Summary
Здесь мы представляем протокол, описывающий изоляцию и культивирование эксрастений хряща от бычьих коленей. Этот метод обеспечивает простой и доступный инструмент для описания изменений тканей в ответ на биологические стимулы или новые терапевтические средства, направленные на сустав.
Abstract
Системы культуры Ex vivo охватывают широкий спектр экспериментов, посвященных изучению тканей и клеточной функции в родной обстановке. Хрящ является уникальной тканью, важной для правильной функции синовиального сустава и состоит из плотной внеклеточной матрицы (ECM), богатой протеогликаном и коллагеном II типа. Хондроциты являются единственным типом клеток, присутствующих в хрящевой и широко распространены и относительно низкив по количеству. Измененные внешние стимулы и клеточная сигнализация могут привести к изменениям в составе ЭКМ и ухудшению, которые являются важными патологическими признаками при таких заболеваниях, как остеоартрит (ОА) и ревматоидный артрит.
Модели хряща Ex vivo позволяют 1) профилирование хондроцитов опосредованного изменения оборота хрящевой ткани, 2) визуализации состава хряща ECM, и 3) хондроцитов перестановки непосредственно в ткани. Профилирование этих изменений в ответ на стимулы или лечения имеют большое значение в различных аспектах биологии хряща, и дополняют эксперименты in vitro в изолированных хондроцитах, или более сложные модели у живых животных, где экспериментальные условия труднее контролировать.
Хрящ explants представить переводный и легко доступный метод для оценки ткани ремоделирования в хрящеe ECM в контролируемых условиях. Здесь мы описываем протокол для изоляции и культивирования живых выемок хряща крупного рогатого скота. Метод использует ткани из бычьего колена, который легко доступен из местной бойни. Оба explants и обусловленной среды культуры можно проанализировать для того чтобы исследовать оборачиваемость ткани, состав ECM, и функцию хондроцита, таким образом профилировать модуляцию ECM.
Introduction
Хондроциты производят и поддерживают матрицу хряща. Для того, чтобы изучить биологию хондроцитов и как они и окружающие ECM реагируют на внешние раздражители, очень важно, чтобы допросить их в их родной среде1,2. Изучение текучести хрящевой ткани важно для расширения понимания основных механизмов в суставных заболеваний, таких как ОА, болезнь, для которой в настоящее время нет болезни изменения лечения. Следовательно, существует значительная потребность в улучшении моделей перевода2.
Ex vivo характеристика клеточных и тканей эффекты имеет важное значение для дополнения других доклинических моделей, как в пробирке, таких как хондроцит монослой культур, и in vivo, таких как хирургия индуцированных моделей ОА или аутоиммунных коллагена индуцированной модели артрита (ЦРУ ). Многочисленные исследования выявили различия между тем, как клетки ведут себя в 2D монослойных культур и 3D структур или в их родной ткани3,4. Многие клетки в 2D слоях принимают неестественные морфологии, в том числе различия в полярности клеток и привязанности тканей, в результате чего как визуальные, так и функциональные различия в клетках в родных тканях5. Различия также проявляются в функциональности клеток, которые могут сдвинуть экспрессию белка, что приводит к глубоко измененным дифференциации моделей, регулятивного механизма и функциональности клеток5,6,7 ,8.
Хрящ ECM состоит в основном из коллагена типа II, обеспечивающего матричную основу, и аггрекан, протеогликан, который помогает удерживать жидкость в ткани. Другие молекулы матрицы, такие как коллаген типа IV, VI, IX, X, XI, XII, фибронектин, хрящ олигомерный белок (COMP), biglycan, декорин, и perlecan также присутствуют9.
Хотя этиология ОА остается неясным10,11, начало заболевания, как полагают, вызвано дисбалансом в текучести тканей и процессов ремонта12,13. Деградация суставного хряща является отличительной чертой ОА. Хондроциты или клетки в окружающих тканях увеличивают высвобождение цитокинов, стимулируя повышенную выработку протеиназов, таких как матричные металлопротеиназы (ММп) и аггреканатазы, которые усиливают деградацию хряща ECM 14. Эта деградация приводит к освобождению небольших уникальных фрагментов белка, называемых неоэпитопами, которые могут быть количественно в сыворотке, моче или культуре среды15. При формировании и созревании коллагена также высвобождаются так называемые профрагменты; они могут быть количественно как мера производства матрицы16.
Целью данного протокола является создание модели хряща ex vivo для сравнения влияния стимуляции и/или медикаментозного лечения на оборот тканей ECM. Оборот хряща профилируется путем измерения матричных биоэпитопных биомаркеров непосредственно в условной среде культуры с использованием ELISA: AGNx1 (отражающая активность аггреканазы), C2M (отражающая активность матрицы MMP) и ProC2 (отражающий коллаген II типа формирования). Выводы могут быть проверены гистологическим окрашиванием ECM, который также визуализирует организацию хондроцитов в отдельных эксцатах. Описанный протокол может быть использован для проверки влияния новых методов лечения на функцию хондроцитов и оборот хряща ECM. Ряд исследований использовали хрящевые экспланты для описания биологических процессов или влияния вмешательства на цитокин-оспоренные экспланты с использованием количественных гистологических или иммуногистохимических подходов, мРНК, экспрессии белка или протеомики2 ,17,18. Однако эти протоколы выходят за рамки текущей рукописи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изоляция тканей
- Ткань источников
- Выполните весь раздел поиска ткани за ламинарным капотом потока в асептической среде.
- С местной скотобойни, получить весь свежий бычьего тибиофеморального коленного сустава от телят в возрасте от 1,5 до 2 лет.
- Аккуратно вскрыть икроное колено, сначала удалив избыток плоти, вскрывая кондилы, мениска, сухожилий и синовиальной мембраны. Вырезать сухожилия и синовиальной мембраны, что позволяет сустава расчленить. Удалите мениск, чтобы разоблачить бедренные кондилы.
- Изолировать эксматериалы из несущей области бедренной кондилов с помощью 3 мм биопсии перфоратор и освободить их от суставной поверхности путем резки скальпелем параллельно и как можно ближе к подхондрятель кости, как это возможно. Твердая структура подхноловой кости должна гарантировать, что экспланты не содержат кальцинированную матрицу. Стремитесь к эксламтам с равномерной высотой.
- Немедленно храните и смешивайте экспланты в DMEM/F12- GlutaMAX - 1% P/S культуры среды в 50 мл трубки или Петри блюдо. Не смешивайте экспланты с разных колен коров, но держите отдельно для каждого исследования.
- Ткань культивирования
- Перенесите экспланты на стерильную 96-ну хорошую пластину в ламинарном капоте.
- Вымойте explants 3 раза в среде культуры или PBS и культуры их в 200 зЛ культуры среды в хорошо до начала эксперимента. Используйте период вымывания 1 день для синхронизации биопсии клеточной активности и пассивного высвобождения биомаркеров.
- Культура explants до 10 недель в инкубаторе 37 градусов с 5% CO2. Поместите все репликации в каждой группе по диагонали в культурной пластине, чтобы свести к минимуму изменения, вызванные испарением. Чтобы избежать испарения супернатанта, добавьте PBS к внешним колодцам культурной плиты.
2. Лечение эксплантатором хряща крупного рогатого скота и оценка метаболической активности
- Культура среднего изменения и лечения
- Изменение среды культуры каждые 2-3 дня в ламинарной капоте потока.
- При применении каких-либо процедур, подготовить их до изменения среды. Подготовьте обработки к познавательной концентрации в скважинах explant разбавлять в среде культуры.
- Аккуратно удалите супернатант из каждой скважины и перенесите его на новую пластину 96 скважин. Храните супернатант с уплотнительной лентой при 20 градусах Цельсия для анализа биомаркеров текучести тканей и экспрессии белка.
- Немедленно добавьте 200 л свежей среды культуры или лечения в скважине. Не позволяйте эксцатам высохнуть во время среднего изменения и убедитесь, что все экспланты полностью погружены в новую среду.
- Резазурин окрашивания
- Измеряйте метаболическую активность один раз в неделю как косвенное измерение жизнеспособности клеток. Тест резазурина является простым способом оценки, если метаболическая активность эксплантов ухудшается для отдельных explant из-за клеточной смерти или клеточных изменений. Высаживания только в среде культуры имеют относительно стабильное чтение resazurin на протяжении всего периода эксперимента.
- Сделать решение культуры среды с 10% resazurin.
- Урожай супернатанта, как описано в шаге 2.1.3.
- Погрузите экспланты в 10% растворина в течение 3 ч при 37 градусах по Цельсию или до тех пор, пока супернационты не повернут фиолетовыми. Включите 4 скважины без эксплансов в качестве фонового элемента управления.
- Перенесите условный и фоновой контроль растворина в черную пластину микротитера и измерьте флуоресценцию при 540 нм.
- Тщательно вымойте 3 раза в среде культуры или PBS и погрузить explants в среде мытья в течение 5-10 минут, чтобы resazurin полностью рассеять. Добавить новую среду культуры или лечения при использовании.
3. Прекращение, фиксация и хранение образцов
- Прекращение периода культивирования
- Измерьте метаболическую активность, описанную в шаге 2.2. Добавьте 200 л PBS в скважину.
- Фиксация и хранение
- Удалить PBS, добавить 200 л формальдегида в скважину, и оставить на 2 ч при комнатной температуре.
- Утилизировать формальдегид и добавить 200 Л ПБС на скважину. Накройте тарелку уплотнительной лентой и храните при 4 градусах Цельсия для гистохимического анализа. Мы рекомендуем проводить гистохимический анализ в течение 3 месяцев.
4. Биомаркеры оборота тканей (ELISA)
- Косвенные конкурентные ELISAs
- Пальто стрептавидина пластины с конкретными биоинтинилатами асссеид ный пептид разбавленный 1:100 в буфере ассеа (100 л на хорошо) в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
- Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и добавить образец-супернатант (20 л на скважину) вместе с первичным моноклональным антителом против ассеа целевого пептида, разбавленного 1:93.3 для ProC2 и 1:100 в буфере ассоса для AGNx1 (100 л на скважину) и инкубировать в течение 2 ч при 20 градусах Цельсия с встряхиванием для ProC2 и 3 ч при 20 кв. м для AGNx1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца непосредственно взят из хранящихся супернатантных пластин. Если измеренная концентрация находится вне диапазона измерения, разбавьте супернатант в v-bottomed разбавленной пластине в PBS или буфере проверки. - Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с пероксидаза помечены вторичные антитела разбавленной 1:100 в ассе-буфер (100 л на хорошо) в течение 1 ч при 20 градусов по Цельсию.
- Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с встряхиванием в течение 15 минут в темноте при 20 градусах Цельсия с тетраметилбензидином (TMB) в качестве субстрата пероксидазы (100 л на скважину).
- Завершите реакцию стандартным стоп-шотом, 0,1 М Н2SO4 (100 л на скважину).
- Прочитайте колористетриюреакцию при абсорбции 450 нм, используя эталонную абсорбцию на уровне 650 нм на стандартном лабораторном считывателе.
- Прямые конкурентные ELISA для измерения оборота хрящевой ткани в супернатанте
ПРИМЕЧАНИЕ: Это количествли C2M.- Пальто стрептавидина пластины с конкретными биоинтинилатами асссеитария целевого пептида разбавленной 1:100 в буфере ассе (100 л на хорошо) в течение 30 мин при 20 градусах Цельсия.
- Вымойте 5 раз с мытьем буфера и добавить образец-супернатант вместе с 100 злител емким имонотальным антителом с маркировкой пероксидазы против разбавленного целевого пептида 1:100 в буфере анализов (20 л на колодец). Инкубировать в течение 20 ч при 2-8 градусов с встряхиванием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца непосредственно взят из хранящихся супернатантных пластин. Если измеренная концентрация находится вне диапазона измерения, разбавьте супернатант в v-bottomed разбавленной пластине в PBS или буфере проверки. - Вымойте 5 раз со стандартным буфером стирки и инкубировать с встряхиванием в течение 15 минут в темноте при 20 градусах Цельсия с TMB в качестве субстрата пероксидазы (100 qL на скважину).
- Завершите реакцию стандартным стоп-шотом, 0,1 М Н2SO4 (100 л на скважину).
- Прочитайте колористетриюреакцию при абсорбции 450 нм с эталонным абсорбцией на 650 нм на стандартном лабораторном считывателе.
- AGNx1
- Количественно еггрекан деградации путем измерения выпуска AGNx1 нео-эпитопа. Этот косвенный конкурентный ассси сeaл цели аггрекан C-терминал пептид (NITEGE373) порожденных ADAMTS-4 и 5 декольте. Моноклональное антитело распознает все фрагменты с помощью обнажённых эпитопа NITEGE. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте19.
- ProC2
- Количественное образование коллагена II типа путем измерения выпуска профрагмента коллагена II типа. Этот косвенный конкурентный обзор ELISA нацелен на эпитоп пропептида PIIBNP (DVR-PG), генерируемого N-пропептидазами во время обрезки недавно синтезированного коллагена II типа. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте16.
- C2M
- Количественная деградация коллагена типа II путем измерения выделения фрагмента неоэпитопа C2M. Этот прямой конкурентный ELISA признает MMP-расщепляется C-терминал пептид (KPPGRDGAAG1053). Этот ассеиотличается от AGNx1 и ProC2, так как это первичное антитело, которое маркируется пероксидаза и, таким образом, используется в качестве детектора. Экспериментальные детали ассея были опубликованы в другом месте20.
5. Гистологический анализ
- Инфильтрация, встраивание и резка
- Поместите фиксированные экспланты (см. шаг 3.2) в индивидуально маркированные кассеты. Включите как этикетку в кассету, так и кассеты с этикеткой для обеспечения идентификации.
- Перенесите кассеты, содержащие экспланты, в машину для процессора тканей. Затем проникают в экстенсы с парафином в серии обезвоживания и парафиновой инфильтрации шагов.
- Обезвоживание с 96% этанола в течение 90 минут без корректировки температуры. Повторите этот шаг 3 раза.
- Очистить этанол с толуолом в течение 90 минут без корректировки температуры. Повторите этот шаг 2 раза.
- Очистить этанол с толуолом в течение 90 мин при 60 градусах По Цельсию.
- Проникать с парафиновым воском в течение 30 мин при 60 градусах Цельсия.
- Проникать с парафиновым воском в течение 60 мин при 60 градусах Цельсия.
- Проникать с парафиновым воском в течение 90 мин при 60 градусах Цельсия.
- Для каждого шага добавьте растворы в образец камеры с медленным выкачиванием и насосными потоками под 33-34 кПа. Запустите процесс инфильтрации в цикле давления/вакуума с максимальным вакуумом от 65 до 70 кПа.
- После инфильтрации поместите кассеты на нагревательный блок, чтобы обеспечить тщательное удаление вылазов из кассеты. Аккуратно встраивайтесь в проинфильтртированные экспланты в отдельные парафиновые блоки. С нагретыми щипчинками, место explants с поверхностным суставным хряща и подхналовых костных сторон перпендикулярно резки поверхности, обеспечивая визуализацию различных слоев хряща в каждом разделе образца.
- Вырезать 5 мкм разделы охлажденных парафин-блоков со встроенными эксплантированными на микротоме. Перенесите вырезанные секции на холодную ванну. При необходимости разделы можно отделить либо скальпелем, либо крышкой стекла.
- Используя непокрытую стеклянную горку тщательно, перенесите секции на теплую водяную ванну (50 градусов по Цельсию), где разворачиваются секции. Поднимите каждую секцию на маркированную крышку слайда и поместите на горячую тарелку в течение 30 минут.
- Поместите слайды в корзину и инкубировать при 60 градусах по Цельсию в течение 1 ч, а затем держать их на ночь при 37 градусах Цельсия. В дальнейшем храните слайды в закрытых контейнерах при 4 градусах Цельсия до окрашивания.
- Safranin O/Fast Green окрашивание и визуализация
- Поместите горки, чтобы быть окрашены в корзину и инкубировать слайды на 60 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Приготовьте и процедите все реагенты фильтром 0,45 мм.
- При подготовке к окрашиванию, залить фильтрованные реагенты в клювах на объем, который позволяет решениям полностью покрыть слайды при погружении в корзину. Для покрытия горок использовались клювы, которые требовали объемом 250 мл.
- Депараффинизировать расплавленные горки, погрузив корзину в толуол в течение 10 минут дважды, 99% этанола в течение 2 минут дважды, 96% этанола в течение 2 минут дважды, и 70% этанола в течение 2 минут дважды. Затем увлажнить горки в воде в течение 2 мин.
- Пятно депарафинизированных и гидратированных слайдов путем погружения корзины в растворе hematoxylin в Weigert (pH 1.5) в течение 10 минут, окунуться в 1% HCl один раз, и промыть проточной водопроводной водой в течение примерно 5 мин или до тех пор, пока избыток цвета смыло.
- Далее, пятно в 0,05% Быстрый зеленый раствор (pH: 5,75) на 5 мин, окунуться в 1% CH3COOH один раз, и пятно в 0,1% Safranin O (pH: 6,5) в течение 20 мин.
- Обезвоживание и очистить слайды, окунув дважды в 70% этанола, 96% этанола в течение 2 минут дважды, 99% этанола в течение 2 минут в два раза, и толуол 2 мин в два раза.
- Смонтировать непокрытые стеклянные горки с помощью синой среды, покрывающей гистологические горки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Бовин полноглубинные экспланты были изолированы, культурны, и лечение в течение 3 недель(рисунок 1). Культура среда была изменена с добавлением лечения 3 раза в неделю. Однажды еженедельно метаболическая активность измерялась с помощью резазурина. Биомаркеры оборота ECM измерялись в супернатанте, собранном из культурной плиты 3 раза в неделю. Вылазоры были разделены на 4 группы для лечения: 1) Онкостатин М и ТНФЗ (ОЗТ); 2) ОСТ и GM6001 (GM6001); 3) Инсулин как фактор роста-1 (IGF-1); и 4) контроль без лечения (w/o).
Метаболическая активность.
Для всех четырех групп метаболическая активность была относительно стабильной в течение 3 недель(рисунок 2А). Была тенденция к тому, что IGF-1 увеличивает метаболическую активность чуть выше группы ж/о, а группы ОГТ уменьшают ее. Резазурин был использован для легкой оценки активности хондроцитов в каждом экспланте и косвенной оценки жизнеспособности клеток без извлечения эксрастений из эксперимента. Если эксплантирование показывает существенное снижение метаболической активности в ходе эксперимента, эксплант может быть исключен из дальнейшего анализа.
Катаболическое лечение.
ОТ применялась 3 раза в неделю к культурным скважинам для исследования деградации хряща, опосредованного ОТ(рисунок 3, рисунок 4). MMP-опосредованного типа II деградации коллагена и аггреканазы опосредованности аггрекан деградации были оценены C2M и AGNx1 ELISAs. ОЗТ увеличила деградацию коллагена II типа с 7-21 дней(рисунок 3А)и деградацию аггрекан с 3-14 дней(рисунок 4А)по сравнению с группой ж/о. При добавлении GM6001 (ингибитор ММП широкого спектра спектра) в сочетании с лечением ОЗТ, выпуск ОТ-опосредованного C2M был заблокирован(рисунок 3A,B). Снижение AGNx1 релиз наблюдался при добавлении GM6001 в дни 3-7, но AGNx1 релиз пики на день 10 на аналогичных уровнях, чтобы группа ОЗТ (Рисунок 4A), указывая НА GM6001 только уменьшает деградацию aggrecan в ограниченной степени. Эта модель в выпуске AGNx1 и C2M является общей картиной, наблюдаемой в модели хряща крупного рогатого скота, стимулируемой с помощью ОЗТ. Во-первых, AGNx1 высвобождается примерно с 3-го дня и достигает пиков в 10-14 дней, что представляет собой раннюю деградацию аггрекана. Далее, после 2 недель культивирования с Помощью ОЗТ, наблюдается деградация коллагена II типа, измеряемая биомаркером C2M.
Анаболическое лечение.
Чтобы исследовать, как анаболическая стимуляция модулирует оборот хряща ECM, инсулин, как фактор роста-1 (IGF-1) был применен 3 раза в неделю, чтобы крупной глубины explants. Влияние IGF-1 на расходные установки хряща наблюдалось в основном на измерениях образования коллагена II типа, оцениваемых ProC2, как и ожидалось для анаболических стимулов(рисунок 5). День 0 в этой модели всегда показывает высокие измерения ProC2, возможно, в качестве реакции на извлечение образцов. Эти высокие уровни существенно уменьшаются и выравниваются с 7-21 дней. При лечении IGF-1, уровни ProC2 уменьшаются меньше, чем те, которые наблюдаются в группе ж/о, что указывает на то, что IGF-1 стимулирует образование коллагена II типа с 7-го дня(рисунок 5B). Графики ProC2 также показывают биологическую вариацию коров. В этих экспериментах использовались растения двух коров с 6 эксламами на корову на группу. Первая корова имела более толстый хрящ и генерировала более крупные экспланты, что приводило к более высоким уровням ProC2 на базовом уровне, в то время как вторая корова была меньше с более тонким хрящом, что приводило к более низким уровням ProC2 на базовом уровне. Для групп w/o, IGF-1 и ОЗТ уровни ProC2 изображали среднее значение эксплансов обеих коров, но GM6001 измерялся только во второй корове с более тонкими эксрастениями. Таким образом, группа GM6001 начала с более низких уровней ProC2 в день 0, что проявляется в области ProC2 под кривой (AUC) (Рисунок 5C). Нормализация значений ProC2 до уровня 0 дней учитывает биологическую дисперсию, тем самым показывая эффективность лечения(рисунок 5В,D).
Safranin O и Fast Green гистологические пятна были выполнены для визуализации содержания протеогликана и структуры хряща explant на протяжении всего эксперимента(рисунок 6). В дни 0, 7, 14 и 21, explants от ж / о, IGF-1, и O'T группы были зациклены на гистологическое окрашивание(Рисунок 6). W / O и IGF-1 группа, как представляется, аналогичные Safranin O окрашивания интенсивности на следующий день 0 explant на протяжении всего эксперимента, который коррелирует с результатами биомаркера, показывающие, что ни одна из двух групп увеличилось AGNx1 релиз (Рисунок 4). Лечение с помощью O'T привело к существенной потере содержания протеогликана на 7-й день и полной потере на 21-й день. Кроме того, быстро зеленый окрашивания интенсивность уменьшается с дней 14-21, что свидетельствует о потере коллагена в соответствие с результатами C2M.
Рисунок 1: Схематический обзор метода хряща крупного рогатого скота.
В день No 1, бычьи бедренные кондилы были изолированы от заднего тибиофеморального сустава. Полноглубинные хрящевые экспланты были выпущены из кондилов с скальпелем и биопсии перфоратором. Извлеченные экспланты промывали и передавали в стерильную культурную плиту 96 колодцев. В день 0, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17, 19 и 21, супернатант был собран из культурной плиты, перенесен на плиту для хранения, и хранится при 20 градусах Цельсия, как показано в шаге среднего изменения 1. Сохраненный супернатант был позже разморожен для измерения биомаркеров оборота тканей конкретными анализами ELISA. В Средней Смена Шаг 2, после удаления супернатанта, новая среда культуры, содержащая различные методы лечения или нет лечения для контроля explants был применен. На день 0, 7, 14 и 21, explants были инкубированы с раствором 10% resazurin для 3 h после заготовки supernatant. 10% resazurin supernatant был перенесен в черный 96-колодец пластины, где колористетрия реакция была измерена. Культурные колодцы промывались 3 раза, прежде чем новая культурная среда с или без обработки была добавлена к вылазке, как показано в Medium Change Step 2. На 21 день, после сбора супернатанта и резазурина, экспланаторы были зациклены инкубации с формальдегидом на 2 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Метаболическая активность измеряется резазурином.
Крупновой полной глубины хряща explants были изолированы и культивируется в течение 3 недель. Культурная среда была изменена с добавлением нового лечения 3 раза в неделю (n no 12 explants из 2 коров). Лечение состояло из IGF-1 (100 нг/мл), ОСМ (ТНФЗ) (ОЗТ) (10/20 нг/мл) и ОЗТ (10/20 нг/мл) и GM6001 (GM6001) (GM6001) (GM6001). Была включена контрольная группа без лечения (w/o). Для группы ж/о, IGF-1 и O'T показана средняя и стандартная ошибка среднего (SEM) из 12 репликаций из 2 коров (6 реплик на корову). Для группы GM6001 показаны средние и SEM из 6 репликатов от 1 коровы. (A) Метаболическая активность измеряется resazurin. (B) Область под кривой (AUC) в течение дней 0-21 для метаболической активности графики показаны в (A). р йgt; 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Деградация коллагена II типа, измеряемая С2М.
Крупновой полной глубины хряща explants были изолированы и культивируется в течение 3 недель. Культурная среда была изменена с добавлением нового лечения 3 раза в неделю. Лечение состояло из IGF-1 (100 нг/мл), ОСМ (ТНФЗ) (ОЗТ) (10/20 нг/мл) и ОЗТ (10/20 нг/мл) и GM6001 (GM6001) (GM6001) (GM6001). Была включена контрольная группа без лечения (w/o). Для групп w/o, IGF-1 и O'T показаны средние и SEM из 12 репликаций из 2 коров (6 реплик на корову). Для группы GM6001 показаны средние и SEM из 6 репликатов от 1 коровы. (A) C2M измерения. Уровень статистической значимости w/o был рассчитан по повторным измерениям (RM) двусторонней ANOVA с многократным сравнительный тест Сидака. (B) AUC в течение нескольких дней 0-21 для C2M графики показаны в (A). Статистическая значимость была рассчитана по тесту Крускал-Валлис с многократным сравнительным тестом Данна. р йgt; 0.0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Aggrecan деградации измеряется AGNx1.
Крупновой полной глубины хряща explants были изолированы и культивируется в течение 3 недель. Культурная среда была изменена с добавлением нового лечения 3 раза в неделю. Лечение состояло из IGF-1 (100 нг/мл), ОСМ (ТНФЗ) (ОЗТ) (10/20 нг/мл) и ОЗТ (10/20 нг/мл) и GM6001 (GM6001) (GM6001) (GM6001). Была включена контрольная группа без лечения (w/o). Для группы ж/о, IGF-1 и O'T показаны средние и SEM из 12 репликаций из 2 коров (6 репликна на корову). Для группы GM6001 показаны средние и SEM из 6 репликатов от 1 коровы. (A) измерения AGNx1. Уровень статистической значимости w/o был рассчитан РМ двусторонним ANOVA с многократным сравнительный тест Сидака. (B) AUC в течение нескольких дней 0-21 для графиков AGNx1 показано в (A). Статистическая значимость была рассчитана по тесту Крускал-Валлис с многократным сравнительным тестом Данна. Р. р.; 0,01,р-р; 0,001, р.р.; 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Формирование коллагена II типа, измеренное ProC2.
Крупновой полной глубины хряща explants были изолированы и культивируется в течение 3 недель. Культурная среда была изменена с добавлением нового лечения 3 раза в неделю. Лечение состояло из IGF-1 (100 нг/мл), ОСМ (ТНФЗ) (ОЗТ) (10/20 нг/мл) и ОЗТ (10/20 нг/мл) и GM6001 (GM6001) (GM6001) (GM6001). Была включена контрольная группа без лечения (w/o). Для группы ж/о, IGF-1 и O'T показаны средние и SEM из 12 репликаций из 2 коров (6 репликна на корову). Для группы GM6001, средняя и SEM 6 реплики из 1 коровы повторно показано. (A) Измерения ProC2 в дни 0-21. (B) Значения ProC2 нормализовались до дня 0 измерений для каждого отдельного explant. Результаты ProC2 часто выигрывают от нормализации дня 0, чтобы раскрыть эффект лечения, который может быть замаскирован высоким уровнем биомаркеров в день 0. В A и Bуровень статистической значимости был рассчитан РМ двусторонним ANOVA с многократным сравнительный тест Сидака. (C) AUC в течение нескольких дней 0-21 для диаграмм ProC2 показано в (A). (D) AUC в течение дней 0-21 за день 0 нормализованных ProC2 графики показаны в (B). В C и D, статистическая значимость была рассчитана по тесту Kruskal-Wallis с многократным тестом сравнения Данна. Р. р.; 0,01,р-р; 0,001, р.р.; 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Гистологическая визуализация протеогликанного содержания Safranin O/Fast Green окрашивания.
Крупновой полной глубины хряща explants были изолированы и культивируется в течение 3 недель. Культурная среда была изменена с добавлением нового лечения 3 раза в неделю. Лечение состояло из IGF-1 (100 нг/мл) и ОСМ - ТНФЗ (ОЗТ) (О'Т) (10/20 нг/мл). Была включена контрольная группа без лечения (w/o). На день 0, 7, 14 и 21, explants были зациклены, проникли с парафином, встроенные в парафина, нарезанный, помещены на крышку слайды, и окрашенные гематоксилин, Safranin O, и Быстрый зеленый. Для каждой группы лечения и каждой временной точки отображается представительный эксплант. Шкала, показанная в базовой выборке (день 0), представляет 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленный здесь протокол для профилирования оборота хрящевой ткани в вылазках хряща крупного рогатого скота может быть использован для характеристики лечебных эффектов многих видов препаратов, включая ингибиторы воспалительных внутриклеточных путей, ингибиторы протеолитические ферменты, или анаболические факторы роста.
В этом протоколе описаны две различные установки: анаболическая установка, в которой экспланаторы стимулировались инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF-1), и катаболическая установка, включающая стимуляцию с помощью TNF-альфа и Oncostatin M, в которой оборот тканей может быть ингибируется с использованием ингибитора ММП широкого спектра. Основным результатом этого метода является количественная оценка биомаркеров неоэпитопов непосредственно в условной среде, которая собирается на протяжении всего периода культуры. Несколько биомаркеров можно измерить в супернатанте, что позволяет одновременно профилировать различные катаболические и анаболические процессы в одном образце. Гистологическое окрашивание с Safranin O/Fast Green было использовано для проверки результатов анализа биомаркеров. Для описания протокола использовались Онкостатин М, ТНФ-альфа и IGF-1; однако, метод не ограничивается конкретными стимуляторами цитокинов, и они могут быть легко обменян на другие в зависимости от гипотезы или тест лечения.
Интерпретация выхода биомаркера является временным упражнением из-за динамических изменений функции хондроцитов и профилей экспрессии с анаболической или катаболической стимуляцией с течением времени. В необработанных эксцатах образование коллагена II типа, измеряемое биомаркером ProC2, быстро уменьшается в течение первых 7-10 дней. Стимулирование с IGF-1 или аналогичными факторами роста поддерживает выпуск ProC2 в условиях среды на уровне, сопоставимом с базовым; таким образом, снижение является более постепенным, и выпуск увеличивается по отношению к необработанным эксплантам. В катаболической установке провоспалительные цитокины вызывают повышенное выражение протеаз хондроцитом в дни 0-14; это состоит в основном из аггреканаз. Это приводит к первоначальному значительному увеличению фрагментов белка, полученных из агггггрекса, включая AGNx1. На более поздних стадиях культуры хондроциты выражают больше ММП, что приводит к выпуску mMP-генерируемых маркеров, таких как C2M, около 14-го дня и далее. Таким образом, для того, чтобы профилировать эффект лечения, важно измерить биомаркеры в нужном интервале времени.
Как описано, лечение воспалительными цитокинами, такими как коктейль ОЗТ, со временем приведет к деградации хрящевых тканей. Общий пул ECM ограничен размером экспланта и должен учитываться при анализе профиля биомаркера. Следовательно, после первоначального увеличения выпуска биомаркеров, уровни могут снижаться со временем просто из-за сокращения оставшегося количества эксплантирования ECM.
Ранее ОА в первую очередь считалось заболеванием суставного хряща. Тем не менее, последние исследования показывают, что ОА следует рассматривать как болезнь всего сустава, где ранние изменения, связанные с болезнью в отдельных суставных отсеках, синовиум, кости и хряща, происходят параллельно, и с течением времени привести к совместной недостаточности12 ,21. Поэтому важно признать, что в этой модели системы, хрящ изолирован от остальной части сустава (и организма), ограничивая влияние эффектов взаимодействия тканей и системных факторов, которые могут регулировать гомеостаз ткани. Вместо этого, это упрощенная культура одной ткани, где экспериментально контролируемые условия могут быть модулированы для обнаружения патологических или интервенционных изменений в ткани с помощью биохимических методов, биомаркеров или гистологической визуализации. Из-за архитектуры хряща, изменения в количестве клеток, матричной композиции и вариации количества, как между эксрастениями, так и между источниками ткани. Поскольку относительная величина выхода биомаркеров может отличаться между экспериментами, рекомендуется нормализовать наборы данных для лучшего сравнения.
Для обеспечения наименьших возможных изменений и наилучших результатов, важно использовать хрящ из колен, которые являются как можно более свежими, предпочтительно между 1 и 24 ч после разделки. Изоляция хрящевой ткани должна быть сделана в однородном путе с explants быть грубо такой же толщиной. Вылазки должны быть изолированы от областей толстого хряща, избегая областей, близких к середине. Ткань всегда должна быть влажной, чтобы избежать гибели клеток и разложения матрицы. Продолжительность эксперимента3, время между средними изменениями, сроки стимуляции цитокинов, и интервалы лечения могут быть скорректированы в соответствии с гипотетическим режимом действия индивидуального соединения или механизма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CST, ACBJ и MK являются сотрудниками Nordic Bioscience. ACBJ и MK владеет акциями Nordic Bioscience. Остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят технического персонала Nordic Bioscience за лабораторную поддержку, а также Датский исследовательский фонд за общую поддержку наших исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 45% Iron(III) chloride solution | Sigma-Aldrich | 12322 | |
| Acetic acid | Merck | 1.00056.2500 | |
| Alamar Blue | Life tech Invitrogen | DAL1100 | |
| Biopsy processing cassettes – green | IHCWORLD | BC-0109G | |
| Biopsy punch W/Plunger (3 mm) | Scandidat | MTP-33-32 | |
| Bovine cartilage (Bovine knees) | Local slaughterhouse | ||
| C2M | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Corning 96-well plate | Sigma-Aldrich | CLS7007 | |
| Cover Glass Ø 13 mm | VWR | 631-0150P | |
| DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES | Gibco | 31331-028 | |
| Ethanol ≥96% | VWR | 83804.36 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | 83813.36 | |
| exAGNx1 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| exPRO-C2 | Nordic Bioscience | Fee for service | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Formaldehyde solution 4% | Merck | 1004965000 | |
| GM6001 | Sigma-Aldrich | M5939-5MG | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 30721-M | |
| IGF-1 | Sigma-Aldrich | I3769-50UG | |
| Oncostatin M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Pertex (mounting medium for light microscopy) | HistoLab | 811 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S2255 | |
| Sterile Standard Scalpels | Integra Miltex | 12-460-451 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 30743 | |
| SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides | Thermo scientific | J1800AMNT | |
| TNF-alpha | R&D Systems | 210-TA-100 | |
| Toluene | Merck | 1.08327.2500 | |
| Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax | TPP | 99955 |
References
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
- Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
- Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
- Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
- Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
- Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
- Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
- Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , Academic Press. New York. (2016).
- Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
- Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care? Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
- Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet? Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Goldring, M. B., Goldring, S. R.
- Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments? Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
- Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
- Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
- Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype? Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
- Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
- Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
- Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
