Summary
I dette manuskriptet etablert vi en høy gjennomstrømning metode for å kvantifisere alkalisk fosfatase aktivitet i S. aureus biofilm kultur fra 96-brønns vev kultur plate
Abstract
Alkalisk fosfatase (ALP) er en vanlig enzym uttrykt i både prokaryotic og eukaryotic celler. Det gir hydrolyse av fosfat monoesters fra mange molekyler på grunnleggende pH og spiller en uunnværlige rolle i fosfat metabolisme. Hos mennesker er eukaryote ALP en av de mest brukte enzymatisk signalene diagnostisere ulike sykdommer, som cholestasis og rakitt. I S. aureus, ALP oppdages på cellemembranen; Det er også uttrykt som en sekretoriske form også. Likevel, lite er kjent om dens funksjon biofilm formasjon.
Hensikten med denne oppgaven er å utvikle en rask og pålitelig analysen for å måle ALP aktivitet i S. aureus biofilm som ikke krever protein isolasjon. Bruker p-nitrophenyl fosfat (pNPP) som et substrat, målt vi ALP aktivitet i S. aureus biofilm dannet i 96-brønnen vev kultur plater. Aktivitet basert på dannelsen av løselig reaksjon produktet målt ved 405 nm absorbance. Høy gjennomstrømning natur metoden 96 godt vev kultur plate inneholder en følsom og reproduserbar metode for ALP aktivitet analyser. Det samme eksperimentelle definere kan også utvides for å måle andre ekstracellulære molekylære markører knyttet til biofilm formasjon.
Introduction
Alkalisk fosfatase (ALP) uttrykkes overalt i begge prokaryotic og eukaryotic celler1. Det kan katalysere hydrolyse av monofosfat fra ulike molekyler som nukleotider, proteiner, alkaloider, fosfat estere og anhydrider i form av fosforsyre. Hos mennesker finnes eukaryote ALP i mange vev inkludert lever, bein, tarmen og morkaken2. Det spiller en viktig rolle i protein fosforylering, cellevekst, apoptose, Stamcelle prosesser samt normal mineralisering. Eukaryote ALP er også en nøkkel serum indikator for tilstedeværelsen av sykdommer i bein, leveren og andre vev/organer når opphøyet3,4.
Prokaryote ALP ble oppdaget i en rekke bakterielle celler, inkludert E. coli5, S. aureus6,7 og noen vanlige rumen bakterier i jord8. Bakteriell ALP aktivitet har blitt brukt som en biosensor i deteksjon av plantevernmidler og tungmetaller9 bakteriell forurensning10. Grunnleggende uttrykk for ALP har blitt brukt til å identifisere stafylokokker11 og skille Serratia fra Enterobacter12. Videre er det foreslått at konstituerende ALP produksjon er korrelert med virusets i stafylokokker13. Selv om ALP har vært studert i forskjellige innstillinger3,4, men lite er rapportert for aktiviteten og funksjon i biofilm kulturer.
En biofilm er dokumentert for å ha et annerledes fungerende bakteriell liv mot sin frittlevende bakteriell celle motpart14. I S. aureus, har dannelsen av biofilm blitt identifisert i en rekke klinisk betingelser og kontoer for antibiotikaresistens og kronisk betennelse15,16. Mange molekyler hadde blitt rapportert i en biofilm matrise som polysakkarider, proteiner, atomer syren og lipider, men mekanismen av biofilm formasjon er ikke fullt ut forstått14. For å forstå rollen ALP i biofilm formasjon, vi kulturperler S. aureus biofilm i 96 godt vev kultur plater og målt ALP aktiviteten bruker para-nitrophenylphosphate (pNPP).
Molekyl-pNPP er en klar-å-bruke substrat for ALP og har vært mye brukt til å måle ALP aktivitet6,17,18. Denne kolorimetrisk analysen er basert på konverteringen av para-nitrophenyl fosfat (pNPP) til para-nitrophenol resulterer i en farget produktet ved 405 nm. Sammenlignet med andre konvensjonelle ALP analysen, som agarose gel geleelektroforese19, hvetespirer agglutinin (WGA) nedbør, og WGA-HPLC20, denne analysen er svært spesifikke, lar følsom, lett å reprodusere, og aller viktigst, for høy gjennomstrømming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. middels forberedelse
- Forberede 1 L av Tryptic soya kjøttkraft (TSB): I 1 L destillert vann, legge til 15 g bukspyttkjertelen Sammendrag av kasein, 5 g av papaic Sammendrag av Soyabønne måltid, 3 g av natriumklorid, 2.5 g druesukker og 2.5 g dipotassium fosfat. Sterilisere før bruk.
- For Tryptic soya Agar (TSA), legge til 15 g agar 1 L TSB, autoclave. Så la den avkjøles til romtemperatur. Deretter hell i forholdet 20 mL per Petriskål (100 mm x 15 mm).
- Biofilm kultur medium: legge til 10 g av glukose 1 L autoklaveres TSB. Sterilisere ved filtrering bruker filtere 0,2 µm.
2. S. aureus Biofilm formasjon i 96 godt vev kultur Plate
Merk: S. aureus biofilm er kultivert som tidligere beskrevet6,21.
- Vaksinere en personlige koloni av S. aureus fra TSA i 10 mL av TSB og vokse over natten på 37 ° C.
- Fortynne overnatting kulturen i 10 mL av TSB/glukose (10 g/L) i 1: 100 (v/v) forholdet. Vortex forsiktig å blande for en konsekvent konsentrasjon.
- Overføre 200 mL utvannet kultur til totalt 18 brønner (mer for eksperimentell grupper, slik ikke-biofilm kontroll å foreslå en sammenheng ALP aktivitet6) fra en 96 godt plate. Bruke tredobbelt for hvert punkt: 0 minutter, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min. Se trinn 3.2.
- Inkuber 96 godt platen ved 37 ° C i 24 timer for biofilm formasjon6,21.
- Dekanter nedbryting av aspirasjon.
- Vask hver med 1 x fosfat bufret løsning (PBS, pH 7.4), sentrifuge for 5 min på 15.000 x g og Dekanter nedbryting av aspirasjon.
3. måling av ALP aktivitet i S. aureus Biofilm
Merk: ALP aktivitet ble målt som beskrevet6,18.
- Legg til 75 mL bufrede ALP substrat bestående av kommersielt tilgjengelige pNPP i hver brønn fra trinn 2.6 og starte tidsregistreringen. Registrere hvert punkt i tre eksemplarer.
- Etter inkubasjon variert tid: 0 min (kontroll), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min henholdsvis, Legg 75 µL av 5 M NaOH å stoppe reaksjonen.
- Sentrifuge platen i 5 min på 15.000 x g.
- Overføre 100 µL av nedbryting til en ny 96 godt plate for kolorimetrisk måling.
- Måle absorbansen hver i 405 nm bruker en 96 godt plate leseren. Bruke 0 min tid peker brønner kontrollen for 405 nm bakgrunnsstøy.
- Gjenta hele eksperimentet i tre individuelle 96 bra plater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et representativt resultat ALP aktivitet fra biofilm kulturer av S. aureus i 96 godt vev kultur plater. 75 μL kommersielt tilgjengelig pNPP løsning lagt til hver godt og inkubert ved romtemperatur. Etter inkubasjon for ulike tider (0 minutter, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min, henholdsvis) 75 μL 5 M NaOH ble lagt til stoppe reaksjonen. Produktet ble deretter målt i en 96 godt plate leser ved 405 nm. Hvert tidspunkt ble gjentatt i trillinger fra en enkelt 96 godt plate, og hele eksperimentet ble gjentatt i 3 personlige 96 bra plater.
Figur 1: S. aureus biofilm kulturer ble inkubert med pNPP substrat for annen gang (0 minutter, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min og 75 min) og deres ALP aktivitet ble målt ved 405 nm. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I analysen vår brukte vi pNPP som ALP underlaget. Dette er en fungerende løsning designet for ELISA og ingen utvanning er nødvendig. Etter hydrolyse av ALP, en gul produkt utvikler og kan måles ved 405 nm. På slutten av den enzymatiske reaksjonen, vi kort sentrifugeres 96 godt platen og overført nedbryting til en frisk 96 godt plate å måle absorbansen likner plate. Vi fant at dette ekstra sentrifugering trinnet er kritisk, siden det øker konsistensen av absorbans ved 405 nm, sannsynligvis ved å eliminere mulige suspendert celler påløper under den enzymatiske reaksjonen.
For biofilm formasjon bruker vi 200 μL av en 1: 100 (v/v) fortynning for natten kultur som rapportert6,21. Dette er den optimale fortynning for S. aureus danner biofilm sammenlignet med andre fortynninger (data ikke vist). Siden formålet med utredningen er å måle ALP aktivitet i biofilm, var det viktig at vi opprettholdt optimal biofilm oppdrettsforholdene. Dette ble videre understreket av valget ved glukose på 10 g/L for optimal biofilm vekst6. Fortynning faktor og glukose konsentrasjonen må optimaliseres hvis forskjellige bakterielle celler brukes for biofilm formasjon.
Under inkubasjonen biofilm kultur med pNPP substrat tar det tid for farget produktet å utvikle. Vi målt ALP aktivitet etter 15 og 30 min tid poeng som når den synlige gule fargen er observert. Med den gjeldende konsentrasjonen merke vi en økt ALP aktivitet for opp til 75 min som vist i figur 1. Etter 75 min, ble ingen økning av ALP aktiviteten observert.
Til slutt, siden ALP i S. aureus er et eksklusivt membran bundet protein7, sin aktivitet kan testes uten celle lysis. Det er fordeler til et enzym aktivitet analysen som ikke krever hele celle ødeleggelse. Spesielt kan protein isolasjon prosessen noen ganger gi en lavere aktiv enzym antall22. Men kan ikke denne protokollen brukes hvis ALP ikke sin membran bundet skjema.
Som tidligere rapportert6, er ALP aktivitet opphøyet i biofilm kultur i forhold til motparten platonisk. Eksperimentell innstillingene som brukes i denne studien kan utvides for å undersøke faktorer/forbindelser som påvirker ALP aktivitet i S. aureus biofilm. Resultatene fra disse studiene gir ytterligere innsikt i hvordan du styrer bakteriell biofilm formasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker William Rainey Harper College og University of Illinois i Chicago for anlegget å gjennomføre disse eksperimentene. Vi takker også McGraw Hill Foundation for deres generøse støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
- Coleman, J. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
- Sharma, U., Pal, D., Prasad, R.
- Mitchell, M. S., et al. High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support. Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47 (2009).
- Fawley, J., Gourlay, D. Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease. Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).
- Derman, A. I., Beckwith, J. Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies. Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).
- Danikowski, K. M., Cheng, T. Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures. Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).
- Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus. Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).
- Cheng, K. J., Costerton, J. W. Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).
- Berezhetskyy, A. L., et al. Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination. Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).
- Park, E. J., Kang, D. H. The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach. Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).
- Barber, M., Kuper, S. W. A. Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction. The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).
- Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. A new test to differentiate Serratia from Enterobacter. American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).
- Rangam, C. M., Katdare, S. M. Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity. Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O.
- Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).
- Witherow, S. A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).
- Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression. Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).
- Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats. Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).
- Farley, J. R., et al. Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay. Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. Journal of Visualized Experience. , (2011).
- Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium. Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).
