF) (SPP1656) DFG, DFG araştırma eğitim grubu 1708, Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) ve Alman Merkezi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S.
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
