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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Métodos para testar a perturbação endócrina na Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Os produtos químicos do disruptor da glândula endócrina (EDCs) representam um problema sério para organismos e para ambientes naturais. A Drosophila melanogaster representa um modelo ideal para estudar os efeitos da EdC in vivo. Aqui, nós apresentamos métodos para investigar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade, na fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca.

Abstract

Nos últimos anos, tem havido uma crescente evidência de que todos os organismos e o meio ambiente estão expostos a produtos químicos semelhantes a hormônios, conhecidos como produtos químicos do disruptor endócrino (EDCs). Estes produtos químicos podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos e levar a efeitos adversos, bem como um número crescente de distúrbios hormonais na população humana ou o crescimento perturbado e redução da reprodução nas espécies selvagens. Para alguns EDCs, existem efeitos de saúde documentados e restrições sobre a sua utilização. No entanto, para a maioria deles, ainda não há evidências científicas nesse sentido. A fim de verificar os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico no organismo completo, precisamos testá-lo em sistemas de modelo adequados, bem como na mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Aqui nós relatamos detalhado in vivo protocolos para estudar o rompimento da glândula endócrina em Drosophila, abordando efeitos de EDC na fecundidade/fertilidade, no sincronismo desenvolvente, e no tempo da mosca. Nos últimos anos, utilizamos esses traços de vida de Drosophila para investigar os efeitos da exposição a 17-α-Etinilestradiol (EE2), bisfenol A (BPA) e bisfenol AF (BPA F). Ao todo, esses ensaios cobriram todos os estágios de vida da Drosophila e possibilitava avaliar o rompimento endócrino em todos os processos mediados por hormônios. Os ensaios de fecundidade/fertilidade e tempo de desenvolvimento foram úteis para mensurar o impacto do EDC no desempenho reprodutivo de mosca e em estágios de desenvolvimento, respectivamente. Finalmente, o ensaio da vida envolveu exposições crônicas do EDC aos adultos e mediu sua sobrevivência. No entanto, esses traços de vida também podem ser influenciados por vários fatores experimentais que tiveram que ser cuidadosamente controlados. Assim, neste trabalho, sugerimos uma série de procedimentos que otimizamos para o resultado correto desses ensaios. Estes métodos permitem que os cientistas estabeleçam o rompimento da glândula endócrina para todo o EDC ou para uma mistura de EDCs diferentes em Drosophila, embora identifique o mecanismo da glândula endócrina responsável para o efeito, uns essays mais adicionais poderiam ser necessários.

Introduction

As actividades humanas têm vindo a libertar no ambiente uma enorme quantidade de produtos químicos, que representam um grave problema para os organismos e para os ecossistemas naturais1. Destes poluentes, estima-se que cerca de 1.000 produtos químicos diferentes podem alterar o equilíbrio normal dos sistemas endócrinos; de acordo com esta propriedade, eles são classificados como produtos químicos de desregulação endócrina (EDCs). Especificamente, com base em uma definição recente pela sociedade endócrina, os EDCs são "um produto químico exógeno, ou mistura de produtos químicos, que podem interferir com qualquer aspecto da ação hormonal"2. Ao longo das últimas três décadas, tem havido crescente evidência científica de que os EDCs podem afetar a reprodução e o desenvolvimento de animais e plantas3,4,5,6,7, a 8. Além disso, a exposição à EDC tem sido relacionada à crescente prevalência de algumas doenças humanas, incluindo câncer, obesidade, diabetes, doenças da tireoide edistúrbios comportamentais9,10,11.

Mecanismos gerais de EDC

Devido às suas propriedades moleculares, os EDCs comportam-se como hormônios ou precursores hormonais3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. Neste sentido, eles podem se ligar ao receptor de um hormônio e perturbar os sistemas endócrinos, quer imitando a atividade hormonal ou bloqueando hormônios endógenos obrigatório. No primeiro caso, após a ligação ao receptor, eles podem ativá-lo como seu hormônio natural faria. No outro caso, a ligação do EDC ao receptor impede a ligação de seu hormônio natural, de modo que o receptor é bloqueado e não pode mais ser ativado, mesmo na presença de seu hormônio natural3. Consequentemente, os EDCs podem afetar vários processos, como a síntese, secreção, transporte, metabolismo ou ação periférica de hormônios endógenos que são responsáveis pela manutenção da homeostase, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento de o organismo. A ligação do receptor não é a única maneira de ação descrita até agora para os EDCs. Agora é evidente que eles também podem atuar recrutando coativadores ou corepressores em vias enzimáticas ou modificando marcadores epigenéticosdesregulando a expressão gênica10,11,12,13 ,14, com conseqüências não somente para a geração atual mas também para a saúde das gerações para vir8.

Hormônios da Drosophila

Os efeitos potenciais dos EDCs selecionados têm sido amplamente estudados, tanto nas espécies de animais selvagens como em vários sistemas de modelos nos quais os mecanismos endócrinos são razoavelmente conhecidos. Para os invertebrados, os sistemas endócrinos que influenciam o crescimento, o desenvolvimento e a reprodução têm sido extensivamente caracterizados em insetos por várias razões, envolvendo seu uso extensivo no campo da pesquisa biológica, sua importância econômica e Finalmente, o desenvolvimento de inseticidas capazes de interferir especificamente com o sistema hormonal de insetos pragas.

Em particular, entre os insetos, o fruto mosca D. melanogaster provou ser um sistema de modelo muito poderoso para avaliar os efeitos endócrinos potenciais de EDCs. Em D. melanogaster, bem como em vertebrados, os hormônios desempenham um papel importante ao longo de todo o ciclo de vida. Neste organismo, existem três principais sistemas hormonais, que envolvem a hormona esteróide 20-hidroxiecdysona (20e)15,16, o hormônio juvenil sesquiterpenóide (JH)17, e os neuropeptídeos e peptídeos/proteínas hormônios18. Este terceiro grupo consiste em vários peptídeos descobertos mais recentemente, mas claramente envolvidos em uma enorme variedade de processos fisiológicos e comportamentais, como longevidade, homeostase, metabolismo, reprodução, memória e controle locomotor. 20E é homóloga aos hormônios esteróides derivados do colesterol, como o estradiol, enquanto JH compartilha algumas semelhanças com o ácido retinóico; Ambos são os hormônios mais conhecidos em Drosophila19,20. Seu equilíbrio é vital na coordenação da muda e metamorfose, bem como no controle de vários processos pós-desenvolvimentais, tais como reprodução, vida útil e comportamento21, oferecendo assim diferentes possibilidades para testar a glândula endócrina perturbação na Drosophila. Além disso, os hormônios ecdiesteróide e JHS são os principais alvos dos chamados inseticidas de terceira geração, desenvolvidos para interferir com os processos de desenvolvimento e mediado por endócrinos em insetos. O modo de ação agonista ou antagonista desses produtos químicos é bem conhecido e, portanto, eles podem servir como padrões de referência para avaliar os efeitos de potenciais EDCs sobre o crescimento, reprodução e desenvolvimento de insetos22. Por exemplo, o Methoprene, que tem sido amplamente utilizado no controle de mosquitos e outros insetos aquáticos23,24, funciona como um agonista JH e reprisa a transcrição e metamorfose do gene 20e-induced.

Além dos hormônios, a superfamília de receptores nucleares (NR) em Drosophila também é bem conhecida; consiste em 18 fatores de transcrição evolutivamente conservados envolvidos no controle de vias de desenvolvimento dependentes de hormônio, bem como na reprodução e fisiologia25. Estes NRS da hormona pertencem a todos os seis subtypes da superfamília do NR, incluindo aqueles envolvidos na neurotransmissão26, dois para NRS do ácido retinóico, e aqueles para NRS esteróides que, nos Vertebrates, representam um dos alvos preliminares de EDCs27.

Drosophila como um sistema modelo para estudar EDCs

Atualmente, com base em Propriedades moleculares, várias agências ambientais em todo o mundo estão atribuindo o potencial de interferir com os sistemas endócrinos para diferentes produtos químicos feitos pelo homem. Dado que os FED constituem um problema global e onipresente para o ambiente e para os organismos, o objectivo geral da investigação neste domínio é reduzir a sua carga de doença, bem como proteger os organismos vivos dos seus efeitos adversos. A fim de aprofundar o entendimento sobre os potenciais efeitos endócrinos de um produto químico, é necessário testá-lo in vivo. Para este fim, D. melanogaster representa um sistema de modelo válido. Até o momento, a mosca-das-frutas tem sido amplamente utilizada como modelo in vivo para avaliar os efeitos de vários EDCs ambientais; foi relatado que a exposição a vários EDCs, como o ftalato de dibutilo (PAD)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-Octilfenol (4-tert-op)29, metilparabeno (MP)30, Etilparabeno (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalate (dehp)33, e 17-α-Etinilestradiol (EE2)34, influencia o metabolismo e as funções endócrinas como em modelos vertebrados. Várias razões levaram ao seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Além de um excelente conhecimento de seus sistemas endócrinos, outras vantagens incluem seu ciclo de vida curto, baixo custo, genoma facilmente manipulável, uma longa história de pesquisa e várias possibilidades técnicas (consulte o site do FlyBase, http://flybase.org/). D. melanogaster também fornece um modelo poderoso para facilmente estudar efeitos transgeracionais e respostas da população a fatores ambientais8 e evita questões éticas relevantes para estudos in vivo em animais mais elevados. Além, a mosca da fruta compartilha de um alto nível da conservação do gene com os seres humanos que puderam fazer possível para que os ensaios de Drosophila EDC ajudem em prever ou em sugerir efeitos potenciais destes produtos químicos para a saúde humana. Além de ampliar o entendimento sobre os efeitos da saúde humana, a Drosophila pode ajudar a avaliar os riscos da exposição ao ambiente EDC, como a perda de biodiversidade e a degradação ambiental. Finalmente, a mosca da fruta oferece a vantagem adicional de ser usado nos laboratórios, onde os fatores que afetam potencial seu desenvolvimento, reprodução, e vida útil podem ser mantidos o controle a fim atribuir toda a variação à substância a ser testada.

Com isso em mente, otimizamos os ensaios de condicionamento físico simples e robusto para determinar os efeitos do EDC em alguns traços hormonais da Drosophila, como fecundidade/fertilidade, tempo de desenvolvimento e vida adulta. Estes ensaios têm sido amplamente utilizados para alguns EDCs23, 24,25,26,27. Em particular, foram utilizados os seguintes protocolos para avaliar os efeitos da exposição ao estrogênio sintético EE234 e ao BPA e ao BISFENOL AF (BPA F) (dados não publicados). Esses protocolos podem ser facilmente modificados para investigar os efeitos de um determinado EDC de cada vez, bem como os efeitos combinados de múltiplos EDCs em D. melanogaster.

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Protocol

1. preparação de alimentos

  1. Para a manutenção de estoque e para o crescimento larval, use um meio de farinha de milho contendo 3% de fermento em pó, 10% de sacarose, 9% de farinha de milho pré-cozida, 0,4% de agar, depois chamado meio de farinha de milho (CM).
    1. Coloque 30 g de fermento em 100 mL de água da torneira, leve-o a ferver e deixe ferver por 15 min.
    2. Separadamente, misture bem 90 g de farinha de milho pré-cozida, 100 g de açúcar e 4 g de agar em 900 mL de água da torneira.
    3. Traga a solução para ferver, abaixe o calor e cozinhe por 5 minutos mexendo continuamente.
    4. Após 5 minutos, adicione a solução de levedura quente e cozinhe por mais 15 min.
    5. Desligue a fonte de calor e deixe a solução arrefecer a cerca de 60 ° c.
    6. Adicionar 5 mL/L de 10% metil 4-hidroxibenzoato em etanol, misture bem e deixe descansar por 10 min.
      Nota: Tenha cuidado com a quantidade de 4-hidroxibenzoato de metilo, uma vez que uma alta concentração de fungicida pode ser letal para as larvas.
    7. Dispense o meio em frascos para injetáveis/frascos: 8 mL em cada frasco para injetáveis de mosca (25 mm x 95 mm), 3 mL em cada frasco de mosca (22 mm x 63 mm) e 60 mL em cada frasco de mosca (250 mL).
    8. Cubra os frascos com gaze e deixe-os secar à temperatura ambiente (RT) durante 24 horas antes do armazenamento.
    9. Calibre a consistência e a hidratação experimentalmente direitas do CM modificando a quantidade de agar usado e/ou os tempos refrigerando/de secagem.
      Nota: os frascos desconectados, encaixotados e embalados são estáveis por aproximadamente 15 dias em 4 ° c.
  2. Para adultos de Drosophila, use um meio contendo 10% de fermento em pó, 10% de sacarose, 2% de agar, depois chamado de meio adulto (AM).
    1. Misture 10 g de fermento em pó, 10 g de sacarose, 2 g de agar em 100 mL de água destilada.
    2. Leve esta mistura para ferver duas vezes, com um intervalo de 3 minutos, ou até que o agar é dissolvido, usando um microondas.
    3. Uma vez que a solução arrefece a 60 ° c, adicione 5 mL/L de 10% metil 4-hidroxibenzoato em etanol, misture bem e dispense em frascos (10 mL por frasco).
    4. Cubra os frascos com gaze e deixe-os secar em RT por 24 h antes de armazenar.
      Nota: os frascos desconectados, encaixotados e embalados são estáveis por aproximadamente 15 dias em 4 ° c.
  3. Para o ensaio da fecundidade/fertilidade, use o suco de tomate de Drosophila-meio da farinha de milho.
    1. Despeje 70 mL de alimento quente de farinha de milho em um copo de 100 mL e adicione 30 mL de suco de tomate (30% v/v).
    2. Misture cuidadosamente com um processador de alimentos e 3 mL de Pipet em pequenos frascos.
    3. Cubra os frascos com gaze e deixe-os secar na RT durante 24 horas antes do armazenamento.
      Nota: os frascos desconectados, encaixotados e embalados são estáveis por aproximadamente 15 dias em 4 ° c.
  4. Para coleta de embriões, use placas de agar, contendo 3% de agar, 30% de molho de tomate e 3% de açúcar.
    Nota: tenha cuidado para não fazer bolhas ao derramar o meio nas placas.

2. dosagem de Drosophila EDC

  1. Prepare uma solução de estoque apropriada dissolvendo o EDC selecionado no solvente adequado. Para o EE2 (peso molecular 296,403), dissolver 1,48 g em 10 mL de etanol 100% para fazer uma solução de estoque de 0,5 M e armazenar a-80 ° c.
    Atenção: As EDCs são consideradas poluentes ambientais e devem ser tomadas precauções no tratamento dos mesmos.
  2. Diluir a solução de estoque EE2 em 10% de etanol em água (v/v), a fim de obter uma solução de 100 mM. Faça as próximas diluições (0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) em alimentos CM, começando com a concentração mais baixa e utilizando a mesma concentração final de solvente para cada grupo de tratamento. Para os frascos de controlo utilizar apenas o mesmo volume do solvente.
    Nota: recomenda-se manter a concentração final do solvente o mais baixo possível, tendo em conta que a concentração final de etanol não deve exceder 2% em alimentos com mosca.
  3. Adicione a solução que contém a diluição direita do EDC selecionado para o alimento à base de farinha de milho antes da solidificação, misture bem com um processador de alimentos, dispense 10 mL em frascos, cubra com gaze de algodão e deixe secar em RT para 16 h antes de usar.
    Nota: utilize este meio imediatamente após a sua preparação.
  4. Para a criação de adultos, prepare diferentes soluções de EE2 de trabalho (10 mM, 50 mM e 100 mM, respectivamente) em 10% de etanol em água (v/v) e camada 100 μL de cada uma na superfície do AM, a fim de obter a concentração desejada do EE2 (0,1 mM , 0,5 mM e 1 mM). Para o controle use o mesmo volume do solvente sozinho.
    Nota: Alternativamente, adicione a solução que contém a diluição direita do EDC selecionado a uma pequena quantidade de am em um tubo cônico de 50 ml, vórtice completamente e estratifique 1 ml dele na superfície dos frascos de am.
    1. Cubra frascos com gaze de algodão, deixe secar em RT para 12-16 h agitação suave e usá-los imediatamente.
      Nota: o processo de secagem deve ser ajustado experimentalmente porque é dependendo da umidade ambiental.
  5. Para o ensaio de alimentação, adicione a solução que contém a diluição direita do EDC selecionado (EE2 0,1 mM, 0,5 mM e 1 mM) e um alimento para colorir (por exemplo, o corante vermelho n º 40 a 1 mg/mL)35 para o cm antes da solidificação, misture fortemente com um processador de alimentos e, em seguida, dispens e em frascos.

3. a criação de moscas

  1. Use uma cepa isogênica robusta, como o Oregon R, mantida por várias gerações no laboratório.
  2. Mantenha as moscas em uma incubadora humidificada, temperatura-controlada, com uma luz natural de 12 h: fotoperíodo escuro de 12 h em 25 ° c nos frascos que contêm o alimento do CM.
  3. Em cada ensaio, utilize frascos para injetáveis em RT.

4. ensaio de alimentação

Nota: Este ensaio é recomendado para testar se a presença do EDC selecionado no meio pode afetar a alimentação de moscas.

  1. Coloque 15 moscas jovens em frascos contendo CM suplementados com diferentes concentrações do EDC selecionado e um alimento para colorir. Permita que as moscas se alimentem na mídia por 1 dia.
    Nota:por exemplo, use corante vermelho n º 4035 (1 mg/ml).
  2. Coloque 15 moscas jovens em frascos contendo CM suplementados com o solvente sozinho e um alimento para colorir para o controle. Permita que as moscas se alimentem na mídia por 1 dia.
  3. Anestesie individualmente cada grupo de moscas com éter.
    1. Transfira moscas de cada grupo a um recipiente de vidro cilíndrico (etherizer) com um funil introduzido na extremidade aberta, invertendo o frasco sobre o funil e batendo delicadamente os dois recipientes junto para fazer as moscas cair no etherizer.
      Nota:  O funil irá impedi-los de sair do etherizer.
    2. Bata voa para baixo delicadamente batendo o etherizer em uma superfície macia, tal como um rato-almofada, e substitua rapidamente o funil com um plugue éter-embebido do algodão e da gaze.
    3. Aguarde cerca de 1 min até que as moscas caem para o fundo e parar de se mover.
      Nota: não exceda o tempo ou as moscas morrerão.
  4. Coloque as moscas imobilizadas um microscópio estéreo e compare a coloração abdominal de cada grupo de tratamento com relação ao grupo controle.

5. fecundidade/ensaio de fertilidade

  1. Para cada concentração de EDC, prepare 3 frascos para injetáveis de moscas, posteriormente denominados frascos parentais, com 8 fêmeas e 4 machos em 10 mL de alimento CM/EDC; para o controle Prepare 6 frascos de moscas com 8 fêmeas e 4 machos em 10 mL de alimento do CM suplementado com o solvente. A traseira voa em uma incubadora em 25 ° c.
    Nota: Evite as larvas de superlotação durante o seu desenvolvimento e tente usar densidades larvares consistentes em todos os tratamentos.
  2. Após 4 dias, retire os pais e devolva os frascos para injetáveis na incubadora por mais 5 dias.
  3. No final da tarde do dia 9, retire todos os recém-moscas dos frascos e coloque os frascos em uma incubadora a 18 ° c durante a noite.
    Nota: Esta remoção deve ser feita com muito cuidado, verificando a superfície do meio bem.
    1. Na manhã do dia 10, para cada grupo de tratamento, colete fêmeas virgens e machos jovens em dois grupos, anestesia leve de CO2 . Subdivida aleatoriamente cada grupo de moscas em pequenos subgrupos (10 fêmeas e 20 machos por frasco) em frascos independentes preenchidos com CM correspondente fresco.
      1. Repita o passo 5.3.1 tomando cuidado para remover cuidadosamente todas as moscas dos frascos para injetáveis 8-10 h antes da colheita e deixar os frascos a 18 ° c, até obter pelo menos 30 fêmeas virgens e 30 machos para cada concentração de EDC e pelo menos 90 fêmeas virgens e 90 machos para o controlo.
    2. Abrigar estes grupos de moscas a 25 ° c até que sejam envelhecidos 4 dias após a eclosão, transferindo-os para novos frascos contendo meio fresco correspondente a cada dois dias.
      Nota: 4 dias é tempo suficiente para que as moscas se tornem adultos maduros, mas é muito longe do início da senescência.
    3. Após dois dias, certifique-se de que não há larvas nos frascos de fêmeas. Se o fizerem, as moscas não são utilizáveis porque não são virgens e devem ser descartadas.
  4. Use 20 moscas individuais de cada sexo para cada grupo de tratamento para configurar 20 cruzamentos individuais em pequenos frascos contendo meio fresco CM-tomate sem EDC, como descrito abaixo.
    1. Para cada grupo de tratamento atribuir uma série diferente de números seqüenciais, que identifica exclusivamente e rotular os respectivos frascos; ex.: 1 a 20, grupo 2 (concentração de EDC x) de 20 a 40, e assim por diante.
    2. Faça uma planilha de fertilidade para gravar as diferentes séries, cada uma correspondendo a um grupo de tratamento.
    3. Para cada sexo anestesiam todas as moscas pertencentes a cada grupo de tratamento luz CO2 e as transferem aleatoriamente da seguinte forma.
      1. Transfira uma fêmea solvente-tratada em um frasco pequeno que contem o meio fresco do CM-tomate sem EDC e adicione um macho solvente-Tratado para a Cruz do controle.
        Nota: o sumo de tomate deve ser adicionado ao meio durante a sua preparação porque o meio escuro aumenta o contraste com os embriões brancos.
      2. Transfira um EDC Tratado fêmea em um frasco pequeno que contem o CM-tomate fresco sem EDC e adicione um macho solvente-Tratado para cada tratamento.
      3. Transfira um macho Tratado EDC em um pequeno frasco contendo meio fresco do CM-tomate sem EDC e adicione uma fêmea solvente-tratada para cada tratamento.
    4. Casa todas estas cruzes individuais a 25 ° c.
  5. Transfira cada par de acasalamento em frascos frescos do CM-tomate sem EDC todos os dias para os dez dias subseqüentes. Rotule os frascos replicados de cada série sequencialmente; ex.: 1-a, 1B, 1C...... 20A, 20B, 20C e relatar esses números na planilha de fertilidade.
  6. Inspecione visualmente cada frasco para injetáveis todos os dias para os ovos e relate o seu número na folha de cálculo de fertilidade.
  7. Guarde cada frasco para injetáveis e, quando as novas moscas começarem a surgir, registre também o número diário de progênies adultas durante o período de 10 dias. Após 10 dias do acasalamento inicial, remova os pais.
    Nota: descarte o frasco para injetáveis em que um ou ambos os pais morreram; em caso de fuga de um ou ambos os pais, inclua na análise todos os dados até o dia em que foram perdidos.
  8. Soma-se o número diário de ovos e o número diário de progênies adultas de cada grupo de tratamento, para obter a fecundidade total/fertilidade, a média de ovos e a produção de progênies adultas por uma mosca por dez dias, e a razão entre a descendência total e o número total de ovos colocados. Calcule as diferenças em percentagem de cada valor de tratamento em relação ao controlo.
  9. Realizar três experimentos independentes para cada grupo de moscas, usando um mínimo de 10 moscas para cada grupo de tratamento.
  10. Realizar análise estatística para comparar os diferentes grupos.

6. timing de desenvolvimento

Nota: Nos dois seguintes protocolos alternativos, o tempo de desenvolvimento é avaliado contando tanto o número de pupas que formam por dia quanto o número de descendentes de adultos por dia.

  1. Protocolo de ensaio de eclosão 1
    1. Para cada grupo de tratamento, configurar 10 frascos de jovens (< 2 dias), moscas saudáveis, cada um com 6 fêmeas e 3 machos em 10 mL de farinha de milho sem EDC.
    2. Deixe moscas em alimentos para 24 h, e permitir-lhes acasalar.
    3. Prepare 10 frascos paralelos por grupo de tratamento com 10 mL cada um dos alimentos frescos de farinha de milho suplementados com diferentes concentrações de EDC ou o solvente isoladamente para o controle. Transferência de moscas acasaladas para estes frascos novos.
      Nota: para cada grupo de tratamento atribua uma série diferente de números sequenciais, que o identificam exclusivamente e rotulam os respectivos frascos.
    4. Faça uma planilha de desenvolvimento para gravar as diferentes séries.
    5. Permitir moscas para colocar ovos para 16 h. Em seguida, retire os pais dos frascos.
      Nota: O pai voa pode ser usado para repetir o passo 6.1.5, transferindo-os para outros frascos correspondentes.
    6. Incubar frascos para 3-4 dias a 25 ° c, ou até que não se forme mais pupas. Cada dia contar o número de recém-pupas em cada frasco e relatá-lo na planilha de desenvolvimento. Para evitar a contagem da mesma pupa duas vezes, escreva um número em sequência em cada pupa com um marcador permanente na parte externa do frasco para injetáveis.
    7. A partir do dia 9, contar diariamente o número de adultos emergentes até que não mais adultos emergiram, e relatá-lo na planilha de desenvolvimento.
    8. A partir desses dados brutos, calculamos o período médio larval, o período médio de pupas, bem como as diferenças em percentagem de cada tratamento em relação ao controle.
    9. Realizar três experimentos independentes para cada grupo de moscas, usando um mínimo de 5 frascos para cada grupo de tratamento.
    10. Realizar análise estatística para comparar os diferentes grupos.
  2. Protocolo de ensaio de eclosão 2
    1. A fêmea nova e saudável traseira (aproximadamente 150) e o macho (aproximadamente 50) voam em uma gaiolada coleção (tabela dos materiais) com meio do agar-tomate suplementado com a pasta do fermento do padeiro fresco (3 g do fermento do padeiro em 5 ml da água), a seguir chamado bandeja de colocação, por 2 dias a 25 ° c.
    2. Durante estes 2 dias, permita que as moscas aclimatar à gaiola em um lugar escuro, quieto, antes de começar a coleção do ovo, e mude a bandeja de colocação duas vezes por dia.
    3. No terceiro dia, mude a bandeja de assentamento no início da manhã. Depois de 1 h, substitua a bandeja de assentamento, descartando estes ovos colocados.
    4. Permitir moscas para colocar ovos para 2 h e substituir com a bandeja de assentamento fresco.
      Nota: No dia 3, uma boa bandeja de assentamento deve produzir 100-200 ovos em 2 h.
    5. Para cada grupo de tratamento, prepare uma série de pratos de 3 60 mm contendo alimentos de farinha de milho suplementados com a concentração de EDC correspondente ou com solvente sozinho e relate cada série na planilha de cronometragem de desenvolvimento. Alternativamente, se preferir, use frascos para injetáveis em vez de pratos.
    6. Gentilmente pegar os ovos um microscópio usando um pincel ou uma sonda e transferi-los para o topo do meio em cada prato/frasco. A fim de facilitar a contagem, na bandeja de assentamento, organizar os ovos em 5 grupos de 10 cada e transferi-los um de cada vez.
      Nota: Repita o passo 6.2.4 Quantas vezes for necessário para obter embriões suficientes.
    7. Casa todos estes pratos/frascos a 25 ° c. Armazene também cada bandeja de assentamento em 25 ° c, e conte o número total de ovos colocados.
    8. Após 24-30 h, verifique cada prato/frasco um estereomicroscópio e conte tanto o número de ovos brancos, não fertilizados e o número de embriões mortos escuros.
    9. Subtrair o número de ovos brancos e não fertilizados do valor de 50 ovos transferidos para obter o valor de "embriões totais" por prato/frasco para injetáveis. O número de embriões mortos escuros pode ser usado para determinar potenciais efeitos tóxicos da EDC durante a embriogênese.
    10. Repita as etapas 6.1.6-6.1.10 do protocolo de ensaio de Eclosion 1.

7. protocolo do tempo

  1. Configurar 20 frascos para injetáveis de moscas com 8 fêmeas e 4 machos e casa a 25 ° c em CM (10 mL cada).
  2. Após 4 dias descarte as moscas e coloque os frascos de volta na incubadora.
    Nota: estas moscas podem ser usadas para começar outra vez para obter outras coortes idade-sincronizadas das moscas.
  3. No final da tarde do dia 9, retire todas as novas moscas dos frascos e devolva os frascos para injetáveis à incubadora.
    Nota: alguns adultos devem começar a Eclose tão cedo quanto o nono dia; descartar essas moscas permite coletar um número máximo de moscas sincronizadas, evitando a seleção descuidada de emergent precoce.
  4. 16-24 h mais tarde, transfira as moscas adultas (1 dia de idade) de ambos os sexos em quatro grupos de garrafas de 250 mL contendo alimentos AM suplementados com três concentrações diferentes de EDC e uma com o solvente isoladamente. Se necessário, colete outro lote no dia seguinte.
  5. Manter moscas a 25 ° c por 2-3 dias para permitir que eles acasalam.
    Nota: o dia da transferência para os frascos de alimentos am corresponde ao primeiro dia de vida adulta.
  6. Após dois-três dias, classifique cada coorte das moscas pelo sexo em dois grupos a anestesia clara do CO2 . Subdivida aleatoriamente cada sexo em cinco frascos por tratamento em uma densidade de 20 indivíduos por frasco, até que haja três repetições de 5 frascos paralelos para cada sexo por cada tratamento.
    Nota: Trabalhe com pequenos grupos de moscas, a fim de evitar possíveis problemas de saúde duradouros devido ao longo tempo de exposição ao CO2.
  7. Prepare uma planilha de tempo em que o número de moscas mortas é subtraído do número de moscas sobreviventes para a transferência anterior, de forma a obter automaticamente o número de sobreviventes em cada transferência.
  8. Transferência voa em novos frascos contendo o alimento correspondente a cada 3 dias ao mesmo tempo e verificar a morte.
    Nota: a transferência deve ter lugar sem anestesia que poderia ter um efeito negativo a longo prazo sobre a longevidade da mosca.
    1. Em cada transferência, registre a idade das moscas e o número de moscas mortas.
      Nota: o número de moscas sobreviventes é calculado automaticamente na planilha, mas é recomendável verificá-lo visualmente. Moscas que acidentalmente ambos escapam ou morrem durante a transferência não devem ser consideradas. Tenha cuidado para não contar duas moscas mortas transportadas para o novo frasco que relata esta nota na planilha.
    2. Repita os passos 7,8 e 7.8.1 até que todas as moscas morrem.
  9. Para cada grupo de tratamento, criar uma curva de sobrevivência como mostrado na Figura 6, a fim de exibir a probabilidade de sobrevivência de uma mosca em qualquer momento específico.
  10. Realize três experimentos independentes para cada grupo de tratamento de moscas, usando 100 moscas recém-eclosed para cada experimento.
  11. Prepare uma tabela para relatar a vida útil média (dias médios de sobrevida de todas as moscas para cada grupo), o tempo de meia morte (período de tempo em dias necessário para atingir 50% de mortalidade) e o tempo máximo de vida (quantidade máxima de dias necessários para atingir 90% de mortalidade).
  12. Calcule as diferenças em percentagem entre cada grupo de tratamento em relação ao grupo de controlo.
  13. Realizar análise estatística para comparar os diferentes grupos de tratamento.

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Representative Results

Nesta seção, as etapas-chave dos protocolos acima são relatadas a forma de esquemas simplificados. Dado que as moscas tendem a evitar compostos inpalatáveis, a primeira coisa a fazer é o ensaio do gosto do EDC selecionado. Isto pode ser feito misturando uma coloração de alimento (por exemplo, corante vermelho do alimento no. 40)35 com o alimento suplementado com o EDC selecionado em várias doses ou com o solvente sozinho. Moscas alimentadas com esses meios são examinadas um estereomicroscópio e a ingestão de alimentos é estimada pela coloração abdominal (Figura 1). Uma situação típica desejada é mostrada na Figura 1 com duas fêmeas adultas: uma alimentada em meio contendo o EDC selecionado e uma em meio que não contenha a EDC, ambas apresentando a mesma coloração em seu abdômen.

Tem sido amplamente aceito que os EDCs, como hormônios naturais, têm efeitos em doses extremamente baixas e que não há uma relação simples e linear entre a dose e o efeito29, com doses mais elevadas não necessariamente tendo um efeito maior36, 37. Assim, em vez de uma abordagem dose-resposta, a fim de avaliar plenamente os seus impactos, é aconselhável usar mais doses, a partir de concentrações relevantes para o ambiente ou para outros organismos. Em qualquer caso, é importante ensaiar o gosto EDC em cada concentração utilizada para garantir que as moscas digerem quantidades comparáveis de EDC em cada grupo de tratamento (Figura 2).

O rompimento da glândula endócrina afeta muitos traços importantes da fisiologia animal tal como a fertilidade, a longevidade, e o desenvolvimento que, conseqüentemente, são pontos finais úteis para testar EDCs. Para os protocolos acima, que otimizamos para medir os efeitos EDC sobre esses traços de vida de Drosophila, considerações primárias são que é imperativo usar moscas jovens e saudáveis que devem ser manipuladas corretamente antes do teste. Com isso em mente, grande atenção deve ser dada à produção, manuseio e armazenamento dos alimentos usados. Além disso, deve-se tomar cuidado ao usar o melhor solvente para a EDC selecionada em concentrações finais apropriadas (ou seja, menos de 1% para dimetil sulfóxido [DMSO] e menos de 2% para etanol)30.

A fecundidade e a fertilidade têm sido utilizadas para avaliar o sucesso reprodutivo em D. melanogaster. A Figura 3 mostra um esquema do protocolo usado. A fecundidade é avaliada experimentalmente como o número total de ovos colocados, enquanto a fertilidade é medida como descendência adulta total. Baseado na consideração que a produção do ovo nos primeiros 10 dias da vida adulta é uma boa referência para a produção adulta inteira do ovo/Progeny da vida de um organismo38,39, os ensaios da fertilidade e da fecundidade podem ser realizados por 10 dias por usando 4 moscas do dia-velho eclodidas das larvas expostas. É importante tentar obter valores semelhantes nos frascos paralelos de cada grupo; caso contrário, seria difícil imaginar qual tubo remover da análise. Assim, é aconselhável examinar diariamente cada frasco replicado para evitar um ambiente estressante, como alimentos secos ou liquefeitos; a partir de 20 cruzamentos individuais, recomenda-se obter pelo menos 10 frascos em boas condições em que ambos os pais estavam vivos por 10 dias. Os números de ovos e de descendência adulta, coletados diariamente, devem ser relatados em uma tabela, como mostrado na Figura 3 , e usados para calcular a produção média de ovos e progês adultas de uma mosca por 10 dias. Em seguida, a porcentagem de fecundidade/fertilidade das moscas tratadas com EDC em comparação com as moscas de controle pode ser obtida aplicando-se a seguinte fórmula: fecundidade/alteração da fertilidade% = [(controle-tratamento)/controle] x 100. Pelo menos três repetições independentes devem ser obtidas para cada grupo.

Hormônios desempenham papéis essenciais em transições de desenvolvimento na vida de D. melanogaster40, para o qual é provável que essas fases de crescimento são particularmente vulneráveis aos efeitos adversos dos EDCs. A 25 ° c, tanto o crescimento larval e o estágio pupal cada span aproximadamente 4 dias. Após a exposição à EDC, a duração média dessas etapas pode ser afetada41. Com base nessa consideração, os protocolos de cronometragem desenvolvimentais foram otimizados para determinar a porcentagem e o tempo de transição de larvas para pupas e de pupas para adultos após a exposição ao EDC em relação às moscas não tratadas. Dois protocolos alternativos poderiam realizar este ensaio. Ambos eram válidos e baseados na exposição crônica EDC às larvas durante um período de 4 dias. Com base neste tratamento larval, o primeiro protocolo não teve em conta a idade dos embriões, que foram coletadas durante um período de 16-18 h (durante a noite). A consequente variabilidade etária entre as larvas deve, no entanto, estar presente em todos os frascos de cada tratamento, aumentando assim a variância dentro do tratamento, mas sem afetar significativamente as estimativas de tempo de desenvolvimento através dos tratamentos. Em lugar de, o segundo protocolo usou um número fixo de embriões adiantados Synchronous, fazendo o possível avaliar também os efeitos potenciais do EDC selecionado durante o embriogênese42,43. Além disso, minimizar as diferenças de idade entre as larvas reduziu a variância dentro do tratamento e aumentou a capacidade de estimar verdadeiras diferenças entre os tratamentos. A Figura 4 relata um esquema do ensaio de eclosão. Em ambos os protocolos, as placas/frascos tiveram que ser verificadas diariamente, e os números das pupas e dos adultos dos expostos e não expostos ao EDC deveriam ser relatados separadamente em uma tabela como na Figura 4. Todas as pupas formadas e moscas adultas tiveram que ser contadas, sejam mortas ou vivas. Em seguida, esses dados brutos foram utilizados para calcular porcentagens e tempos de transição de larvas para pupas e de pupas para adultos e para calcular a porcentagem de mudança desses valores das moscas tratadas com EDC em comparação com as moscas controle. Depois da exposição de EDC, um avanço ou um atraso de desenvolvimento total com respeito às moscas de controle eram ser esperados. O protocolo escolhido teve que ser realizado em triplicado para cada grupo de moscas. Foi aconselhável que, para o protocolo de ensaio de eclosão 2, cada série de uma repetição para uma dada concentração de EDC fosse semeada com embriões da mesma trilha de postura, a fim de manter a confiabilidade e a acurácia no preparo do embrião ao longo das concentrações de EDC.

Finalmente, a Figura 5 mostra as etapas-chave para medir a vida útil. Para este protocolo, era essencial que todas as moscas em análise fossem síncronas por idade e sexo, acopladas e mantidas a uma densidade baixa o suficiente para permitir a livre circulação. É importante realizar experimentos de vida útil em ambos os sexos separadamente, pois é bem conhecido que existem diferenças significativas no tempo de vida entre machos e fêmeas44.

O alimento teve que ser mudado cada 3 dias para manter uma população saudável, e a mortalidade teve que ser avaliada igualmente cada 3 dias. Em uma planilha de vida útil, como na Figura 5, o número de moscas mortas foi relatado, e esse número seria automaticamente subtraído do número de moscas sobreviventes da transferência anterior. Para cada concentração de EDC e para o solvente isoladamente, a sobrevivência cumulativa versus os dias decorridos foi plotada para obter curvas de tempo. Uma curva típica de sobrevivência é relatada na Figura 6; após um período inicial longo em que a curva do sobrevivência remanesceu relativamente elevado, declinou exponencialmente após aproximadamente 60 dias. Após a exposição EDC, a curva de sobrevivência das moscas tratadas poderia ser afetada significativamente. A fim determinar se este efeito é devido ao EDC selecionado, era aconselhável realizar pelo menos dois, ou melhor ainda, três experimentos independentes, noncontemporaneous da repetição.

Em cada um dos protocolos acima, foi possível ter frascos anômalos (por exemplo, sem ovos ou mortes anómalas); Estes frascos podem ter sido originados por diferentes causas, como a má qualidade dos alimentos ou a infeção, e podem alterar significativamente os valores das medidas. A melhor maneira de administrar essas situações anômalas foi evitá-las por meio de uma boa prática experimental. Assim, deve-se ressaltar que, para todos os protocolos acima, foi necessário um trabalho grande e cuidadoso na replicação dos frascos, mantendo as moscas saudáveis, e no manuseio de moscas que, uma vez expostas a uma EDC, podem se tornar delicadas, aumentando assim o risco de morte quando Manipulado.

Figure 1
Figura 1: ensaio de alimentação. Adultos moscas em frascos contendo CM/corante suplementado com um EDC selecionado (superior) ou solvente sozinho (fundo) são deixados para alimentar por 24 h. Duas moscas alimentadas no meio suplementado com um EDC (parte superior) ou solvente sozinho (parte inferior) mostram a coloração similar em seus abdômen. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: dosagem de EDC. Esquema da administração EDC para Drosophila por dieta. As moscas adultas de um estoque isogênico são expostas a diferentes concentrações de um EDC (topo) ou solvente sozinho (fundo). N = a concentração de referência do EDC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: ensaio de fertilidade. Esquema do protocolo, descrevendo as etapas do crescimento da mosca em meios apropriados à coleção virgem e até cruzes individuais. Passo 1: adultos (10 frascos com oito fêmeas e quatro machos cada) a partir de uma estirpe isogênica são transferidos para frascos com CM/EDC (superior) ou CM/solvente sozinho (fundo). (Note que o esquema, por simplicidade, refere-se apenas a um dos três frascos.) Passo 2: após 4 dias, os adultos são descartados, e ovos colocados são deixados para desenvolver por 9 dias até o estágio adulto. Passo 3: os adultos recém-eclosed são ordenados por sexo e recolhidos em frascos (máx. 20 machos/frasco e 10 virgens-fêmeas/frasco). Passo 4: os adultos são deixados para envelhecer por 4 dias no meio correspondente do crescimento larval. Etapa 5: a instalação de 40 escolhem cruzes para as moscas EDC-tratadas no meio do CM-tomate sem um EDC, 20x um macho EDC-tratado com uma fêmea do controle e 20x um macho do controle com um EDC-tratou a fêmea (parte superior); a instalação de 20 escolhem cruzes para o controle voa, 20x um macho do controle com uma fêmea do controle (parte inferior). O meio amarelo é um CM suplementado com um EDC (parte superior) ou um solvente como o controle (parte inferior), e o meio vermelho é um tomate/CM sem um EDC ou um solvente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: tempo de desenvolvimento (protocolo de ensaio de eclosão 2). À esquerda, esta figura mostra um esquema da gaiola da coleção em que os adultos (aproximadamente 150 fêmeas e 50 machos) são coloc ao aclimatar e ao companheiro no escuro antes da etapa do depósito (Veja o protocolo). Após 2 dias, a bandeja deslizante velha é substituída com uma com alimento fresco, e os ovos deposto nos próximos 1 h são descartados porque são assíncronos. A seguir, os ovos são recolhidos a cada 2 h em uma nova bandeja deslizante, contados, e colocados em pratos contendo tomate/CM suplementado com um EDC ou com solvente sozinho. Os dados (ovos totais, ovos não divulgados, pupas e adultos eclodidos) são relatados em uma série de planilhas de cronometragem de desenvolvimento (direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: ensaio do tempo de vida. Um dia as moscas sincronizadas são transferidas para um frasco de 250 mL com alimento adulto (AM) suplementado com um EDC (parte superior) ou solvente (parte inferior) como o controle, para permitir a alimentação (deixado no esquema). Após 2-3 dias, as moscas são ordenadas por sexo e transferidas para cinco frascos (contendo o meio correspondente do frasco de partida) para cada sexo, em grupos de 20 indivíduos/frasco. A cada 3 dias, os adultos são transferidos para frascos frescos até que não seja mais necessário (parte central do esquema). À direita está um esquema da tabela em que os dados são gravados para cada dia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: curvas de tempo. À esquerda, é relatada uma tabela representativa na qual o número de moscas mortas foi registrado a cada 3 dias, tanto para o grupo de tratamento (médio + EDC [0, 5 mM EE2]) quanto para o grupo controle (meio + solvente), durante todo o período experimental. O tempo médio de cada grupo foi calculado com o uso da matriz Sum. Do produto; o grupo tratado reduziu o tempo médio em relação ao grupo controle. À direita, é mostrada uma curva de sobrevida típica de moscas masculinas alimentadas com meio contendo EE2 (0, 5 mM) ou apenas etanol para o controle. A curva de sobrevivência diminuiu mais rapidamente para as moscas tratadas do que para o grupo controle, com um ponto de queda de giro anterior. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O Fruit Fly D. melanogaster tem sido extensivamente empregado como um sistema in vivo modelo para investigar os efeitos potenciais de EDCs ambientais, tais como DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33, e EE234. Várias razões levaram seu uso como modelo neste campo de pesquisa. Aparte de suas vantagens indiscutíveis como um sistema modelo, Drosophila compartilha de um alto nível da conservação do gene com seres humanos, para que os ensaios de Drosophila EDC podem ajudar em prever ou em sugerir efeitos potenciais para a saúde humana. Além disso, a Drosophila pertence aos invertebrados, que são amplamente representados em todos os ecossistemas e exigem maiores medidas de proteção contra os efeitos nocivos dos EDCs. Os invertebrados estão localizados na base da cadeia alimentar e desempenham funções muito importantes para os ambientes em que vivem. Foi relatado que vários EDCs liberados no ambiente podem ter uma influência prejudicial no desenvolvimento e reprodução de várias espécies animais. A Drosophila oferece a vantagem adicional de ser usado em laboratório, onde os fatores potencialmente afetando o desenvolvimento, reprodução e tempo de vida podem ser mantidos controle, a fim de atribuir qualquer variação à substância a ser testada.

Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para estudar os efeitos da exposição de EDC neste sistema modelo em traços de vida hormonalmente regulados tais como a fecundidade/fertilidade, a taxa desenvolvente, e o tempo. Otimizamos esses protocolos que possibilitaram investigar os efeitos da exposição a EE234, BPA e bpaf (dados não publicados), mas podem ser facilmente adaptados para estudar os efeitos de outros EDCs. Em particular, estes ensaios podem ser utilizados para investigar ambos os EDCs puros e combinações de diferentes EDCs, reproduzindo mais de perto o que ocorre na natureza. Embora aparentemente, podem parecer como ensaios de crescimento simples, é importante trabalhar de acordo com as diretrizes apropriadas, assegurando a exatidão e a reprodutibilidade45. É bem sabido que a fertilidade, o tempo de desenvolvimento e a longevidade em D. melanogaster podem ser afetados por fatores externos e internos. Esses fatores críticos, incluindo fotoperíodo, temperatura, umidade, nutrição, densidade populacional, estrutura genética e idade, devem ser cuidadosamente controlados para o desfecho dos protocolos relatados. A fim de minimizar o componente da variabilidade genética, uma cepa isogênica deve ser usada. Esta estirpe deve ser cuidadosamente criada em uma incubadora humidificada, com temperatura controlada, com uma luz natural de 12 h: fotoperíodo escuro de 12 h a 25 ° c.

Além da manutenção de um ambiente controlado, a sobrelotação larval e mosca tem de ser evitada. Tem sido relatado que a superlotação larval pode afetar o tempo de desenvolvimento e induzir a expressão de vários genes, incluindo choque térmico ou genes relacionados à imunidade, que influenciam a aptidão total de moscas adultas46. Além disso, moscas adultas têm de ser mantidas a uma densidade baixa o suficiente para permitir a livre circulação, a fim de minimizar o stress adulto. Além disso, é importante certificar-se de que as moscas consomem quantidades comparáveis da EDC em cada grupo de tratamento, levando em consideração o sabor do composto em diferentes concentrações, porque as moscas tendem a evitar alimentos não palatáveis. Outro aspecto importante desses protocolos é a qualidade dos alimentos; o alimento deve igualmente olhar bom, desprovido das bolhas, das rachaduras das bactérias, e assim por diante47,48. Além disso, é necessário manter em mente a sincronização, o status de acasalamento e a coabação de gênero para que as moscas sejam testadas. Em todos os protocolos relatados, é importante que os frascos paralelos em análise devam ser muito semelhantes; caso contrário, seria difícil entender qual descartar para que a atenção máxima e a boa prática experimental sejam necessárias. Por fim, ao utilizar estes protocolos para avaliar os efeitos endócrinos dos EDCs seleccionados, é importante ter em conta possíveis interações com outros EDCs presentes no meio, como o metil 4-hidroxibenzoato ou a ABP dos frascos plásticos. Nesse sentido, pode ser útil mudar o agente antifúngico, usar frascos de vidro ou realizar ensaios piloto com e sem possíveis contaminantes.

Os ensaios de Drosophila relatados podem ser muito eficazes para a avaliação de todos os produtos químicos ou mistura de produtos químicos, tais como EDCs, avaliando os efeitos potenciais em traços de vida hormonalmente regulados, tais como a reprodução, o desenvolvimento, e a vida. No entanto, estes ensaios não podem servir para identificar claramente o mecanismo endócrino responsável pelos efeitos adversos do EDC. Para superar essa limitação, é possível executar os mesmos protocolos usando EDCs de referência que evocam respostas representativas de um determinado modo de ação no sistema endócrino de insetos (por exemplo, inseticidas de terceira geração trabalhando como JH ou ecdiesteróide agonista/antagonista)22. Alternativamente, também é possível usar Endpoints moleculares, realizando análises moleculares em genes específicos que são regulados hormonalmente e que são considerados biomarcadores preditivos e específicos para o rompimento endócrino34.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem Orsolina Petillo pelo apoio técnico. Os autores agradecem ao Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) pelo apoio bibliográfico. Os autores agradecem ao Dr. Gustavo Damiano Mita por apresentá-los ao mundo EDC. Os autores agradecem à Leica Microsystems e ao Pasquale romano por sua assistência. Esta pesquisa foi apoiada pelo projeto PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate Alla rigenerazione e ricostruzione tissutale, Implantologia e sensoristica em odontoiatria/oculistica" sigla "sorriso"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projeto PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

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Biologia do desenvolvimento edição 149 Drosophila melanogaster produtos químicos do disruptor da glândula endócrina fecundidade fertilidade desenvolvimento tempo
Métodos para testar a perturbação endócrina na <em>Drosophila melanogaster</em>
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Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

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