Summary
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מודל הניהול אוראלי בעזרת הזחלים mellonella גלריה (galleria) , כיצד לאפיין המושרה תגובות מערכת החיסון המולדת. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים ללא ניסיון מעשי תהיה אפשרות להשתמש mellonella ג שיטת פיטום.
Abstract
החקירה של הפוטנציאל immunogenic של חיידקים commensal על המערכת החיסונית המארח הוא מרכיב חיוני אחד כאשר הלומדים אינטראקציות מארח-חיידק מעיים. היא מבוססת היטב commensals שונים התערוכה פוטנציאל שונים כדי לעורר את המערכת החיסונית מעיים של המארח. בחקירות אלה כרוכים בעלי חוליות, בעיקר מכרסמים. מאז לחששות הגוברים אתית מקושרים עם ניסויים מעורבים בעלי חוליות, יש ביקוש גבוה למודלים תחליפים הגעה.
כאן, אנו מספקים מודל הניהול אוראלי Galleria mellonella באמצעות חיידקים פתוגניים שאינם commensal והערכה אפשרי של הפוטנציאל immunogenic של commensals על המערכת החיסונית mellonella ג . נדגים כי mellonella ג הוא מודל חלופי הגעה חלופיות שימושי המאפשר הניתוח של commensals עם פוטנציאל immunogenic שונים כגון בקטריודיס vulgatus ו- Escherichia coli. מעניין, החיידקים הציג אין השפעה הרג על הזחלים, בדומה יונקים. תגובות מערכת החיסון של mellonella ג היו דומות עם חוליות תגובות מערכת החיסון המולדת, לערב ההוקרה של חיידקים וייצור של מולקולות מיקרוביאלית. אנו מציעים כי mellonella ג היה מסוגל להחזיר את האיזון microbiota הקודם, אשר כידוע אנשים יונקים בריאים. למרות מתן תגובות מערכת החיסון מולדים דומות mellonella ג והן חולייתנים, mellonella ג הנמל לא מערכת חיסונית אדפטיבית. מאז מרכיבי מערכת החיסון המולדת ובדוקים אבולוציונית ששומרו, המודל מאפשר ניתוח prescreening, הראשון של מאפיינים immunogenic חיידקי.
Introduction
Microbiome מעיים היא מרכיב חיוני לצורך תחזוקה של הומאוסטזיס, כרוכה בשתי תגובות מערכת החיסון מולדים, מסתגלת1,2. הקהילה commensal microbiota מאופיינת המרכיבים השונים commensal הראשי: אנחנו חיים איתם בסמביוזה המקנים השפעות מועילות על ידי פונקציות חשובות immunomodulatory, ו pathobionts זה יכולות להיות השפעות מזיקות ועוצמתיים מארחת, לקדם, לעורר דלקת מעיים3,4. מחקרים רבים בנושא אנחנו חיים איתם בסמביוזה ו pathobionts והשפעתם על המערכת החיסונית מארח התפרסמו בעיקר לומדת תגובות מערכת החיסון מסתגלת.
מאז מחקרים אלה כרוכים חיות רבות החקירות והגנה על החלפה של בהמות המשמשות לניסויים היא גוברת טובת הציבור, אנו שואפים למצוא מודל חלופי כדי לאפשר הקרנה של בקטריאלי שונה immunogenic מאפיינים. חרקים, במיוחד mellonella גלריה (galleria), הם מודל חלופי בשימוש נרחב במחקר זיהום. Mellonella ג משלב יתרונות שונים כגון עלויות נמוכות, תפוקה גבוהה; זה מאפשר אוראלי מנהלה של חיידקים, תוואי החשיפה טבעי, וזה מאפשר זיהום סיסטמי5,6. Mellonella ג נוסף מאפשר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר טמפרטורת הגוף הפיזיולוגיות של יונקים ו אופטימום בשביל התקפה אלימה חיידקי גורם ביטוי5. היתרון העיקרי של mellonella ג הוא מערכת החיסון המולדת שנשמרת זה מאפשר את מאפליה של האני-עצמי ושל מקודד מגוון של קולטנים זיהוי דפוס כמו apolipophorin או hemolin opsonin6, 7. על זיהוי חיידק, mellonella ג ניתן מפעילים שונים התגובות החיסון במורד הזרם ההורמונאלית. זה יכול לגרום תגובות סטרס חמצוני, מפרישים מינים חמצן תגובתי (ROS) הכוללת את הפעילות של NOS (סינתאז אוקסידאז חנקתית) ו- NOX (nadph ל אוקסידאז)6,8. בנוסף, mellonella ג מפעילה תגובה פפטיד מיקרוביאלית חזק (אמפר), כשהתוצאה היא ההפרשה של תערובת של מגברים שונים כגון gloverin, moricin, cecropin או gallerimycin כמו defensin6, 89,,10. באופן כללי, מגברים יש ירידה לפרטים מארח די רחבה נגד חיידקים גראם גראם שליליים ופטריות ויש לספק מענה חזק מאז חרקים חסרים כל תגובה מסתגלת10. Gloverin המגבר פעיל נגד חיידקים ופטריות, מעכב הממברנה החיצונית היווצרות6,11. Moricins התערוכה תפקידם מיקרוביאלית נגד חיידקים גראם גראם שליליים על ידי לחדור את הקרום ויוצרים9,נקבובית11. Cecropins לספק פעילות נגד חיידקים ופטריות, permeabilize את קרום באופן דומה כמו9,moricins10. Gallerimycin הוא פפטיד דמוי defensin עם תכונות אנטי פטרייתי9. מעניין, נמצא כי השילוב של cecropin ו- gallerimycin היה פעילות סינרגטיים נגד e. coli10.
בשל אופיים קל לשימוש mellonella ג הזחלים הם מודל זיהום שמרבים להשתמש בו כדי להעריך פתוגניות חיידקי. בפרט, מחקרים הנתונים המתקבלים ג mellonella לתאם עם נתונים שהושגו עכברים מהתמיכה של הכוח של מודל זה מארח חלופי. התברר כי הכי פתוגניים אשר נגרמו מהזנים אליהם של ליסטריה במודל זיהום של עכברים להוביל גם שיעורי התמותה גבוהים יותר mellonella ג לאחר זיהום סיסטמי. עוד יותר, פחות ארסית אשר נגרמו מהזנים אליהם התברר להיות גם פחות ארסית המודל של mellonella ג 12. תצפיות דומות שנעשו עם הפטריות פתוגניים האנושי קנדידה אלביקנס. התקפה אלימה של שונות אלביקנס ג זנים יש להיות מוערך על-ידי זיהום סיסטמי ובפיקוח עוקבות של הישרדות זחל. זני avirulent העכבר היו גם avirulent או הייצוגיים מופחתת התקפה אלימה ב mellonella ג, ואילו זנים מידבק עכבר להוביל גם גבוהה התמותה זחל13. המודל mellonella ג נוסף ניתן להשתמש כדי לזהות גורמים פתוגניות של מערכת הפרשת סוג 3 של Pseudomonas aeruginosa14.
מאז רוב החקירות מעורבים mellonella ג התמקדו הגורמים התקפה אלימה באמצעות גישה זיהום סיסטמי היינו מעוניינים במיוחד לספק שיטה מתאימה לניתוח של המעי commensals ב פיטום אוראלי מודל שבו אנחנו ניתן להחיל מינון שונות של חיידקים לכל הזחלים, לא רק להתבונן שיעור התמותה הזחל אך לנתח המחפשים אחר תגובות מערכת החיסון המולדת כדי לשמור על הומאוסטזיס מעיים.
השיטה שלנו מסייע להגדיל את השימוש mellonella ג כמודל חלופי מאז אנו משלבים את היישום של חיידקים וניתוח של RNA הביטוי. זה שימושי לא רק לחזק את המשמעות של מחקרים פתוגנזה חיידקי כאשר כולל הניתוח של תגובות חיסוניות לאחר ניהול אוראלי, לא רק את התצפית של שיעורי תמותה לאחר זיהום סיסטמי. השיטות שלנו מאפשר הניתוח של המאפיינים immunogenic של בקטריאלי פתוגניים שאינם commensals, שכן הוא מספק תנאים מורכבים יותר מאשר תרבית תאים על-ידי המציע מכשול המעי באורגניזם חי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mellonella ג לגידול והכנה של הזחלים הניסויים
הערה: מחזור מביצה אחרונה instar זחל אורכת כ- 5-6 שבועות.
- להעביר את הביצים שמטילים עש למבוגרים 2 L תיבות המכיל שעווה עש המצע (גריסים תירס 22%, 22% חיטה ארוחה, 17.5% דונג דבורים, אבקת חלב כחוש 11%, 11% מותק, 11% גליצרול, 5.5% מיובש שמרים). לבצע את כל רבייה של 30 מעלות צלזיוס בחושך.
- העברת 25 גרם של מצע המכיל את הזחלים לתוך מצע טרי לאחר כ 1-2 שבועות כאשר הזחלים זעירים וקטנים היו גלויים. לסנכרן את הזחלים לאחר 2 שבועות על פי גודלם ולשמור קבוצות של 30-40 הזחלים במיכלים 2 ל' על שעווה עש המצע למשך שבועיים נוספים.
- בחר את הזחלים לניסויים לפי משקל. השתמש רק חיוור ומהר הזחלים נעים עם מסה של 180-200 מ ג.
2. טיפוח והכנה של בקטריודיס vulgatus ו- Escherichia coli לניהול אוראלי
- לגדל את mpk בקטריודיס vulgatus גידול חיידק אנארובי ב 37 מעלות צלזיוס צנצנות באמצעות anaerobically שקיות ליצירת סביבה אנאירובית (ראה טבלה של חומרים)15,16. לטפח vulgatus נולד ב- 2 ימים ולגדול תת-תרבות לילה בהמוח הלב אינפוזיה (BHI) מרק.
- לגדל את mpk Escherichia coli חיידק אנארובי עיצוב גבות בתנאים אירוביים בתוך מרק לוריא-Bertani (LB) ב 37 º C. לטפח e. coli לילה ב- LB מרק ולגדול תת-תרבות עבור 2 h ב 37 מעלות צלזיוס ביום של הניסוי.
- הקציר התרבויות על ידי צנטריפוגה ב x 1,700 g עבור 5 דק Resuspend בקטריאלי. גללים ב- DPBS (של Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים). לקבוע את צפיפות אופטית (OD) של התרבויות חיידקי-OD 600 nm ולחשב את ריכוז חיידקי. ריכוז חיידקי הותאמו ל- 109/mL.
3. פיטום כפוי של הזחלים mellonella ג עם המתלים חיידקי
- להאכיל כל זחל עם 10 µL של ההשעיה חיידקי מנוכי עונתיות המכיל חיידקים 107 למנה. השתמש של מזרק אינסולין עם מחט הסתיימה בלאנט אוראלי יישום של המתלה חיידקי.
- לתקן את המזרק לתוך משאבה microsyringe (איור 1) על מנת להבטיח את הדיוק של אמצעי האחסון ההשעיה יישומית כל זחל (ראה טבלה של חומרים). הכנס את המזרק בזהירות בין הלסת שלהם. כופה את המזרק בין הלסת. המתן הזחלים לפתוח אותו mouthparts, ואז להוסיף את המזרק.
- דגירה הזחלים כשרותם בחושך ב 37 מעלות צלזיוס בין 1-24 ח' DPBS שימוש בניהול הזחלים כפקדי רקע מדומה כדי לא לכלול הפוטנציאלי תגובות הלחץ הנגרם עקב הטיפול של הזחלים במהלך פיטום.
4. עיבוד של הזחלים אוראלית ובידוד RNA
- לעבוד תחת ברדס, בטיחות משקפיים. נקה הכימית הוד, תרסיס למניעת זיהום RNase.
- Snap-להקפיא הזחלים חיים לאחר דגירה של חנקן נוזלי, homogenize אותם. להשתמש מרגמה עם פיסטיל המגון. מוסיפים חנקן נוזלי מכתש ועלי רשת לכל אדם זחל עד homogenates אבקת מיוצרים.
- שופכים את homogenate כדי חד פעמי שקילה הסירה ולחכות החנקן הנוזלי מתמוססות.
- לערבב הנוזל נטולת חנקן קפוא אבקת homogenates עם 1 מ"ל של Trizol בשפופרת 2 מ"ל, דגירה התערובת בטמפרטורת החדר מאובטח.
- Centrifuge את התערובת ב x 8000 g למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, להעביר את תגובת שיקוע לתוך צינור טריים וזורקים בגדר. מערבבים את תגובת שיקוע עם 200 µL של 1-ברומו-3-Chloropropane (BCP). מערבולת דגירה התערובת עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, 10 דקות על קרח.
- Centrifuge את התגובות BCP-נוסף ב x 18,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר שקוף השכבה העליונה לתוך צינור 2 מ"ל ולהשליך את השאר. לזרז את הרנ א של השכבה העליונה שהועברו עם אלכוהול איזופרופיל µL 500 על ידי ערבוב, היפוך הצינור במשך 5 דקות.
- Centrifuge את הצינור ב x 18,000 g למשך 15 דקות ב 4 º C. רחץ בגדר RNA precipitated עם µL 500 של 75% אתנול.
- יבש בגדר RNA למשך 5-10 דקות ב- RT. לטפל ולא יבש זה כפי שזה יהיה קשה להמיס מאוחר יותר.
- לדלל ריבונוקלאז (1: 100) במים נטולי נוקלאז ולהשתמש µL 100 של הפתרון resuspend בגדר RNA מיובשים. מערבולת הצינור בזהירות עד בגדר היא התפרקה לחלוטין.
- מדד ה-RNA איכות וכמות. ודא כי היחס 260/280 יחס 2.0 ו- 260/230 בטווח של 2.0-2.2 (ראה טבלה של חומרים).
- השתמש µg 5 של RNA מבודד לעיכול DNase. מיקס 5 µL של 10 x מאגר, µL 1 של ribonuclease מעכבי האנזים, 2 µL של האנזים DNase, 5 µg RNA, מתמלאות נוקלאז ללא מים עד 50 µL. Incubate במשך 30 דקות ב- RT.
- מוסיפים 6 µL של ריאגנט איון, דגירה למשך 2 דקות ב RT ו מערבולת התגובה מדי פעם. צנטריפוגה התגובה ב x 10,000 g עבור 1 הגבלת העברת תגובת שיקוע לתוך צינור mL 1.5 טריים.
הערה: הרנ א מכיל את הרנ א זחל, כמו גם את ה חיידקי המתח בהתאמה המשמש לניהול דרך הפה.
- מוסיפים 6 µL של ריאגנט איון, דגירה למשך 2 דקות ב RT ו מערבולת התגובה מדי פעם. צנטריפוגה התגובה ב x 10,000 g עבור 1 הגבלת העברת תגובת שיקוע לתוך צינור mL 1.5 טריים.
5. כימות של המספרים עותק בקטריאלי מטוסי אף-16 לאחר פיטום
הערה: המספרים עותק של מטוסי אף-16 חיידקי ביטוי נקבע באמצעות cDNA מסונתז מן הרנ א שחולצו בסעיף 4. כימות הסופי מחושב עם העזרה של עיקול רגיל של פלסמיד שבו השבר PCR מטוסי אף-16 של vulgatus דרב או e. coli היה לשכפל.
- הכנת תקנים פלסמיד
- להגביר את מטוסי אף-16 קטעים e. coli mpk או vulgatus דרב mpk הדנ א על ידי ה-PCR. µL מיקס 10 של 5 x מאגר, 1 µL של פתרון dNTP 10 מ מ, 2.5 µL של פריימר לפנים 10 מיקרומטר ו 2.5 µL של דילול פריימר הפוכה 10 מיקרומטר, µL 1 של דימתיל סולפוקסיד, µL 1 של תבנית ה-DNA גנומי, 31.5 µL של מים נטולי נוקלאז µL 0.5 של הגהת האנזים.
- להפעיל את ה-PCR (דנטורציה הראשונית: 98 ° C ל 30 s, דנטורציה: 98 ° C עבור 10 s, חישול: 60 מעלות צלזיוס במשך השלושים, סיומת: 72 ° C ל 30 s, סיומת הסופי: 72 ° C 5 דקות, אני חוזר דנטורציה, חישול, סיומת עבור מחזורים).
- השתמש 16 e. coli תחל (p_forward: GTTAATACCTTTGCTCATTGA, p_reverse: ACCAGGGTATCTAATCCTGTT17, 320 bp) או תחל vulgatus נולד ב- 16 (p_forward: AACCTGCCGTCTACTCTT, p_reverse: CAACTGACTTAAACATCCAT18, 400 bp) עבור הגברה.
- השתמש השברים PCR 16 e. coli ו vulgatus דרב בלנט-end שיבוט לתוך השיבוט וקטור. להגדיר מצדו ומערבבים µL 10 של 2 x מאגר, 1 µL של מוצר ה-PCR שאינם מטוהרים, µL 1 של בלאנט-end שיבוט פלסמיד, 7 µL של נוקלאז ללא מים ו- 1 µL של T4 DNA ליגאז. דגירה מצדו 10 דקות ב- RT.
- להכין e. coli DH5α תאים המוסמכת.
- לחסן 100 מ של LB בינוני את הבקבוק Erlenmeyer 1 מ של תרבות בין לילה. לגדול התרבות עד OD 600 nm בין 0.4-0.6. לפצל את התרבות הנוצרת שני צינורות 50 מ ל, דגירה התרבויות על קרח למשך 10 דקות.
- Centrifuge התרבויות ב x 1,700 g 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה בזהירות עם 5 מ של פתרון RFI (30 מ מ CH3קוק, 100 מ מ אשלגן כלורי, 10 מ מ CaCl, 50 מ מ MnCl2, התאמת pH 5.8 בחומצה קרחוני, סטרילי מסונן). ממלאים כל שפופרת נוספים 45 מ של RFI פתרון.
- Centrifuge התרבויות ב x 1,700 g 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה בזהירות עם 6 מ של RFII (MOPS 10 מ מ, 15 מ מ CaCl2, 10 מ מ אשלגן כלורי, גליצרול 15%, בלוק) פתרון. מאגר שני שברים, דגירה התליה 12 mL על קרח במשך 15 דקות הכנה תא הבולם aliquots (200 µL). לאחסן את aliquots ב-80 מעלות צלזיוס.
- להעביר את התגובה מצדו aliquot אחד של המוסמכים e. coli DH5α תאים ולהשאיר התגובה על קרח במשך 15 דקות חום לזעזע את התאים עבור 45 s-42 ° C ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום ליברות.
- דגירה השינוי עבור 45 min ב- 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 100 µL של טרנספורמציית צלחת אגר LB המכיל אמפיצילין, דגירה בין לילה ב 37 º C.
- לבצע המושבה ה-PCR של 8 transformants וכתוצאה מכך מהצלחת אגר ליברות של צעד 5.1.5. לאסוף את כל המושבה עם קיסם, לטבול אותו לצלחת LB טריים המכיל אמפיצילין (לוח אב), ואז לטבול קיסם אותו בתוך µL 5.5 טוב המכיל מים נטולי נוקלאז פס ה-PCR.
- הוספת µL 7.5 של תערובת x PCR 2, 0.5 µL של 10 מיקרומטר פריימר לפנים ו- 0.5 µL של 10 מיקרומטר פריימר הפוכה דילול. השתמש את זוגות פריימר אותו בסעיף 5.1.1.
- להפעיל את ה-PCR (דנטורציה הראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דנטורציה: 95 ° C עבור 1 דקות, חישול: 60 מעלות צלזיוס במשך השלושים, סיומת: 72 ° C עבור 1 דקות, סיומת הסופי: 72 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות, דנטורציה. אני חוזר, חישול וסיומת מחזורים 35).
- בדוק את הגודל של השברים 16 על ג'ל agarose 1%. השתמש 0.5 x טריס-בוראט-EDTA (TBE) המאגר כדי להמיס 1 גר' agarose. והרתיחו אותו במיקרוגל. להוסיף צבע 1:50, 000 ג'ל, שפוך את זה. להוסיף את תגובות PCR המושבה ואת סולם הדנ א bp 100 לג'ל, ולהפעיל את ג'ל למשך 45 דקות-110 V.
- לחסן מ ל LB תרבות הלילה המכיל אמפיצילין עם אחד שיבוט מהצלחת הראשית (סעיף 5.1.6) עבור פלסמיד מטוסי אף-16 כל e. coli ו vulgatus דרב אשר מכיל את הגודל הנכון הוספה.
- Centrifuge התרבויות לילה חיידקי צינור 2 מ"ל ב 1,700 x g. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במים סטריליים µL 600.
- להוסיף 100 µL של פירוק מאגר, מיקס על ידי היפוך הצינור 6 פעמים. להוסיף 350 µL של קור (4° C) פתרון ניטרול, לערבב ביסודיות על ידי היפוך ברכבת התחתית.
- צנטריפוגה במהירות המרבית ומפרידה במשך 3 דקות להעביר את תגובת שיקוע (~ 900 µL) ספין ועמודה צנטריפוגה במהירות המרבית ומפרידה 15 s.
- למחוק את flowthrough ומוסיפים 200 µL של שטיפת הסרת אנדוטוקסין ו צנטריפוגה במהירות המרבית ומפרידה 15 s.
- להוסיף 400 µL של פתרון שטיפת העמודה centrifuge במהירות המרבית ומפרידה להעברת ס' 30 שעמודת צינור נקי mL 1.5, להוסיף µL 30 מאגר • תנאי לעמודה תקופת דגירה זה של 1 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה במהירות המרבית ומפרידה ב-30 s (ראה טבלה של חומרים).
- לקבוע את ריכוז הדנ א פלסמיד על ידי ערבוב µL 1 של פלסמיד DNA עם µL 199 של הפתרון עובד (1 µL של הפלורסנט לכל µL 199 מאגר עבור כל תגובה). להכין שני סטנדרטים על-ידי ערבוב 10 µL של µL 1 או 10 סטנדרטי של 2 רגיל עם µL 190. מערבולת המדגם וצינורות סטנדרטי דגירה תגובה עבור 2 דק למדוד הריכוז (ראה טבלה של חומרים).
- להכין תקן ריכוזים ב 10-fold טורי דילולים בטווח של 10-100,000 עותקים: חישוב המסה של פלסמיד יחיד (m = n (מסוג n) x (g 1.096x10-21/bp) = גודל פלסמיד, m = מסה). לחשב את המסה של פלסמיד דנ א צריך להכיל את המספרים העותק המבוקש עניין (להעתיק מספר ריבית x מסה של פלסמיד יחיד = מסה של פלסמיד DNA הדרושים).
- הכנה של דגימות כמת
- לסנתז cDNA. מערבבים 2 µL מאגר 7 x, 1 µL של RNA DNase-מעוכלים מ סעיף 4 ו-11 µL של נוקלאז ללא מים. תקופת דגירה של 2 דקות ב 42 º C.
- במקום תגובה מיידית על קרח. לערבב 4 µL של 5 x RT מאגר, µL 1 של RT (רוורס טרנסקריפטאז) פריימר מיקס, µL 1 של האנזים RT, התגובה של שלב 5.2.1. תקופת דגירה של 15 דקות ב 42 º C. תקופת דגירה של 3 דקות ב 95° C כדי להשבית את האנזים RT.
- לכמת cDNA ריכוזי fluorometrically כמו שמתואר בשלב 5.1.9.
- לסנתז cDNA. מערבבים 2 µL מאגר 7 x, 1 µL של RNA DNase-מעוכלים מ סעיף 4 ו-11 µL של נוקלאז ללא מים. תקופת דגירה של 2 דקות ב 42 º C.
- מדידה של עומס חיידקי
- להתאים את ריכוזי cDNA 5 ng לכל תגובה 12 µL עבור ה-PCR כמותי. מערבבים 2 x RT-PCR מיקס, µL 0.25 של 100 מיקרומטר פריימר לפנים, µL 0.25 של 100 מיקרומטר פריימר הפוכה (5.1.1) µL 12 של cDNA מנוכי עונתיות. לרוץ qPCR (דנטורציה הראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דנטורציה: 95 ° C עבור 10 s, חישול: 60 ° C ל 30 s, דנטורציה. אני חוזר, חישול מחזורים 35, התכה: 95 ° C, מגניב עד 4 ° C).
- מגרש יומן10 ריכוזי פלסמיד עיקול רגיל (10-100,000 עותקים), כלומר 1-5 (ציר x), נגד ct-הערכים המתאימים (ציר y). לבצע רגרסיה ליניארית כדי לקבל את נוסחת הרגרסיה. לפתור את המשוואה עבור x (ריכוז). להשתמש את הנוסחה לחישוב יומן10 של המספרים העתקה על-ידי הוספת ערך-ct לתוך הנוסחה. לחשב האנטילוגריתם להשיג עותק מספרי.
6. קביעת ג'ין סמן מערכת החיסון מולדים באמצעות RT-PCR כמותי
- בדוק צבעי יסוד גנטי-ירידה לפרטים על ידי ה-PCR agarose הבאים ג'ל אלקטרופורזה כדי לאמת את הגודל הנכון פרגמנט. לבצע PCR כמו שמתואר בסעיף 5.1.5.
130 אוביקוויטין bp: לפנים TCAATGCAAGTAGTCCGGTTC, להפוך CCAGTCTGCTGCTGATAAACC19 (שירות חדרנית)
Nox-4 159 bp: לפנים TGGCACGGCATCAGTTATCA, ACAGCGACTGTCATGTGGAA הפוכה8
Bp nos 76: לפנים ATGAAGGTGCTGAAGTCACAA, GCCATTTTACAATCGCCACAA הפוכה8
Bp Gst 156: לפנים GACAGAAGTCCTCCGGTCAG, TCCGTCTTCAAGCAAAGGCA הפוכה8
ApoIII 265 bp: לפנים AGACTTGCACGCCATCAAGA, TGCATGCTGTTTGTCACTGC הפוכה8
hemolin 267 bp: לפנים CTCCCTCACGGAGGACAAAC, GCCACGCACATGTATTCACC הפוכה8
gallerimycin 161 bp: לפנים GAAGTCTACAGAATCACACGA, ATCGAAGACATTGACATCCA הפוכה8
cecropin 158 bp: לפנים CTGTTCGTGTTCGCTTGTGT, GTAGCTGCTTCGCCTACCAC הפוכה8
gloverin 101 bp: לפנים GTGTTGAGCCCGTATGGGAA, CCGTGCATCTGCTTGCTAAC הפוכה8
moricin 124 bp: לפנים GCTGTACTCGCTGCACTGAT, TGGCGATCATTGCCCTCTTT הפוכה8) - להעריך את יעילות פריימר להיות E = 2.
- בריכת µL 2 של 5-10 דוגמאות חיוביות שונים (קרי, דגימות הם המבטאים את הגן אשר הזוג פריימר צריך שתהיה חקירה).
- להכין סדרה דילול 1:5 של הבריכה מדגם: 1 רגיל (S1): מדולל הבריכה; S2: µL 2 S1 + 8 µL נטולת נוקלאז מים; S3: µL 2 S2 + 8 µL נטולת נוקלאז מים; S4: 2 µL של S3 + מים נטולי נוקלאז µL 8.
- 1 µL של S1-S4 ופקד שאינם מתבנית (נוקלאז נטול מים) חלות על צלחת qPCR 96-ובכן. מוסיפים 5 µL של מיקס מאסטר RT, µL 0.1 של כל 100 מיקרומטר ואחורה פריימר, 3.7 µL של מים נטולי נוקלאז µL 0.1 של RT לערבב לכל טוב.
- לרוץ RT-PCR כמותי (הפוך שעתוק: 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, דנטורציה הראשונית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, דנטורציה: 95 ° C עבור 10 s, חישול: 60 ° C ל 30 s, דנטורציה. אני חוזר, חישול מחזורים 40, התכה: 95 ° C, מגניב עד 4 ° C).
- מגרש כניסה10 יחידות היחסי עבור S1-S4 (1, 0.2, 0.04, 0.008) (ציר x) נגד ct-הערכים (ציר y). לבצע רגרסיה ליניארית ולקבוע את השיפוע של העקומה סטנדרטי. לחשב את היעילות ה': E = 10-(1/slope). 20
הערה: מדרון של-3.32 מציין תנאי ריאקציה אידיאלי והיעילות פריימר של E = 2.00. פירוש: מכפיל כמות ה-PCR המוצר במהלך כל מחזור.
- שימוש 100 ננוגרם של RNA מעוכל (100 ng/µL) כתבנית RT-PCR. מיקס RT-PCR ריאגנטים הפעלה RT-PCR כמו המוזכרים בסעיף 6.2. למדוד כל דוגמאות חיידקים - ו DPBS-מנוהל עם זוג פריימר ניקיון וגם זוגות פריימר היעד. תמיד להפעיל את דילולים S1-S4 עם זוג פריימר ניקיון ו S1-S4 עם הזוג פריימר יעד באותה צלחת לקביעת יעילות.
- חישוב יחס (R) של RNA ביטוי גנים לפי הנוסחה הבאה באמצעות יעילות פריימר השפעול נחוש את משק הבית והן את זוג פריימר היעד. לנרמל חיידקים מגורה דגימות ללעוג פקדים20.
R: יחס
Eהיעד: היעילות של S1-4 נמדד עם זוג פריימר היעד
Eניקיון: היעילות של S1-4 נמדד עם זוג פריימר ניקיון
Δctהיעד(שליטה-sample): Δct של (ct מדגם DPBS-fed)-(ct מדגם חיידקים-fed) נמדד עם זוג פריימר היעד
ניקיוןΔct(שליטה-sample): Δct של (ct מדגם DPBS-fed)-(ct מדגם חיידקים-fed) נמדד עם זוג פריימר ניקיון
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המודל זיהום hemolymph mellonella ג בשימוש נרחב כדי לנתח את הגורמים התקפה אלימה של מגוון ענק של פתוגנים. רוב המדידות כוללים הניתוח של הזחלים התמותה, אשר היא שיטה קלה למדי. יחד עם זאת, שיטה זו לא לאפשר מסקנות לגבי תגובות מערכת החיסון באופן כללי וקשר את התוצאות של תגובות חיסוניות mellonella ג עם מנגנונים חיסוניים חוליות. המודל המינהל אוראלי mellonella ג לעומת רק לעתים רחוקות משמש עבור זיהום אוראלי או התיישבות הזחלים בשל הקשיים להשגת המינון המדויק זיהום9. יתר על כן, רק מעט ידוע על תגובות מערכת החיסון מולדים mellonella ג לקראת חיידקים פתוגניים שאינם בעיקר יונקים commensals מעיים.
בניגוד פתוגנים, commensals לאתגר את תגובות מערכת החיסון מארח והקו הדק אך מערכת החיסון של הפונדקאי היא היכולת לשמור על הומאוסטזיס המערכת החיסונית. Mellonella ג הוא מסוגל לנקות העומס חיידקי כשרותם הראשונית עד סוף סוף אין חיידקים היו לזיהוי יותר (איור 2)8. מטוסי אף-16 ג'ין מספרים עותק של vulgatus דרב וגם e. coli ירד באופן משמעותי בתוך 24 שעות.
הפגנו המנוהלות commensal mellonella ג הזחלים זירוז RNA ביטוי גנים שונים מולדת חסינות סמן הגנים: זיהוי LPS מולקולות - apolipophorin (ApoIII), hemolin (איור 3A, B) הראו להם להתבטא בדרך כלל גבוה יותר e. coli-מנוהל הזחלים לעומת vulgatus דרב-מנוהל הזחלים8. עוד, ניתן לנטר סמן ביטוי גנים של שני סוגים של מולקולות מיקרוביאלית. הייצור של חמצן תגובתי ומינים חנקן (ROS/האחיות המוסמכות) יכול להיות לפי אומדן המדד של ביטוי גנים Nos ו- Nox-4 , אשר היו הפגינו להיות חריפה upregulated על e. coli פיטום בהשוואה B. vulgatus (איור 4A, B)8. יתר על כן, ביטוי גנים של antioxidative Gst יכול להיות שנצפו (איור 4C). 8
כמו כן הראנו כי ביטוי שונה פפטיד מיקרוביאלית היה המושרה חזקה יותר לאחר ניהול e. coli מאשר בתגובה vulgatus דרב פיטום. הבחנו קולטנים upregulation של פפטיד דמוי defensin gallerimycin, אינטראקציה-LPS פפטיד gloverin, cecropin ו- moricin (איור 5A, B, C, D)8.
איור 1 : פיטום התקנה באמצעות משאבה microsyringe. מחט הסתיימה בלאנט מכוון לתוך משאבת microsyringe אשר מאפשר הזרקה מדויקת של חיידקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : ההתמדה של חיידקי טען ב Galleria mellonella הזחלים לאחר פיטום. העתק את המספרים של vulgatus דרב- ו e. coli-מטוסי אף-16 ספציפי rDNA הגנים היו נחושים מ 5 ng של cDNA בנקודות זמן שונות באמצעות RT-PCR. נקודות נתונים מוצגים עם אינדיקציה של החציון. ששינה מהפניית 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : זיהוי תבניות דיפרנציאלית של חיידקים על ידי mellonella ג. הזחלים היו המתקדם עם שני commensals מעיים שונות, RNA היה מבודד אחרי h 1-6, ביטוי mRNA של LPS זיהוי מולקולה apolipophorin (ApoIII) (A) ו- hemolin (B) היה נחוש. נקודות נתונים מייצגים הנדסית אמצעי עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). 8 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ROS סמן ביטוי גנים לאחר אתגר חיידקי. E. coli ו vulgatus דרב היו כשרותם, ביטוי גנים של סמן ההגנה ROS נותחו לאורך זמן. Nos (א), Nox-4 (B) ו- Gst (C) ביטוי mRNA נמדדה ב- RNA זחל מבודד. נקודות נתונים מייצגים הנדסית אמצעי עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). ששינה מהפניית 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : Commensal-induced פפטיד מיקרוביאלית כמו defensin ביטוי הזחלים mellonella ג ו לתאי האפיתל אנוש. הזחלים נוהלו בעל פה עם vulgatus דרב או e. coli, תגובות חיסוניות נצפו לאורך זמן, RNA היה מבודד מאנשים זחל. gallerimycin (א), cecropin (B), gloverin (ג), moricin (ד) ה-mRNA הביטוי היה נחוש. נקודות נתונים מייצגים הנדסית אמצעי עם שגיאת התקן של הממוצע (SEM) (p > 0.05; *, p < 0.05; * *, p < 0.01; * * *, p < 0.001). ששינה מהפניית 8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המודל mellonella ג הוא מודל נפוצות להערכת גורמים התקפה אלימה חיידקי זיהום סיסטמי הגישה21. מאז רבים פתוגנים וחיידקים להיכנס המארח דרך תוואי אוראלי מושבת או זיהום, תובנות חדשות צריך להימצא להעריך mellonella ג כמודל עבור קולוניזציה אוראלי ולדלקת.
האפשרות האחורי mellonella ג בין 15-37 ° C הוא יתרון גדול שכן מודלים יונקים ביותר לשמור על חום הגוף של 37 ° C5. הזחלים mellonella ג ניתן לרכוש מהספקים השונים, אך הממסד של אוכלוסיה הרבייה עצמו מספק יתרונות רבים כגון העדר של אנטיביוטיקה כי לשבש מבחני, יותר הערכה מתי להתחיל ניסויים כיוון הספקים אינם תמיד מספקים הזחלים בשלב מוכן לשימוש תגובות הלחץ הם נמנעו בגלל תחבורה או שינויי טמפרטורה. בשל הסובלנות בטמפרטורה של mellonella ג טווח הטמפרטורה שבו ניתן לבצע הרבייה היא גבוהה. טמפרטורות גבוהות יותר להוביל להתפתחות מהירה יותר של הזחלים ועל פי הטמפרטורה הרבייה, אנו יכולים להעריך את מחזור החיים מביצה אחרונה instar זחל. כאשר הזחלים נבחרו לניסויים, יחידים בלבד חיוורים מהיר-המעבר נבחרו כדי למנוע כל מתח ותגובות החיסון להתערב עם הניסויים.
כדי לבסס את המודל הפיטום הישראלית, זה צריך להיות סמוך ובטוח כי היישום אוראלי היה מוצלח. לכן, זה היה מועיל להגדיר כמה מחקרים אשר צבע חזק bromophenol נוספה הפתרון מיועד פיטום. זה עוזר כדי לא לכלול כל הזחלים פצוע ולבחור עבור הזחלים שיש את צבען כחול רק בתוך הבטן שלהם22.
באמצעות מודל זה, מצאנו כי הזחלים mellonella ג שימושיים לחקור תגובה חיסונית מולדת קינטיקה של גנים מסוימים סמן. במהלך הקמת מודל הניהול אוראלי ואת המחקר של התגובה החיסונית קינטיקה מצאנו ביטוי גנים להתבטא לא באופן מקומי פיתול. הניסויים ניסיוני הראשון כדי לחלץ פיתול RNA לאחר שבעל-פה של חיידקים commensal לא סיפקו תוצאות חותכות. לכן, תגובות מערכת החיסון היו נחושים "גלובלי" אצל כל אנשים. ממצאים אלה תומכים את ההשערה של הכרה עולמית באמצעות קולטנים מעיים, שידור של האות, ומפעילה ביטוי גנים extraintestinal. באופן כללי, mellonella ג הוא מסוגל לגרום אמפר בעיקר בגוף שומן, אבל בהמשך hemocytes ו- המערכת העיכול9. מכיוון שאין אין מידע מדויק על ייצור רקמות ספציפיות של המולקולות מיקרוביאלית של הזחלים mellonella ג לאחר ההדבקה, הרנ א כל זחל היה מופק יחידים מלאה ונועד לשמש assaying RNA ג'ין ביטוי. יתרון נוסף של כל זחל החילוץ-RNA הוא הכלילה מוחלט של חיידקים החיים בתוך הבטן וכן את האפשרות לכמת במטען חיידקי. . הקרע של המעיים עלול להוביל ההפסד של חיידקים עקב הכנה.
מאז רוב המחקרים mellonella ג מבוצעת על התקפה אלימה חיידקי תכונות היינו בעיקר עניין ולא איך הזחלים לעורר תגובות מערכת החיסון לקראת חיידקים פתוגניים שאינם חלק microbiota יונקים. לאחרונה, הראינו כי הן mellonella ג , יונקים לשתף רכיבים דומים של התגובה החיסונית מולדת, אשר הם הומולוגיים, והתפאורה אבולוציונית. Oxid ב חנקתית סינתאז (Nos) ואת הגנים אוקסידאז (Nox) nadph לשתף מידה רבה של דמיון8. Mellonella ג נמלים נוספים gallerimycin פפטיד מיקרוביאלית כמו defensin אשר חולקת דמיון מבני עם 2 β-defensin בתרבית של8.
באמצעות מודל הניהול אוראלי ניתן היה להדגים דיפרנציאלית הכרה חיידקים סימביוטיים אנטי דלקתיות vulgatus דרב או הפרו דלקתיים pathobiotic e. coli. בנוסף תגובות סטרס חמצוני במורד הזרם וייצור פפטיד מיקרוביאלית היו גבוה המושרה לאחר ניהול e. coli לעומת ניהול vulgatus נולד ב- 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומן על ידי את DFG (SPP1656), קבוצת אימון המחקר DFG 1708, את Bundesministerium לדנציג Bildung und Forschung (BMBF), ומרכז גרמנית עבור זיהום מחקר (DZIF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030120086 | |
| 100 bp DNA ladder | Thermo Fisher Scientific | 15628019 | |
| 1-Bromo-3-Chloropropane (BCP) | Sigma-Aldrich | B9673 | |
| 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| 2x Mangomix | Bioline | BIO-25033 | Colony PCR |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 210 261 | |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Beeswax | Mixed-Store.de | - | |
| Brain heart infusion broth | Thermo Fisher Scientific | CM1135 | |
| CloneJET PCR Cloning Kit | Thermo Fisher Scientific | K1232 | Cloning vector for 16S fragments |
| Corn grits | Ostermühle Naturkost GmbH | 306 | Organic cultivation |
| Difco LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | BD | |
| Difoco LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Becton Dickinson | 244610 | |
| DNA-free DNA Removal Kit | Thermo Fisher Scientific | 244510 | Dnase digestion |
| Dried yeast | Rapunzel | - | Organic cultivation |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14040 | |
| Ethanol | VWR | 20821.330 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | W252506 | |
| Honey | Ostermühle Naturkost GmbH | 487 | |
| Isopropanol | VWR | 20842.330 | |
| Lightcycler 480 Instrument II | Roche Molecular Systems | 5015278001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white | Roche Molecular Systems | 4729692001 | |
| Manual Microsyringe Pump with Digital Display | World Precision Instruments | DMP | |
| Micro-Fine+ U-100 insulin syringe 0.3 x 8 mm | Becton Dickinson | 324826 | Oral administration |
| Mortar, unglazed | VWR | 410-9327 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | 13-400-518 | |
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Oxoid AnaeroGen sachets | Thermo Fisher Scientific | AN0025A | Quality and quantity of RNA |
| PCR stripes | Biozym | 710970 | |
| Pestle, unglazed grinding surface | VWR | 410-9324 | |
| Phusion proof-reading enzyme | Thermo Fisher Scientific | F553S | |
| Primers | Biomers | - | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| QuantiFast SYBR Green PCR kit | Qiagen | 204056 | qPCR for bacterial copy number measurment |
| QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit | Qiagen | 204156 | qRT-PCR for gene expression measurements |
| QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205311 | cDNA synthesis |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsHS DNA kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| Qubit fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification of plasmid and cDNA samples |
| RNase-ExitusPlus | AppliChem | A7153 | |
| Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Skimmed milk powder | Sucofin | - | |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | T9424 | |
| Weighing boat | VWR | 10803-148 | |
| Wheat meal | Ostermühle Naturkost GmbH | 6462 | Organic cultivation |
References
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
- Muniz, L. R., Knosp, C., Yeretssian, G. Intestinal antimicrobial peptides during homeostasis, infection, and disease. Frontiers in Immunology. 3, 310 (2012).
- Ivanov, I. I., Honda, K. Intestinal commensal microbes as immune modulators. Cell Host Microbe. 12 (4), 496-508 (2012).
- Ayres, J. S.
- Champion, O. L., Titball, R. W., Bates, S. Standardization of G. mellonella Larvae to Provide Reliable and Reproducible Results in the Study of Fungal Pathogens. Journal of Fungi (Basel). 4 (3), (2018).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. , (2016).
- Buchmann, K. Evolution of Innate Immunity: Clues from Invertebrates via Fish to Mammals. Frontiers in Immunology. 5, 459 (2014).
- Lange, A., et al. Galleria mellonella: A Novel Invertebrate Model to Distinguish Intestinal Symbionts From Pathobionts. Frontiers in Immunology. 9 (2114), (2018).
- Tsai, C. J., Loh, J. M., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. , 1-16 (2016).
- Bolouri Moghaddam, M. R., et al. The potential of the Galleria mellonella innate immune system is maximized by the co-presentation of diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry. 397 (9), 939-945 (2016).
- Casanova-Torres, A. M., Goodrich-Blair, H. Immune Signaling and Antimicrobial Peptide Expression in Lepidoptera. Insects. 4 (3), 320-338 (2013).
- Mukherjee, K., et al. Galleria mellonella as a model system for studying Listeria pathogenesis. Applied and Environmental Microbiology. 76 (1), 310-317 (2010).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunological and Medical Microbiology. 34 (2), 153-157 (2002).
- Miyata, S., Casey, M., Frank, D. W., Ausubel, F. M., Drenkard, E. Use of the Galleria mellonella caterpillar as a model host to study the role of the type III secretion system in Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 71 (5), 2404-2413 (2003).
- Waidmann, M., et al. Bacteroides vulgatus protects against Escherichia coli-induced colitis in gnotobiotic interleukin-2-deficient mice. Gastroenterology. 125 (1), 162-177 (2003).
- Lange, A., et al. Extensive Mobilome-Driven Genome Diversification in Mouse Gut-Associated Bacteroides vulgatus mpk. Genome Biology and Evolution. 8 (4), 1197-1207 (2016).
- Hermann-Bank, M. L., Skovgaard, K., Stockmarr, A., Larsen, N., Molbak, L. The Gut Microbiotassay: a high-throughput qPCR approach combinable with next generation sequencing to study gut microbial diversity. BMC Genomics. 14, 788 (2013).
- Sato, K., et al. OmpA variants affecting the adherence of ulcerative colitis-derived Bacteroides vulgatus. Journal of Medical and Dental Science. 57 (1), 55-64 (2010).
- Freitak, D., et al. The maternal transfer of bacteria can mediate trans-generational immune priming in insects. Virulence. 5 (4), 547-554 (2014).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
