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Biology

मानव aortic परिसंवहनी एडिपोज जनक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक से अधिक कोशिका वंशालयों में अंतर करने के लिए मानव परिसंवहनी वसा ऊतक से व्युत्पंन जनक कोशिकाओं की क्षमता का परीक्षण करने के लिए है । भेदभाव मध्योतक स्टेम मानव अस्थि मज्जा है, जो आदिपोसाइट, osteocyte, और chondrocyte वंश में अंतर करने के लिए जाना जाता है से व्युत्पंन कोशिकाओं की तुलना में था ।

Abstract

वसा ऊतक बहु-प्रबल मध्योतक स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध स्रोत है (एमएससी) osteogenic में अंतर करने में सक्षम, adipogenic, और chondrogenic वंशाणुओं. जनक कोशिकाओं के एडिपोजेनिक भेदभाव मोटापे के जवाब में वसा ऊतक विस्तार और शिथिलता ड्राइविंग एक प्रमुख तंत्र है । परिसंवहनी वसा ऊतक (pvat) में परिवर्तन को समझना इस प्रकार नैदानिक चयापचय रोग में प्रासंगिक है । हालांकि, पिछले अध्ययन predominately किया गया है माउस और अंय पशु मॉडलों में प्रदर्शन किया । इस प्रोटोकॉल कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार सर्जरी से गुजर रोगियों से एकत्र मानव वक्ष pvat नमूने का उपयोग करता है. आरोही महाधमनी से वसा ऊतक एकत्र किया गया था और स्ट्रोमल संवहनी अंश की explantation के लिए इस्तेमाल. हमने पहले मानव pvat में एडिपोज प्रोजेन्टर कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि की है ताकि लिपिड-युक्त एडिपोसाईट्स में अंतर करने की क्षमता हो । इस अध्ययन में, हम आगे स्ट्रोमल संवहनी अंश से कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता का विश्लेषण, संभवतः बहु शक्तिशाली जनक कोशिकाओं से युक्त. हम की तुलना में pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं को मानव अस्थि मज्जा एमएससी में भेदभाव के लिए एडिपोजेनिक, osteogenic, और chondrogenic वंशाणुओं. भेदभाव के 14 दिनों के बाद, विशिष्ट दाग adipocytes में लिपिड संचय का पता लगाने के लिए उपयोग किया गया (तेल लाल ओ), अस्थिजनक कोशिकाओं में calcific जमा (अलिज़रीन लाल), या glycosaminoglycans और chondrogenic कोशिकाओं में कोलेजन (masson trichrome). जबकि अस्थि मज्जा एमएससी कुशलतापूर्वक सभी तीन lineages में विभेदित, pvat व्युत्पंन कोशिकाओं adipogenic और chondrogenic क्षमता थी, लेकिन मजबूत osteogenic क्षमता का अभाव है ।

Introduction

वसा ऊतक बहु-प्रबल मध्योतक स्टेम कोशिकाओं का एक समृद्ध स्रोत है (एमएससी) osteogenic में फर्क करने में सक्षम, adipogenic, और chondrogenic वंश1. यह ऊतक परिपक्व adipocytes की अतिवृद्धि के माध्यम से फैलता है और निवासी एमएससी की डी नोवो भेदभाव adipocytes के लिए । परिसंवहनी वसा ऊतक (pvat) चारों ओर से घेरे रक्त वाहिकाओं और नियंत्रित करता है संवहनी समारोह2,3. मोटापा प्रेरित pvat विस्तार हृदय विकृतियों exacerbates. जबकि मानव चमड़े के नीचे आदिमुद्रा डिपो से एमएससी की multipotent क्षमता अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है4,5, कोई अध्ययन नहीं लगाया है और मानव pvat की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन-जनक कोशिकाओं व्युत्पंन, की संभावना के कारण खरीद की असावधानी । इस प्रकार, इस काम के लक्ष्य के लिए एक कार्यप्रणाली की पड़ताल और मानव महाधमनी pvat से हृदय रोग के साथ रोगियों से प्रोजेन्टर कोशिकाओं का प्रचार करने के लिए और उनके osteogenic को अंतर करने की प्रवृत्ति का परीक्षण करने के लिए है, chondrogenic, और adipogenic वंश. pvat का हमारा स्रोत कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार सर्जरी से गुजर मोटापे से ग्रस्त रोगियों की महाधमनी आरोही पर बाईपास भ्रष्टाचार के सम्मिलन की साइट से है । हौसले से अलग pvat enzymatically-dissociated है और स्ट्रोमल संवहनी अंश अलग है और विट्रो में प्रचारित, हमें सक्षम करने के लिए पहली बार मानव pvat-व्युत्पन्न जनक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का परीक्षण करने के लिए.

प्राथमिक संवर्धित मानव pvat स्ट्रोमल संवहनी अंश का उपयोग करना, हम स्टेम को प्रेरित करने के लिए बनाया गया तीन assays का परीक्षण/प्रोजेन्टर कोशिकाओं को एडिपोजेनिक, ऑस्टियोजेनिक, या chondrogenic वंश की ओर अंतर करने के लिए. हमारे पूर्व अध्ययन CD73 की आबादी की पहचान की +, CD105 +, और pdgfra + (CD140a) कोशिकाओं है कि robustly6adipocytes में अंतर कर सकते हैं, हालांकि उनकी बहुशक्ति का परीक्षण नहीं किया गया. pvat सीधे संवहनी टोन और सूजन को नियंत्रित करता है7. इस उपन्यास सेल जनसंख्या के भेदभाव क्षमता के परीक्षण के लिए तर्क संवहनी समारोह पर pvat के विशेष प्रभाव को समझने के लिए शुरू करने के लिए है, और मोटापे के दौरान pvat विस्तार के तंत्र. इस पद्धति में वसा ऊतक व्युत्पन्न के कार्यों की हमारी समझ को बढ़ाता है और हमें विभिन्न ऊतक स्रोतों से समानता और संतति कोशिकाओं के मतभेदों की पहचान करने और तुलना करने में सक्षम बनाता है । हम अलग और विभिंन वंश की ओर एमएससी फर्क और प्रक्रियाओं का अनुकूलन करने के लिए मानव pvat की व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए स्थापित और सत्यापित दृष्टिकोण पर निर्माण-जनक कोशिकाओं व्युत्पंन । इन तकनीकों स्टेम और जनक सेल अनुसंधान और वसा ऊतक विकास के क्षेत्रों में व्यापक आवेदन किया है ।

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Protocol

इस अध्ययन में मानव ऊतकों का उपयोग मूल्यांकन किया गया था और मेन मेडिकल सेंटर के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित, और सभी कर्मियों को प्रयोग करने से पहले उपयुक्त प्रशिक्षण प्राप्त.

1. तैयारी

  1. वियोजन बफर को पुनर्गठन कर ५० मिलीग्राम एनिमल-फ्री कोलेजिनस/दिससे ब्लेंड I सॉल्यूशन विथ 1 मल ऑफ़ नैनोप्योर एच2ओ. 1 मिलीग्राम/एमएल कार्य समाधान तैयार करके 1% w/v bsa युक्त उच्च ग्लूकोज dmem के ४९ एमएल को पुनर्गठित कोलेजिनस/ दिसशे समाधान. स्टोर 5 मिलीलीटर काम कर रहे हैं-20 डिग्री सेल्सियस और गर्म करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस का उपयोग करने से पहले एक पानी स्नान का उपयोग कर ।
  2. 1 मिलीलीटर 100x एंटीबायोटिक/एंटीमाइकोटिक समाधान (अंतिम एकाग्रता २०० इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, २०० इकाइयों/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और ०.५ μg/एमएल फंगिज़ोन) को एचबीएसएस के ४९ एमएल और बर्फ पर स्टोर करके एंटीबायोटिक समाधान करें ।
  3. जिलेटिन समाधान तैयार करें (०.२% w/v) गोजातीय त्वचा से २०० मिलीग्राम जिलेटिन के १०० एमएल में नेनोप्योर एच2ओ को भंग करके ऑटोक्लेव 20 मिनट के लिए समाधान और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  4. pvat वृद्धि मीडिया की ५०० mL तैयार करें: ग्लूटामाइन अनुपूरक के साथ उच्च ग्लूकोज dmem/F12, सोडियम pyruvate, और सोडियम बाइकॉर्बोनेट, 10% fbs और १०० μg/एमएल एंटीमाइक्रोबियल एजेंट के साथ पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  5. तैयार ५० मिलीलीटर adipogenic प्रेरण मीडिया: ४०.८ मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज dmem, ७.५ मिलीलीटर pvat वृद्धि मीडिया के साथ पूरक, ५०० μl के 100x एंटीबायोटिक/antimycotic समाधान (अंतिम एकाग्रता है १०० इकाइयों/एमएल penicillin, १०० इकाइयों/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन और ०.२५ μg/एमएल fungizone), ०.५ एमएम ibmx (५०० एमएम स्टॉक इन ०.१ एम नाओः), 1 μm डेक्सामेथासोन (1 मिमी स्टॉक इथेनॉल में), 5 μm रोसिग्लिटाज़ोन (5 मिमी स्टॉक dmso में), ३३ μm बायोटिन (dmso में ६६ मिमी स्टॉक), १०० एनएम इंसुलिन (२०० μm स्टॉक में ०.१% एसिटिक एसिड), और 20 μm pantothenic एसिड (१०० मिमी स्टॉक एच2 में O) ।
  6. एडीपोजेनिक वंश के लिए नियंत्रण प्रेरण मीडिया के ५० मिलीलीटर तैयार करें: ४०.८ मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज dmem ७.५ मिलीलीटर pvat विकास मीडिया और पेन-स्ट्रेप (100x स्टॉक) के ५०० μl के साथ पूरक है ।
  7. ५० मिलीलीटर एडिपोजेनिक रखरखाव मीडिया तैयार करें: ४१.५ मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज dmem के साथ ७.५ मिलीलीटर pvat वृद्धि मीडिया से पूरक चरण १.३, ५०० μl कलम-strep (100x स्टॉक), 1 μm डेक्समेतएसॉनी (etoh में 1 मिमी स्टॉक), ३३ μm बायोटिन (६६ मिमी स्टॉक में dmso), १०० एनएम इंसुलिन (२०० μm स्टॉक में ०.१% ac टिक एसिड), और 20 μm पैंटोथेनिक एसिड (एच2ओ में १०० मिमी स्टॉक) ।
  8. osteogenic और chondrogenic वंश के लिए विकास मीडिया की ५०० मिलीलीटर तैयार करें: उच्च ग्लूकोज αmem 10% fbs, 1x glutamine पूरक के साथ पूरक ( सामग्री की तालिकादेखें), और कलम की 5 मिलीलीटर-strep (100x स्टॉक) ।
  9. osteogenic वंश के लिए प्रेरण मीडिया की ५० मिलीलीटर तैयार: अस्थि मज्जा एमएससी विकास मीडिया के ५० मिलीलीटर 10 एनएम डेक्समेतएसॉनी और 10 मिमी β-ग्लिसोफॉस्फेट के साथ पूरक ।
  10. chondrogenic वंश के लिए प्रेरण मीडिया की ५० मिलीलीटर तैयार: अस्थि मज्जा एमएससी विकास मीडिया की ५० एमएल १०० एनएम dexamethasone के साथ पूरक, ५० μg/एमएल सोडियम एस्कॉर्बेट-2-फॉस्फेट, और 10 एनजी/ osteogenic और chondrogenic शर्तों के लिए, बेसल बोन मैरो एमएससी विकास मीडिया गैर प्रेरण मीडिया के रूप में काम करेंगे ।

2. प्रोटोकॉल 1: stromal संवहनी अंश से मानव pvat कोशिकाओं संस्कृति

नोट: pvat कोरोनरी धमनी बाईपास भ्रष्टाचार प्रक्रियाओं से गुजर रहे एनेस्थेटाइज्ड रोगियों के आरोही महाधमनी पर भ्रष्टाचार सम्मिलन की साइट से उच्छेदन है । महाधमनी pvat को 15 मिलीलीटर शंकु में रखा जाता है जिसमें 10 मिलीलीटर आइस कोल्ड उच्च ग्लूकोज dmem F12 होता है और ऑपरेटिंग कमरे से लकीर के 2 ज के भीतर प्रयोगशाला में स्थानांतरित किया जाता है । महाधमनी pvat बाईपास प्रक्रिया के दौरान ऊतक खारिज कर दिया है और मेन मेडिकल सेंटर की आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा गैर मानव विषयों अनुसंधान के रूप में समझा गया है.

  1. इस प्रोटोकॉल के लिए है एक ~ ५०० मानव pvat के मिलीग्राम टुकड़ा (लगभग 3 x 1 x ०.५ सेमी3). dmem से एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए ताजा मानव pvat हस्तांतरण 25 मिलीलीटर एंटीबायोटिक समाधान युक्त । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रॉकिंग के साथ सेते हैं । जबकि pvat एंटीबायोटिक समाधान में है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर वियोजन बफर का एक aliquot गल जाता है ।
  2. जोड़ें ५० μl के 100x एंटीबायोटिक/antimycotic समाधान करने के लिए 5 मिलीलीटर वियोजन बफर और एक ०.२२ μm सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर जीवाणुरहित । एक 24-अच्छी तरह से थाली के 1 अच्छी तरह से जिलेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । एक स्तरीय प्रवाह हुड में, बाँझ और कैंची का उपयोग करने के लिए एक बाँझ पेट्री डिश के लिए एंटीबायोटिक समाधान से pvat हस्तांतरण. ऊतक के लिए पूर्व warmed वियोजन बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ें और पतले एक घोल में पूरे ऊतक भरती (कोई टुकड़े से बड़ा ~ 2 एक्स 2 मिमी2) बाँझ संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग कर.
  3. 1 मिलीलीटर घोल को 4 मिलीलीटर वियोजन बफर में स्थानांतरित करें और ट्यूब को एक पूर्व-गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस कक्षीय शेखर में 1 एच के लिए २०० आरपीएम पर इंसेबेट करें । 1 एच के बाद, कोई दिखाई ऊतक टुकड़े मौजूद नहीं होगा, और समाधान एक बादल सेल निलंबन के रूप में दिखाई देगा ।
  4. एक ५० मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के ऊपर सेट एक ७० μm सेल छलनी के माध्यम से समाधान फ़िल्टर । संभव के रूप में कई कोशिकाओं के रूप में कब्जा करने के लिए एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर एंटीबायोटिक समाधान के साथ छलनी कुल्ला । छलनी को दबाओ मत ।
  5. एक झूलते बाल्टी अपकेंद्रिप में ३०० एक्स जी पर 12 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली ।
    नोट: अपकेंद्रीकरण के बाद, ट्यूब को एडिपोसाइट्स की फैटी टॉप लेयर, एक इंटरफेज और एक गोली में अलग कर दिया जाएगा । गोली स्ट्रोमल संवहनी अंश endothelial कोशिकाओं युक्त है, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, रक्त कोशिकाओं, और जनक कोशिकाओं.
  6. ३०० एक्स जीपर 5 मिनट के लिए एचबीएसएस और अपकेंद्रिप के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend । hbss में कुल 2 बहाकर के लिए इस चरण को दोहराएं । अंतिम धोने के बाद, लाल रक्त कोशिकाओं को नहीं लाइसे । कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बफ़र्स और ऊष्मायन बार के साथ दोहराया प्रयास के लिए जनक सेल लगाव और व्यवहार्यता में कटौती चिह्नित करने के लिए नेतृत्व किया है ।
  7. 24-अच्छी तरह से थाली से aspirate जिलेटिन । धीरे से अच्छी तरह से धोने hbss के साथ 1x अनबाउंड जिलेटिन को दूर करने के लिए ।
  8. वृद्धि मीडिया और बीज की 1 मिलीलीटर में बरकरार लाल रक्त कोशिकाओं के साथ resuspend स्ट्रोमल संवहनी अंश गोली जिलेटिन-लेपित अच्छी तरह से पर । मानव FGF2 जोड़ें (pbs में resuspended ०.०१% bsa w के साथ पूरक/v) संस्कृति माध्यम में 25 एनजी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए । 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए सेते ।
  9. अगले दिन, विकास मीडिया को हटाने और hbss के साथ वेल्स 5x धोने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं और मृत कोशिकाओं को हटा दें । 25 एनजी/एमएल FGF2 के साथ पूरक ताजा विकास मीडिया के 1 मिलीलीटर में जोड़ें ।
  10. हर बार 25 एनजी/एमएल ताजा FGF2 के साथ पूरक करने के लिए सुनिश्चित कर रही है, प्रत्येक ४८ एच मीडिया बदलें ।
  11. कोशिकाओं को आम तौर पर १००% संगम तक पहुंचने 7-10 दिन के बाद explant; पारित कोशिकाओं तो:
    1. महाप्राण विकास मीडिया और धो monolayer 2x में 1 मिलीलीटर hbss. कुओं से सभी hbss महाप्राण और सेल वियोजन समाधान की कुछ बूंदें जोड़ें ।
    2. नल और थाली कई बार भंवर और 5% सह2 के लिए 5-7 मिनट के लिए कोशिकाओं को उठाने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं । अलग कोशिकाओं को ताजा संस्कृति मध्यम के ~ 1 मिलीलीटर जोड़ें और एक 24-अच्छी तरह से थाली के 2 कुओं को वितरित ५०० μl, प्रत्येक ५०० μl विकास मीडिया और 25 एनजी FGF2 युक्त ।
  12. पिछले चरण में दर्शाई गई के रूप में मानव pvat-व्युत्पन्न कक्षों का विस्तार करने के लिए जारी रखें । प्रत्येक मार्ग एक 1:2 विभाजन से अधिक नहीं होना चाहिए । कोशिकाओं को विभेदन assays के लिए आवंटित करने से पहले 5-7 बार passaged हैं ।

3. प्रोटोकॉल 2: संस्कृति मानव अस्थि मज्जा एमएससी कालोनियों

नोट: मानव अस्थि मज्जा एमएससी के रूप में अलग कर रहे है8 वर्णित और फ्रीज मीडिया में जल्दी पारित जमे हुए शेयरों के रूप में संग्रहीत (७०% fbs 20% बेसल dmem और 10% dmso) में ~१००,००० सेल/

  1. तेजी से एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और थाली के एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी संस्कृति प्लेट एमएससी विकास मीडिया के 3 मिलीलीटर युक्त और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर रात भर सेते में से एक के लिए अस्थि मज्जा एमएससी की एक शीशी गल ।
  2. अगले दिन, महाप्राण एमएससी संस्कृति मीडिया और hbss के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं 3x धोने । १००% संगम पर, महाप्राण विकास मीडिया और hbss के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं 3x धोने । जोड़ें ५०० μl/अच्छी तरह से सेल टुकड़ी समाधान और 5 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2 पर सेते । सभी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना सुनिश्चित करने के लिए थाली ठोकर और समान रूप से 2 मिलीलीटर एमएससी विकास मीडिया युक्त एक 6-अच्छी थाली के 2 कुओं को सामग्री वितरित कर रहे हैं ।
  3. विस्तृत मानव अस्थि मज्जा और pvat-व्युत्पन्न एमएससी समानांतर में लगभग के लिए 5 – 7 मार्ग या जब तक कि परीक्षण के लिए पर्याप्त मात्रा प्राप्त किया गया है.

4. प्रोटोकॉल 3: प्लेट और आदिपोजनिक, osteogenic, और chondrogenic वंश प्रेरित

  1. प्लेट की उचित संख्या अस्थि मज्जा और pvat-एक 12-अच्छी तरह से थाली और उचित प्रतिकृति के प्रति अच्छी तरह से प्राप्त कोशिकाओं प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए । adipogenic और osteogenic शर्तों के लिए, ~ 200000 – 225000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से की जरूरत है, chondrogenic शर्तों के लिए, 150000 – 175000 कोशिकाओं/
    नोट: हम n = 3 की एक ंयूनतम भाग गया 2 स्वतंत्र रन (N = 6 कुल प्रतिकृति) की कुल के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक वंश के लिए नियंत्रण और प्रेरित शर्तों के लिए कुओं को दोहराने ।
  2. दोनों मानव pvat जनक सेल जनसंख्या और मानव अस्थि मज्जा एमएससी जनसंख्या ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेल टुकड़ी समाधान और ऊष्मायन का उपयोग कर और 5% सह2 के लिए 5 मिनट के लिए अलग से कोशिकाओं disassociate 15 मिलीलीटर शंकु की शकल में पूल आबादी । शीशी स्पिन 7 मिनट के लिए ५०० एक्स जी पर नीचे की कोशिकाओं को गोली । 1 मिलीलीटर पीबीएस में resuspend और सेल संख्या का अनुमान लगाने के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें ।
  3. थाली 12 में कोशिकाओं-अच्छी तरह से व्यंजन के रूप में कदम ४.१ में संकेत दिया । प्रेरित और गैर प्रेरित एडिपोजेनिक, osteogenic, और शर्तों ताकि गैर प्रेरित हालत प्रेरित हालत की सतत संस्कृति को बाधित किए बिना एक पहले समय बिंदु पर तय किया जा सकता है के लिए अलग व्यंजन प्रदान करते हैं ।
  4. प्रेरित हालत के एक अच्छी तरह से करने के लिए adipogenic और osteogenic प्रेरण मीडिया के १.५ मिलीलीटर जोड़ें । गैर-प्रेरित स्थिति के प्रत्येक कुआं में १.५ मिलीलीटर एडिपोजेनिक और ऑस्टियोजेनिक नॉन-इंडक्शन मीडिया जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर एडिपोजेनिक और ऑस्टियोजेनिक प्रेरित और गैर-प्रेरित सेल आबादी की ऊष्मायन शुरू करें ।
  5. ५०० एक्स जीमें 7 मिनट के लिए मानव pvat जनक कोशिकाओं और मानव अस्थि मज्जा mscs की शेष मात्रा नीचे स्पिन
  6. शेष अस्थि मज्जा और pvat-व्युत्पन्न सेल छर्रों resuspend करने के लिए आवश्यक मात्रा का निर्धारण १००,००० कोशिकाओं का घनत्व प्राप्त करने के लिए/10 μl (106 कोशिकाओं/एमएल) । chondrogenic वंश प्रेरण के लिए एमएससी विकास मीडिया की गणना की मात्रा में resuspend छर्रों । एक समरूप वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं की मात्रा को धीरे से ऊपर और नीचे ले जाएं ।
  7. पिपेट एक 10 μl छोटी बूंद केंद्रित सेल समाधान के केंद्र में एक अच्छी तरह से १००,००० कोशिकाओं के एक माइक्रोमास के रूप में । वाष्पीकरण को रोकने के लिए आसन्न कुआं में 1 मिलीलीटर एच2ओ रखें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए माइक्रोमास संस्कृतियों सेते और 5% सह2 के लिए माइक्रोमास सकल अनुमति देते हैं ।
  8. 2 घंटे के बाद, ध्यान से chondrogenic भेदभाव मीडिया जोड़ 10 एनजी/एमएल मानव tgfβ1 प्रेरित-हालत कुओं में से प्रत्येक के साथ नुकीला । गैर-प्रेरण मीडिया (बोन मैरो एमएससी ग्रोथ मीडिया) के नॉन-प्रेरित कंडीशन वेल्स में १.५ मिलीलीटर को सावधानीपूर्वक जोड़ें । प्रेरित और गैर-प्रेरित स्थितियों के लिए अलग 12-अच्छी प्लेटों का उपयोग करें ताकि एक पूर्व समय बिंदु पर गैर-प्रेरित स्थिति को ठीक किया जा सके ।

5. प्रोटोकॉल 4:14 दिनों के लिए कल्चर एडिपोजेनिक, ऑस्टियोजेनिक, और chondrogenic वंश

  1. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2, ताज़ा मीडिया हर 2 दिनों में 4 दिनों के लिए सभी तीन वंश के प्रेरित और गैर प्रेरित शर्तों संस्कृति । 4 दिन पर, प्रेरण मीडिया से प्रेरित adipogenic वंश हालत परख के शेष के लिए रखरखाव मीडिया के लिए बदल जाते हैं ।
  2. 12 h के लिए 10% formalin में गैर-प्रेरित शर्तों के सभी ठीक करें formalin के निपटान और pbs में सभी निश्चित कुओं 2x धोने formalin के सभी निशान को दूर करने के लिए । प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में प्लेट की दुकान ।
  3. कुल 14 दिनों के लिए प्रेरित शर्तों संस्कृति, ताज़ा मीडिया हर 2 दिन । chondrogenic प्रेरण मीडिया के प्रत्येक ताज़ा के साथ 10 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता में ताजा tgfβ1 जोड़ें । adipogenic रखरखाव मीडिया और osteogenic वंश प्रेरण मीडिया में adipogenic वंश संस्कृति को जारी रखने, हर 2 दिन ताज़ा । 14 दिन में, धुंधला करने के लिए 10% formalin में 12 घंटे के लिए सभी प्रेरित शर्तों को ठीक करें ।
  4. scrape या embedding के लिए एक कैसेट में प्रेरित chondrogenic हालत में माइक्रोमास डालना । 5 मिनट के लिए तेजी से केंद्रित शराब स्नान की एक श्रृंखला में माइक्रोमास dehydrate, ७०% पर शुरुआत है, तो ८०%, ९५% में दो बार, और दो बार पूर्ण शराब में अधिक है । एक dealcoholization एजेंट में कैसेट प्लेस और फिर अंत में परिच्छेदन और धुंधला करने के लिए पैराफिन मोम में कैसेट एंबेड ।

6. प्रोटोकॉल 5: तेल लाल हे के साथ धुंधला एडिपोजेनिक हालत

  1. तेल लाल ओ के ३५० मिलीग्राम के १०० एमएल में १००% isopropanol को भंग करके ऑयल रेड ओ स्टॉक समाधान तैयार करें । एक ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से एक हलचल बार और वैक्यूम के साथ 2 एच के लिए मिक्स । स्टॉक समाधान 1 वर्ष के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. 2 भागों के लिए 3 भागों स्टॉक समाधान मिश्रण से तेल लाल ओ काम समाधान तैयार2 0 (उदाहरण के लिए ६० मिलीलीटर स्टॉक समाधान के ४० एमएल डीह20) । काम समाधान में तेल लाल ओ की अंतिम एकाग्रता २.१ मिलीग्राम/एमएल है ।
  3. कुओं से सभी तरल पदार्थ निकालें । ६०% isopropanol के साथ एक अच्छी तरह से 2x धो, पूरी तरह से कुओं के किनारों से सभी पानी को दूर करने के लिए सुनिश्चित कर रहा है । महाप्राण ६०% isopropanol और जल्दी से नीचे कवर करने के लिए कुओं की दीवारों को छूने के बिना तेल लाल ओ काम समाधान जोड़ें । यह महत्वपूर्ण है कि यह कदम जल्दी किया जाए तो कुओं को सूखा नहीं पड़ता.
  4. एक बार तेल लाल ओ जोड़ा जाता है, कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं ।
  5. सभी तेल लाल ओ निकालें और तुरंत आसुत एच2 ओ जोड़ने के लिए 10 मीटर के लिए आसुत एच2ओ के साथ अनबाउंड तेल लाल हे हटाने शुरू करने के लिए । 10 मिनट के बाद, महाप्राण तेल लाल हे और वाशिंग प्रक्रिया 3x दोहराएँ ।
  6. एक बार धोने पूरा हो गया है, pbs जोड़ें और कोशिकाओं छवि । 4 डिग्री सेल्सियस पर pbs में दाग कोशिकाओं की दुकान ।

7. प्रोटोकॉल 6: अलिज़ारन लाल के साथ अस्थिजनक स्थिति धुंधला करना

  1. एक अच्छी तरह से सभी तरल पदार्थ निकालें । एक अच्छी तरह से (एक 12-अच्छी थाली के लिए प्रति अच्छी तरह से १.५ मिलीलीटर) के लिए 2% alizarin लाल दाग समाधान की उचित मात्रा में जोड़ें और धीरे थाली पक्ष को झुकाव जब तक समाधान पूरी तरह से नीचे अच्छी तरह से कवर ।
  2. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते । अल्जरिन को कुएं से लाल निकाल दें । धीरे से एक अच्छी तरह से कुल्ला के साथ चार बार आसुत एच2ओ, कैल्शियम क्रिस्टल को उखाड़ नहीं करने के लिए सावधानी बरत रही है. सूखने दें ।

8. प्रोटोकॉल 7: है masson trichrome के साथ chondrogenic हालत धुंधला

  1. 30 मिनट के लिए एक ६० ° c सूखी ओवन में स्लाइड सेंकना. प्रस्थान और हाइड्रेट पानी आसुत करने के लिए वर्गों ।
    1. rehydrate करने के लिए, तीन 5 मिनट में स्लाइड जगह dealcoholization एजेंटों के साथ, के रूप में शराब सांद्रता उतरते में 5 मिनट इनसेबेशंस के बाद: दो १००% (निरपेक्ष इथेनॉल), दो पर ९५% शराब, दो पर ८०%, दो में ७०%, और अंत में दो आसुत में एच2ओ. स्लाइड एच2ओ में रह सकते हैं जबकि bouin के फिक्टिव तैयार किया जाता है ।
  2. प्लेस ४० एक प्लास्टिक microwavable coplin जार में bouin फिक्टिव की मिलीलीटर (खुला) । उच्च पर माइक्रोवेव ५५ डिग्री सेल्सियस के लिए अस्थायी लाने के लिए । 20 मिनट के लिए गर्म समाधान में जगह स्लाइड; आने वाले काउंटर पर खड़े होने दें । 10 मिनट के लिए या पीले रंग के सभी गायब हो जाता है जब तक नल का पानी चलाने में धोने ।
  3. 10 मिनट के लिए weigert के hematoxylin में दाग वर्गों 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धोने ।
  4. 10 मिनट के लिए बेब्रीच के स्कार्लेट एसिड फ्यूसिन समाधान में अनुभाग दाग । नल के पानी में 3x 10 मिनट धो लें । 10 मिनट के लिए फ़ॉस्फोटस्टिक/phosphomolybdic एसिड समाधान में मोर्डेंट स्लाइड । कुल्ला न करें ।
  5. स्लाइड सीधे ऐनिलीन नीले समाधान में 10 मिनट के लिए जगह नल के पानी में दो संक्षिप्त dips के साथ कुल्ला ।
  6. स्लाइड् स को 1% एसिटिक एसिड सॉल्यूशन में 3 से 5 मिनट के लिए रखें । 1 मिनट के लिए नल के पानी में धो लें । 1 मिनट के लिए ९५% इथेनॉल में रखें । dehydrate के रूप में संकेत के रूप में ५.४ कदम और सिंथेटिक राल के साथ माउंट ।

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Representative Results

मानव pvat से स्ट्रोमल संवहनी अंश के अलगाव

चित्र 1a उस संरचनात्मक क्षेत्र का योजनाबद्ध रूप से पता चलता है, जहाँ पवत आरोही एओर्टा को अधिवर्ती किया गया था । हम पहले से जो इन नमूनों6व्युत्पंन थे कोरोनरी धमनी बाईपास ग्राफ्टिंग से गुजर रोगी आबादी का वर्णन किया । चित्र 1b सर्जरी के बाद प्राप्त मानव pvat का एक उदाहरण दिखाता है । चित्रा 1 सी है masson trichrome दाग के साथ दाग एक प्रतिनिधि pvat ऊतक अनुभाग से पता चलता है । चित्रा 1d भेदभाव करने से पहले विस्तार चरण के दौरान pvat-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं की आबादी दिखा एक चरण अनुबंध सूक्ष्मालेख है. कोशिकाओं का विस्तार किया जा सकता है और भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए । कोशिकाओं को आम तौर पर एक घनत्व में जमे हुए हैं २.५ एक्स 105 कोशिकाओं के शामिल एक मीडिया में ७०% fbs, 20% बेसल (एंटीबायोटिक मुक्त) dmem F12 और 10% dmso में एक isopropanol cryochamber में-८० ° c के लिए 24 ज और तरल चरण के लिए ले जाया गया एक तरल N2 फ्रीजर के लिए लंबी टी एर्म भंडारण ।

एडिपोजेनिक विभेद

अध्ययन मानव अस्थि मज्जा व्युत्पन्न एमएससी के साथ समानांतर में किया गया (चित्रा 2a, बी) और pvat व्युत्पन्न जनक कोशिकाओं (चित्रा 2a, डी). चित्रा 2 के बाएं पैनलों गैर प्रेरित हालत है, जहां कोई लिपिड संचय स्पष्ट दिखाई है । सही पैनलों कोशिकाओं को दिखाने के एडिपोसाइट भेदभाव और तेल लाल ओ के साथ तटस्थ लिपिड के धुंधला करने के बाद । जबकि मानव महाधमनी pvat-व्युत्पंन कोशिकाओं में भेदभाव की डिग्री और अधिक मजबूत है, दोनों मानव कोशिका सूत्रों के लिए adipogenic वंश की दिशा में अंतर करने की क्षमता का प्रदर्शन किया ।

अस्थिजनक अवकरण

osteogenic भेदभाव प्रोटोकॉल मानव अस्थि मज्जा के लिए इस्तेमाल किया गया था-व्युत्पन्न एमएससी (चित्रा 3a– C) और pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं (चित्रा 3d– F). गैर प्रेरित कोशिकाओं (चित्रा 3a, डी) एलिज़ारिन लाल के साथ दाग नहीं था । osteogenic भेदभाव प्रोटोकॉल के बाद, मानव एमएससी केल्सीकृत पिंड विकसित किया है कि अल्जरिन लाल के साथ दाग (चित्रा 3b– C), जबकि मानव महाधमनी pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं नहीं था (चित्रा 3b– F). इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि मानव pvat के स्ट्रोमल संवहनी अंश से कोशिकाओं की तैयारी osteogenesis से गुजरना करने की क्षमता के साथ progenitors की महत्वपूर्ण संख्या की कमी है । अध्ययन और भेदभाव के समय पाठ्यक्रम पर निर्भर करता है, यह आणविक मार्करों का पता लगाने के साथ मानक दाग का पालन करें कि osteogenic वंश प्रतिबद्धता को परिभाषित करने के लिए सलाह दी जाती है (जैसे RUNX2, osterix, alkaline फॉस्फोटेस) या osteobwas (osteपोंटिन, osteocalcin, alkaline फॉस्फोटेस, BAP1) ।

कोन्ड्रोजेनिक विभेद

दोनों मानव अस्थि मज्जा एमएससी से व्युत्पंन कोशिकाओं (चित्रा 4a) और मानव pvat (चित्रा 4a) प्रदर्शन chondrogenic भेदभाव की विशेषता विशेषताएं, माइक्रोमास में प्रचुर मात्रा में कोलेजन संचय के साथ । मानव अस्थि मज्जा एमएससी और महाधमनी pvat से गठित सूक्ष्मगधों-व्युत्पन्न कोशिकाओं भी alcian ब्लू धुंधला द्वारा संकेत के रूप में glycosaminoglycans (नीला) के प्रचुर मात्रा में संचय का प्रदर्शन किया (चित्रा 4c– डी, क्रमशः). morphologically, संरचनाओं के समान खामियां कोलेजन जमाव से आसपास के cavities में बैठे कोशिकाओं के साथ का पता लगाया गया (चित्रा 4, तीर). अध्ययन और भेदभाव के समय पाठ्यक्रम पर निर्भर करता है, विशिष्ट chondrogenic मार्करों का पता लगाने (aggrecan, कोलेजन प्रकार द्वितीय, osteonectin, Sox9) उपयोगी है ।

Figure 1
चित्रा 1: मानव pvat की रूपात्मक विशेषताओं. (क) मानव महाधमनी (लाल) के आसपास pvat (पीला) के साथ कार्टून चित्रण । तीर आरोही aorta इंगित करता है । (ख) वियोजन से पहले dmem में एक cabg रोगी से मानव महाधमनी pvat का एक ४८० मिलीग्राम टुकड़ा. (ग) मैसन का त्रिक्रोम अभिरंजक formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड मानव pvat (गहरा भूरा/काला = नाभिका, नीला/बैंगनी = संयोजी ऊतक, गुलाबी = कोशिका द्रव्य; नोट, आरबीसी लाल-गुलाबी दिखाई देते हैं । (घ) संस्कृति में 7 दिनों में explanted pvat-स्ट्रोमल कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एडिपोजेनिक भेदभाव । (क) गैर-प्रेरित स्थिति में मानव अस्थि मज्जा एमएससी के चरण माइक्रोस्कोपी भेदभाव का कोई सबूत नहीं दिखाता है । (ख) प्रेरित adipogenic हालत में मानव अस्थि मज्जा एमएससी के चरण माइक्रोस्कोपी कुछ भेदभाव और तटस्थ लिपिड के स्थिरीकरण से पता चलता है, तेल लाल के साथ दाग 14 दिनों के बाद हे. (ग) मानव महाधमनी pvat के चरण माइक्रोस्कोपी-गैर प्रेरित adipogenic स्थिति में व्युत्पन्न कोशिकाओं भेदभाव का कोई सबूत नहीं दिखाता है. (घ) मानव महाधमनी pvat के चरण माइक्रोस्कोपी-प्रेरित adipogenic हालत में व्युत्पन्न कोशिकाओं मजबूत भेदभाव और तटस्थ लिपिड का स्थिरीकरण, तेल लाल के साथ दाग से पता चलता है 14 दिनों के बाद हे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अस्थिजनित विभेद। (क) गैर-प्रेरित osteogenic हालत में मानव अस्थि मज्जा एमएससी के चरण माइक्रोस्कोपी एक osteogenic वंश की ओर भेदभाव का कोई सबूत नहीं दिखाता है । (ख) संस्कृति में 14 दिनों के बाद प्रेरित हालत में मानव अस्थि मज्जा एमएससी के चरण माइक्रोस्कोपी भेदभाव और कैल्शियम जमा के गठन के सबूत से पता चलता है ऐलिज़ारन लाल (तीर) के साथ दाग । (ग) अल्जरिन लाल के साथ धुंधला करने के बाद प्रेरित osteogenic हालत में मानव अस्थि मज्जा एमएससी से युक्त की एक छवि प्रचुर मात्रा में कैल्शियम जमाव इंगित करता है, एक osteogenic वंश की ओर सफल भेदभाव का सुझाव (तीर, कैल्शियम जमाव). (घ) एओर्टिक मानव pvat के चरण माइक्रोस्कोपी-गैर-प्रेरित osteogenic हालत में व्युत्पंन कोशिकाओं एक osteogenic वंश की ओर भेदभाव का कोई संकेत दर्शाती है । (ई) संस्कृति में 14 दिनों के बाद प्रेरित osteogenic हालत में महाधमनी मानव pvat व्युत्पंन कोशिकाओं के चरण माइक्रोस्कोपी एक osteogenic वंश या कैल्शियम के जमाव की ओर भेदभाव का कोई सबूत नहीं पता चलता है जब alizarin लाल के साथ दाग, केवल गैर विशिष्ट धुंधला । (च) अल्ज़ारिन लाल के साथ धुंधला होने के बाद प्रेरित ऑस्टियोजेनिक स्थिति में मानव महाधमनी pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं को अच्छी तरह से युक्त की एक छवि केवल गैर विशिष्ट धुंधला से पता चलता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: chondrogenic भेदभाव । (क, ख) मानव अस्थि मज्जा एमएससी (ए) या मानव महाधमनी pvat जनक कोशिकाओं द्वारा गठित माइक्रोस्कोपी के एक वर्ग के प्रकाश माइक्रोस्कोपी (ख) संस्कृति में 14 दिनों के बाद प्रेरित chondrogenic हालत में और बाद में masson trichrome, जो महत्वपूर्ण इंगित करता है के साथ दाग कोलेजन का जमाव (नीला) और एक chondrogenic वंश की ओर सफल भेदभाव पता चलता है । (सी, डी) मानव अस्थि मज्जा एमएससी (सी) या मानव महाधमनी pvat जनक कोशिकाओं द्वारा गठित माइक्रोस्कोपी के एक वर्ग के प्रकाश माइक्रोस्कोपी (डी) संस्कृति में 14 दिनों के बाद प्रेरित chondrogenic हालत में और बाद में alcian नीले रंग के साथ दाग, जो अंलीय के जमाव को इंगित करता है प्रोटीओग्लिकंस (जैसे ग्लाइकोसैनिनोग्लिकॉन्स) आमतौर पर कार्टिलेज में पाए जाते हैं । counterदाग़, परमाणु तेजी से लाल; तीर, lacunae की तरह संरचनाओं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

विभिन्न डिपो से आडिपोज जनक कोशिकाओं phenotype और भिंनता संभावित9में व्यापक रूप से बदलती हैं । culturing pvat-एक एकल रोगी दाता से व्युत्पंन progenitors एक साथ तीन अलग वंश, adipogenic, osteogenic, और chondrogenic नीचे प्रेरण में, इस उपंयास की pluripotent क्षमता की एक अच्छी तरह से नियंत्रित जांच के लिए अनुमति देता है जनक कोशिकाओं की जनसंख्या । इस रिपोर्ट में वर्णित कार्यप्रणाली मानव pvat से जनक कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का परीक्षण करने के लिए और pvat विकृतियों और संवहनी टोन को विनियमित करने में उनके समारोह को समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस तकनीक के कुछ लाभ अपनी सादगी और प्राथमिक मानव ऊतक के कोरोनरी धमनी बाईपास रोगियों से उपयोग कर रहे हैं, इस प्रकार गंभीर हृदय रोग के साथ रोगियों से pvat जनक सेल समारोह की जांच को सक्षम करने. हालांकि, explants से एक ५०० ऊतक के मिलीग्राम टुकड़ा आम तौर पर < 1000 आसंन कोशिकाओं उपज और इस प्रकार की आवश्यकता 5-7 मार्ग पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, इस दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण चेतावनी पर प्रकाश डाला । त्रि-वंश विभेद प्रयोगों की सफलता के लिए महत्वपूर्ण, दाता pvat से प्रारंभिक कोशिका अन्वेषण की गुणवत्ता है । यह अच्छी तरह से एंजाइमी वियोजन करने से पहले ऊतक भरती करने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, अंय explant प्रोटोकॉल के विपरीत, हम सेल संख्या, व्यवहार्यता और समग्र गुणवत्ता का एक नाटकीय नुकसान पाया जब लाल रक्त कोशिका lysis बफर चढ़ाना से पहले इस्तेमाल किया गया था । इसके बजाय, यह दृढ़ता से पूरी स्ट्रोमल संवहनी अंश (लाल रक्त कोशिकाओं सहित) थाली करने के लिए सिफारिश की है. 24 एच के बाद, आसंन कोशिकाओं को संलग्न किया जाएगा और गैर lysed लाल रक्त कोशिकाओं hbss के साथ दोहराया बहाकर के माध्यम से हटाया जा सकता है । pvat-व्युत्पन्न स्ट्रोमल कोशिकाओं की passaging 1:2 विभाजन से अधिक नहीं होना चाहिए. हम वृद्धि दर में कमी देखी गई जब कोशिकाओं 1:3 या अधिक विभाजित किया गया ।

त्रिविम विभेद परख का सबसे कठिन घटक chondrogenic हालत है, क्योंकि यह एक "माइक्रोमास" और हिस्टोलॉजिकल embedding और sectioning में कोशिकाओं की एक कम आम विधि की आवश्यकता है । देखभाल ठीक से १००,००० कोशिकाओं के 10 μl छोटी बूंद थाली और संस्कृति माध्यम जोड़ने पर जन परेशान नहीं करने के लिए लिया जाना चाहिए । हम assays के बीच भिन्नता के रूप में पाया कि क्या या नहीं माइक्रोमास थाली करने के लिए पालन किया गया या मध्यम में निलंबित कर दिया. यहां तक कि जब द्रव्यमान का पालन नहीं रह गया, तो माइक्रोमास संरचना और कोशिका व्यवहार्यता सुसंगत बनी रही ।

स्टेम या नाड़ी microenvironment के भीतर जनक कोशिकाओं चोट या बीमारी के जवाब में ऊतक की मरंमत के लिए जिंमेदार हैं । सबसे अच्छी तरह से विशेषता आबादी है कि pericyte से प्राप्त कर रहे है/adventitial डिब्बों, हालांकि वहां अभी भी विवाद के बारे में है कि क्या वहां मनुष्यों में इन आबादी का एक मानकीकृत आणविक पहचान है10,11 . इस प्रोटोकॉल में, हम विशेष रूप से मानव pvat से व्युत्पंन एक जनक सेल जनसंख्या का अध्ययन करने के लिए अपने प्रवृत्ति का परीक्षण करने के लिए एक osteogenic, chondrogenic या adipogenic वंश में अंतर । प्रत्येक वंश के लिए सेलुलर प्रतिबद्धता को परिभाषित करने के लिए धुंधला तकनीकों का उपयोग करना, हम दर्शाते हैं कि मानव अस्थि मज्जा से एमएससी के विपरीत, मानव pvat से जनक कोशिकाओं एक osteogenic वंश की ओर अंतर करने में सक्षम नहीं थे (चित्रा 3) लेकिन मजबूत प्रदर्शन एडिपोजेनिक विभेद । chondrogenic भेदभाव क्षमता अस्थि मज्जा और pvat व्युत्पंन कोशिकाओं के बीच तुलनीय है । यह पता चलता है कि pvat-व्युत्पन्न जनक कोशिकाओं अस्थि मज्जा एमएससी की तुलना में अधिक वंश प्रतिबंधित हो सकता है या कि pvat जनक आसानी से osteogenic वंश में अंतर नहीं है. भविष्य के अध्ययनों से प्रत्येक वंश के लिए और अधिक मात्रात्मक pvat व्युत्पंन कोशिकाओं के भेदभाव की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए मार्कर के जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक जांच शामिल होना चाहिए ।

वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक ध्यान दिया गया है, आसान पहुँच और कोशिकाओं है कि वसा ऊतक से प्राप्त किया जा सकता है की उच्च संख्या के कारण12,13. वसा ऊतक के स्ट्रोमल संवहनी अंश के भीतर, वहाँ संवहनी कोशिकाओं, भड़काऊ कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट, preadipocytes, और वसा व्युत्पंन स्टेम कोशिकाओं रहे हैं । वहां स्टेम सेल वसा डिपो और adipocyte विशेषताओं के संरचनात्मक स्थान पर आधारित जनसंख्या में मतभेद है14। सबसे महत्वपूर्ण बात, वसा प्राप्त स्टेम सेल करने के लिए न केवल मध्योतक वंश15में अंतर करने की क्षमता है, लेकिन यह भी न्यूरोनल16,17 और एपिडर्मल18 fates को अपनाने के लिए संभावित प्रतीत होता है ।

कई अध्ययनों से मानव चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतकों से व्युत्पन्न स्टेम/जनक कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है, लेकिन बहुत कुछ अध्ययनों pvat में जनक आबादी की विशेषताओं को संबोधित किया है. हाल के अध्ययनों में, चूहे के आंत्रयोजनी वाहिकाओं या वक्ष-ओरता के आसपास के pvat से आदिपोसाइट जनक कोशिकाओं को पृथक किया गया है । इन CD34 +/cd140a + आबादी adipocytes में विभेदित, हालांकि क्षमता अंय वंश प्राप्त करने के लिए19परीक्षण नहीं किया गया ।

हमने हाल ही में उन्नत कोरोनरी धमनी रोग6के साथ रोगियों से मानव pvat के स्ट्रोमल संवहनी अंश से व्युत्पंन जनक कोशिकाओं की विशेषता । ये वसा कोशिकाओं CD73 +, CD105 +, और CD140a + थे, और कुशलतापूर्वक thermogenic विशेषताओं के साथ adipocytes में विभेदित (UCP1 अभिव्यक्ति)6। वर्तमान कार्य में, हमें अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न एमएससी की तुलना में pvat-व्युत्पन्न कोशिकाओं की एक सीमित वंश शक्ति पाई गई, या तो एक कमी या वसा-व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं की कम जनसंख्या का सुझाव दिया गया है जो अन्य मानव वसा ऊतकों से विशेषता है । इस प्रोटोकॉल के लिए एक विचार मानव नमूनों के बीच अपेक्षित परिवर्तनशीलता है, जो pvat नमूने के भीतर स्टेम/progenitor कोशिकाओं की संख्या को प्रभावित कर सकता है और उनकी क्षमता अलग वंशालयों के लिए भेदभाव से गुजरना करने के लिए. आयु, लिंग, बीएमआई, दवाएं और अन्य नैदानिक मापदंडों की संभावना pvat के भीतर जनक कोशिकाओं के phenotype को प्रभावित करती है । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की उंमीद भविष्य संशोधनों के मानव pvat के भीतर एक और अधिक स्पष्ट रूप से परिभाषित जनक आबादी का इंतजार है, और संभवतः सेल का उपयोग विशिष्ट उप अलग करने के लिए वंश अध्ययन के लिए जनसंख्या छंटाई ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम नैदानिक ऊतक की खरीद के साथ सहायता करने के लिए मेन मेडिकल सेंटर में अनुसंधान नेविगेशन की सहायता स्वीकार करते हैं, और मुख्य चिकित्सा केंद्र अनुसंधान में (1p20gm121301, एल liaw पीआई द्वारा समर्थित) हिस्टोथोलॉजी और histopathology कोर संस्थान को सेक्शनिंग और धुंधला करने के लिए । इस काम nih अनुदान R01 HL141149 (एल liaw) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

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References

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Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

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