Summary
In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek 96-wells-plaat
Abstract
Alkalische fosfatase (ALP) is een gemeenschappelijk enzym uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen. Het katalyseert de hydrolyse van fosfaat monoesters uit veel moleculen met een pH van fundamentele en speelt een onmisbare rol in het metabolisme van fosfaat. Bij de mens is eukaryote ALP een van de meest gebruikte enzymatische signalen in de diagnose van verschillende ziektes zoals cholestase en rachitis. In S. aureus, ALP wordt gedetecteerd uitsluitend op de celmembraan; het wordt ook uitgedrukt als een secretoire vorm ook. Nog, er is weinig bekend over de functie bij de vorming van biofilms.
Het doel van dit manuscript is om een snelle en betrouwbare test voor het meten van de ALP activiteit in S. aureus biofilm die geen eiwit isolatie vereist. Met behulp van p-nitrofenyl fosfaat (pNPP) als substraat, we gemeten ALP activiteit in S. aureus biofilm gevormd in de weefselkweek 96-wells-platen. Activiteit is gebaseerd op de vorming van de oplosbare reactieproduct gemeten door absorptie van 405 nm. De aard van de hoge doorvoer van de methode van de plaat 96 goed weefselkweek biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor ALP activiteit testen. Hetzelfde experimentele instellen kan ook worden uitgebreid tot andere extracellulaire moleculaire merkers aan biofilm vorming gerelateerde meten.
Introduction
Alkalische fosfatase (ALP) is overal uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen1. Het kan het katalyseren van de hydrolyse van monofosfaat uit verschillende moleculen zoals nucleotiden, eiwitten, alkaloïden, fosfaatesters en afgeleide anhydriden van fosforzuur. Bij de mens is eukaryote ALP aanwezig in vele weefsels, waaronder bot, lever, darm en placenta2. Het speelt een belangrijke rol in proteïne fosforylatie, celgroei, apoptosis, stamcel processen evenals normale skelet mineralisatie. Eukaryotische ALP is ook een belangrijke serum-indicator voor de aanwezigheid van ziekten in bot, lever en andere weefsels/organen wanneer verhoogde3,4.
Prokaryote ALP is geconstateerd in een verscheidenheid van bacteriële cellen, met inbegrip van E. coli5, S. aureus6,7 en sommige gemeenschappelijke pens bacteriën in de bodem-8. Bacteriële ALP activiteit is gebruikt als een biosensor in de detectie van bacteriële besmetting10, pesticiden en zware metalen9 . De constitutieve uitdrukking van ALP is gebruikt om te identificeren van de staphylococcen11 en Serratia onderscheiden van Enterobacter12. Verder wordt voorgesteld dat de constitutieve ALP productie is gecorreleerd met pathogeniteit in staphylokokken13. Hoewel ALP is onderzocht in verschillende instellingen,3,4, is nog weinig gerapporteerd voor de activiteit en de functie in biofilms culturen.
Een biofilm heeft gedocumenteerd te hebben een verschillend functionerende bacteriële leven ten opzichte van haar free-living bacteriële cel tegenhanger14. In S. aureus, is de vorming van een biofilm geconstateerd in een verscheidenheid van klinische omstandigheden en rekeningen voor de resistentie tegen antibiotica en chronische ontsteking15,16. Veel moleculen te vinden in een biofilm matrix zoals polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden had gemeld, maar het mechanisme van biofilm vorming is niet volledig begrepen14. Om te begrijpen van de rol van ALP in biofilm vorming, we gekweekt van S. aureus biofilms in 96 goed weefselkweek platen en de activiteit van de ALP met behulp van para-nitrophenylphosphate (pNPP) gemeten.
De pNPP van het molecule is een kant-en-klare substraat voor ALP en is wijd verbeid gebruikt voor het meten van de ALP activiteit6,17,18. Deze colorimetrische bepaling is gebaseerd op de omzetting van para-nitrofenyl fosfaat (pNPP) te para-nitrofenol, resulterend in een gekleurd product op 405 nm. Vergeleken met andere conventionele ALP assay, zoals agarose gel elektroforese19, tarwekiemen agglutinin (WGA) neerslag, en WGA-HPLC20, deze test zeer specifiek is, zorgt gevoelig, gemakkelijk te reproduceren, en de meeste bovenal voor hoge doorvoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. middelgrote voorbereiding
- 1 L van al soja Bouillon (TSB) bereiden: in 1 L gedestilleerd water, voeg 15 g van alvleesklier digest van caseïne, 5 g van papaic digest van sojameel, 3 g natriumchloride, 2,5 g dextrose, en 2,5 g van dikaliumhexafluorozirkonaat fosfaat. Steriliseren vóór gebruik.
- Voor al soja Agar (TSA), 15 gram agar toevoegen aan 1 L van TSB, autoclaaf. Vervolgens laten afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens giet in een verhouding van 20 mL per petrischaal (100 mm x 15 mm).
- Biofilm kweekmedium: Voeg 10 g glucose tot 1 L van gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Steriliseren door filtratie met behulp van een 0,2 µm filter.
2. S. aureus Biofilm vorming in 96 goed weefselkweek plaat
Opmerking: De biofilm van S. aureus is gekweekt als eerder beschreven6,21.
- Een individuele kolonie van S. aureus van TSA in TSB 10 mL beënten en 's nachts groeien bij 37 ° C.
- Verdun de overnachting cultuur in 10 mL TSB/glucose (10 g/L) bij een verhouding van 1:100 (v/v). Vortex voorzichtig te mengen voor een consistente concentratie.
- Breng 200 mL verdunde cultuur in een totaal van 18 putten (meer voor experimentele groepen, deze een controle van de niet-biofilm te suggereren een relatie met ALP activiteit6) van één 96 goed plaat. Drieling gebruiken voor elk punt van de tijd: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min. Zie stap 3.2.
- Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur voor de biofilm vorming6,21.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.
- Wassen elk goed met 1 x fosfaatgebufferde oplossing (PBS, pH 7.4), gedurende 5 min bij 15.000 x g centrifugeren en de bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.
3. meting van de ALP activiteit in S. aureus Biofilm
Opmerking: ALP activiteit werd gemeten als beschreven6,18.
- Voeg 75 mL gebufferde ALP substraat verkrijgbare pNPP uit aan elk putje van stap 2.6 en beginnen met het opnemen van de tijd. Elk punt van de tijd opnemen in drievoud.
- Na incubatie gedurende een gevarieerd tijd: 0 min (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min respectievelijk 75 µL van 5 M NaOH om te stoppen met de reactie toevoegen.
- De plaat gedurende 5 minuten bij 15.000 x gcentrifugeren.
- Pipetteer 100 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 96 goed plaat voor colorimetrische meting.
- Meet de extinctie van elke goed bij het gebruiken van 405 nm plaat een 96 goed lezer. Gebruik 0 min tijd wijs wells controle voor achtergrondruis van 405 nm.
- Herhaal het hele experiment in drie afzonderlijke 96 goed platen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een representatief resultaat van ALP activiteit van biofilm culturen van S. aureus in 96 goed weefselkweek platen. 75 μL van verkrijgbare pNPP oplossing was toegevoegd aan elk goed en bebroede bij kamertemperatuur. Na incubatie gedurende verschillende tijden (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min, respectievelijk) 75 μL van 5 M NaOH toevoegde aan zet de reactie stop. Het product werd vervolgens gemeten in een 96 goed afleesapparaat op 405 nm. Elk punt van de tijd werd herhaald in de drieling uit een enkele 96 goed plaat, en het hele experiment werd herhaald in 3 afzonderlijke 96 goed platen.
Figuur 1: S. aureus biofilm culturen werden geïncubeerd met pNPP substraat voor verschillende keer (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min) en hun ALP-activiteit werd gemeten op 405 nm. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze assay gebruikten we pNPP als de ALP substraat. Dit is een werkende oplossing ontworpen voor ELISA en niet te worden verdund. Na hydrolyse door ALP, een gele product ontwikkelt en kan worden gemeten op 405 nm. Aan het einde van de enzymatische reactie, we kort de 96 goed plaat gecentrifugeerd en het supernatant overgebracht naar een verse 96 goed plaat voor het meten van de absorptie met behulp van de-afleesapparaat. We vonden dat deze extra centrifugeren stap is van cruciaal belang, aangezien hierdoor de samenhang van de absorptie bij 405 nm, waarschijnlijk door het elimineren van mogelijke zwevende cellen ontstaan tijdens enzymatische reactie.
Voor de vorming van de biofilm gebruiken we 200 μl van een verdunning van 1:100 (v/v) voor overnachting cultuur als gerapporteerde6,21. Dit is de optimale verdunning voor S. aureus vormen van biofilm in vergelijking met andere verdunningen (gegevens niet worden weergegeven). Aangezien het doel van deze paper is voor het meten van de ALP activiteit in de biofilm, was het cruciaal dat we optimale biofilm kweekomstandigheden gehandhaafd. Dit werd verder benadrukt door de keuze in het gebruik van glucose bij 10 g/L voor optimale biofilm groei6. De verdunning factor en glucose concentratie moet worden geoptimaliseerd als verschillende bacteriële cellen worden gebruikt voor de vorming van de biofilm.
Tijdens de broedtijd van de cultuur van de biofilm met pNPP substraat duurt het tijd voor de gekleurde product te ontwikkelen. We gemeten ALP activiteit na 15 tot 30 min tijd punten die is wanneer de zichtbare gele kleur wordt waargenomen. Met de huidige concentratie merkten we een verhoogde activiteit van de ALP voor maximaal 75 min, zoals aangegeven in Figuur 1. Na 75 min, werd geen verhoging van de ALP-activiteit vastgesteld.
Tot slot, aangezien de ALP in S. aureus is een uitsluitend membraan gebonden eiwit7, haar activiteit kan worden getest zonder lysis van de cel. Er zijn voordelen aan een enzym activiteit bepaling die geen hele cel vernietiging vereist. Met name kan het eiwit isolatie proces soms een lagere hoeveelheid actief enzym-22opleveren. Nochtans, kan dit protocol niet worden gebruikt als ALP niet in zijn membraan-gebonden vorm.
Zoals eerder gemeld6, is ALP activiteit verheven in de biofilm cultuur ten opzichte van de Platonische tegenhanger. De experimentele instellingen gebruikt in de huidige studie kunnen worden uitgebreid om te onderzoeken factoren/verbindingen die invloed hebben op de ALP activiteit in S. aureus biofilm. De bevindingen van deze studies zal extra inzicht geven in hoe u kunt besturen van bacteriële biofilm vorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken William Rainey Harper College en de Universiteit van Illinois in Chicago voor de mogelijkheid om de uitvoering van deze experimenten. Wij danken ook McGraw Hill Foundation voor hun gulle steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
