Summary
En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido
Abstract
Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.
El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.
Introduction
Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas1. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta2. Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermedades en huesos, hígado y otros tejidos/órganos cuando elevada3,4.
ALP procariota se ha detectado en una variedad de células bacterianas, incluyendo5de e. coli, S. aureus6,7 y algunas bacterias de rumen común en los suelos8. Actividad de fosfatasa alcalina bacteriana ha sido utilizado como un biosensor en la detección de pesticidas, metales pesados9 y10de contaminación bacteriana. La expresión constitutiva de ALP se ha utilizado para identificar estafilococos11 y diferenciar Serratia de Enterobacter12. Se sugirió que la producción constitutiva de ALP está correlacionado con patogenicidad en estafilococos13. Aunque ALP ha sido estudiado en diferentes configuraciones3,4, sin embargo, poco se divulga para su actividad y función en las culturas de los biofilms.
El biofilm se ha documentado para tener una diferente funcionamiento vida bacteriana en comparación con su contraparte de célula bacteriana libre-que viven14. En S. aureus, la formación de biofilm se ha identificado en una variedad de condiciones clínicas y representa la resistencia a los antibióticos y la inflamación crónica15,16. Muchas moléculas habían sido divulgadas en una matriz de la biopelícula como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, pero el mecanismo de formación de biofilm no es completamente entendido14. Para entender el papel de ALP en la formación de biopelículas, cultivadas de biopelículas de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96 y mide la actividad de fosfatasa alcalina usando para-nitrophenylphosphate (pNFF).
La molécula pNFF está lista para usar sustrato para fosfatasa alcalina y ha sido ampliamente utilizado para medir la actividad ALP6,17,18. Este ensayo colorimétrico se basa en la conversión para-nitrofenil fosfato (pNFF) de para-nitrofenol resultando en un producto coloreado a 405 nm. En comparación con otros análisis de fosfatasa alcalina convencional, tales como gel de agarosa electroforesis19, precipitación de (WGA) de la aglutinina de germen de trigo, y WGA-HPLC20, este análisis es altamente específico, sensible, fácil de reproducir y más importante, permite la alta rendimiento de procesamiento.
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Protocol
1. medio preparación
- Preparar 1 L de caldo de soja tríptica (TSB): en 1 L de agua destilada, agregar 15 g de digerido pancreático de caseína, 5 g de papaic recopilación de harina de soja, 3 g de cloruro sódico, 2,5 g de dextrosa y 2.5 g de fosfato dipotásico. Esterilizar antes de uso.
- Para Agar peptona de soja (TSA), añadir 15 g de agar en 1 L de TSB, autoclave. Luego déjelo enfriar a temperatura ambiente. A continuación, vierta en una proporción de 20 mL por placa de Petri (100 x 15 mm).
- Medio de cultivo de biofilm: Añadir 10 g de glucosa a 1 L de esterilizado TSB. Esterilizar por filtración usando un filtro de 0.2 μm.
2. formación del Biofilm de S. aureus en placa de cultivo de tejidos bien 96
Nota: El biofilm de S. aureus se cultiva como se describió anteriormente6,21.
- Inocular una colonia individual de S. aureus de TSA en 10 mL de TSB y crecer durante la noche a 37 ° C.
- Diluir la cultura durante la noche en 10 mL de TSB/glucosa (10 g/L) en una proporción de 1: 100 (v/v). Vórtice suavemente a la mezcla para una concentración constante.
- Transferir 200 mL de cultura diluida en un total de 18 pozos (más para los grupos experimentales, tal control de biofilm no para sugerir una relación con la actividad ALP6) de una 96 placa bien. Uso de tríos para cada momento: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min. Consulte el paso 3.2.
- Incube la placa bien 96 a 37 ° C durante 24 h para la formación de biofilm6,21.
- Decantar el sobrenadante por aspiración.
- Lave cada uno con 1 x solución de tampón fosfato (PBS, pH 7,4), centrifugar durante 5 min a 15.000 x g y decantar el sobrenadante por aspiración.
3. medición de la actividad ALP en Biofilm de S. aureus
Nota: Actividad de la ALP se midió como descrito6,18.
- Añadir 75 mL de tampón substrato ALP consisten pNFF disponible en el mercado para cada bien del paso 2.6 y comenzar el tiempo de grabación. Registrar cada momento por triplicado.
- Después de la incubación durante un tiempo variado: min 0 (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min respectivamente, añaden 75 μl de NaOH 5 de M para detener la reacción.
- Centrifugar la placa por 5 min a 15.000 x g.
- Transferir 100 μl de sobrenadante a un nuevo plato bien 96 para medición colorimétrica.
- Medir la absorbancia de cada bien a 405 nm usando un 96 bien placa de lector. Utilizar el tiempo de 0 min punto de pozos para control de ruido de fondo de 405 nm.
- Repetir todo el experimento en tres platos bien 96 individuales.
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Representative Results
La figura 1 muestra un resultado representativo de la actividad de la ALP de culturas de biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96. 75 μL de solución de pNFF comercialmente disponibles se añadió a cada pozo y se incubó a temperatura ambiente. Después de la incubación para diferentes tiempos (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min, respectivamente) 75 μL de NaOH M 5 fue agregado para detener la reacción. El producto entonces se midió en un lector de placa bien 96 a 405 nm. Cada momento fue repetido en tríos de un solo plato bien 96 y todo el experimento se repitió en 3 platos bien 96 individuales.
Figura 1: las culturas de biofilm de S. aureus se incubaron con substrato de pNFF de tiempo diferentes (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min y 75 min) y su actividad ALP fue medido a 405 nm. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumenta la consistencia de la absorbancia a 405 nm, probablemente eliminando cualquier posible células suspendidas durante la reacción enzimática.
Para la formación de biofilm, utilizamos 200 μL de una dilución 1: 100 (v/v) de la cultura durante la noche como reportado6,21. Esta es la dilución óptima para S. aureus formar biofilm en comparación con otras diluciones (datos no mostrados). Puesto que el objetivo de este trabajo es medir la actividad ALP en biofilm, es fundamental que nos mantiene las condiciones de cultivo óptimas biofilm. Se destacó por la elección en el uso de glucosa en 10 g/L de biofilm óptimo crecimiento6. La concentración de glucosa y el factor de dilución deben optimizarse si células bacterianas diferentes se utilizan para la formación de biopelículas.
Durante la incubación de la cultura de biofilm con substrato de pNFF, tomará tiempo para que el producto coloreado desarrollar. Medimos la actividad de la fosfatasa alcalina después de los 15 y 30 puntos de tiempo de minutos que es cuando se observa el color amarillo visible. Con la concentración actual, hemos observado una mayor actividad de la ALP para hasta 75 min como se indica en la figura 1. Después de 75 minutos, no se observó ningún aumento de la actividad de la ALP.
Finalmente, puesto que ALP en S. aureus es una exclusiva membrana proteína7del límite, su actividad puede ser probada sin lisis celular. Hay beneficios para un ensayo de actividad de la enzima que no requiere la destrucción de la célula entera. En particular, el proceso de aislamiento de proteínas puede producir a veces una enzima activa menor cantidad22. Sin embargo, este Protocolo no puede utilizarse si la ALP no es en su forma limitada de membrana.
Como previamente divulgados6, actividad de fosfatasa alcalina se eleva en biofilm cultura en comparación con su contraparte platonic. La configuración experimental utilizada en el estudio actual se puede extender para investigar factores/compuestos que afectan la actividad ALP en biofilm de S. aureus . Los resultados de estos estudios proporcionará penetración adicional en cómo controlar la formación de biopelículas bacterianas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Guillermo Rainey Harper College y la Universidad de Illinois en Chicago para la facilidad de llevar a cabo estos experimentos. También agradecemos a McGraw Hill Foundation por su generoso apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | VWR | 9002-18-0 | |
| Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
| Gluose | VWR | 50-99-7 | |
| NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
| Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
| 10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
| Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
| S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
| Tryptic Soy Agar 15 g/L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
| Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein............ 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal.........5.00 Sodium chloride.............................. 3.00 Dextrose........................................ 2.50 Dipotassium phosphate..................2.50 |
VWR | 90006-098 | |
| 96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |
References
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