Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции

Published: May 11, 2020 doi: 10.3791/59641
Automatic Translation
1, 1,2
1Unit Antiviral Strategies, OIE Reference Laboratories for Rift Valley Fever Virus & Crimean Congo Hemorrhagic Fever Virus, Institut Pasteur, 2Institut Pasteur de Guinée, Conakry

Summary

Здесь мы описываем непрямой иммунозахват сэндвича ELISA для определения иммуногенного содержания гликопротеинов в вакцинах против бешенства. Этот тест использует нейтрализующее моноклональные антитела (mAb-D1), распознавающее тримеры гликопротеина. Это альтернатива тесту in vivo NIH, чтобы следить за согласованностью потенции вакцин во время производства.

Abstract

Растущая глобальная забота о благополучии животных поощряет производителей и Национальные контрольные лаборатории (OMCLs) следовать стратегии 3Rs по замене, сокращению и уточнению лабораторных испытаний на животных. Разработка подходов в пробирке рекомендуется на уровне ВОЗ и Европы в качестве альтернативы тесту NIH для оценки потенции вакцины против бешенства. На поверхности частиц вируса бешенства (RABV) тримы гликопротеина являются основным иммуногеном, вызывающим вирусные нейтрализующие антитела (VNAbs). Тест ELISA, где нейтрализующие моноклональные антитела (mAb-D1) распознают тримеральную форму гликопротеина, был разработан для определения содержания родного сложенного тримерного гликопротеина наряду с производством партий вакцины. Этот тест на пробирку продемонстрировал хорошее соответствие с тестом NIH и был признан подходящим в совместных испытаниях производителями вакцин RABV и OMCLs. Предотвращение использования животных является достижимой целью в ближайшем будущем.

Представленный метод основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с использованием mAb-D1, который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV, т.е. иммуногенного rabV. mAb-D1 используется как для покрытия, так и для обнаружения тримеров гликопротеинов, присутствующих в партии вакцины. Так как эпитоп распознается из-за его конформационных свойств, потенциально денатурированный гликопротеин (менее иммуногенный) не может быть захвачен и обнаружен mAb-D1. Вакцина, которая будет протестирована инкубируется в пластине сенсибилизированы с mAb-D1. Связанные тримерные гликопротеины RABV идентифицируются путем добавления mAb-D1 снова, помечены пероксидаза, а затем выявлены в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина.

Introduction

С более чем 50 лет, тест NIH1 используется в качестве золотого стандарта метод для оценки потенции вакцины против бешенства до выпуска партии. Этот тест состоит из интраперитонеальной иммунизации групп мышей с вакциной, которая должна быть протестирована с последующим внутримозговой (IC) вызов 14 дней спустя с Challenge Virus Standard (CVS) штамм вируса бешенства (RABV). Потенция оценивается по доле мышей, переживших вызов IC. Хотя ВОЗ2 и Европейская Фармакопея3 по-прежнему требуют теста NIH для оценки потенции вакцины, этот тест страдает от нескольких препятствий: результаты весьма изменчивы4; инфекционные RABV используется во время вызова, и это требует как технические навыки и строгие меры биобезопасности; большое количество животных используются, и тяжесть проблемы вызывает серьезные этические проблемы5. Менее серьезные изменения этого теста была разработана: через две недели после внутриперитонеальной иммунизации, мышей не оспаривается IC, но кровь и испытания на наличие конкретных RABV нейтрализующих антител (VNAbs) в сыворотке крови с помощью теста на нейтрализацию in vitro. Тем не менее, этот тест по-прежнему требует жертвования большое количество лабораторных мышей, хотя он уже используется для ветеринарных вакцин6,7 и был рассмотрен для человекавакцины 8.

В настоящее время как международные9, так и европейские10 рекомендаций поощряют производителей и национальные лаборатории контроля (Official Medicine Control Laboratories - OMCLs) к внедрению замены, сокращения и уточнения лабораторных испытаний на животных, именуемых стратегией 3Rs. Европейская директива 2010/63/EU (действует с 2013/01/01), касающаяся защиты и благополучия животных, также усилила ограничения для производителей вакцин и лабораторий, участвующих в контроле качества вакцин против бешенства, а также в исследованиях бешенства11. В результате этого разработка, проверка и использование альтернативных подходов in vitro стали в настоящее время приоритетными. Это не только этически обоснованные, но и могут также сократить расходы на пакетное тестирование и сократить время для результатов до часов, а не недель3.

На поверхности частицы RABV гликопротеин принимает тримерическую форму12,,13,,14,,15,,16. В вакцине против бешенства, эта родная форма тримерической представляет собой основной иммуноген индуцирования VNAbs17 в то время как мономерные, растворимые или денатурированные гликопротеины плохо иммуногенных18,19. Таким образом, сохранение тримеров гликопротеина в процессе производства вакцины является хорошим показателем сохранения оптимального иммуногенного потенциала. Несколько иммунохимических методов, таких как антитела-связывающий-тест20,21, один радиальный иммунодиффузии (SRD) тест22 и тест ELISA23,24,25,26,27 рекомендованы ВОЗ Технический доклад серии2 и европейской монографии3 для количественной оценки содержания антигена в вакцинах против бешенства.26 Они используются производителями для мониторинга согласованности производства вакцин и OMCL для оценки последовательной формулировки партий вакцин для человека28, даже если тест NIH по-прежнему рассматривается для потенции.

Однако все эти иммунохимические методы не являются эквивалентными. Тест SRD требует предварительной обработки, которая может изменить мембранно-якорные тримеры и привести к растворимым или денатурированной форме гликопротеина22,29. Таким образом, SRD не очень эффективно в дискриминации между иммуногенными и неиммуногенных гликопротеинов в результате несовершенной оценки иммуногенности вакцины много. В отличие от этого, тест ELISA является более чувствительным22, сохраняет родную структуру гликопротеина, и более подходит для определения содержания родной сложенные тримеры гликопротеина. Тест ELISA может использовать либо поликлональные поликлональные или мыши моноклональные антигликопротеиновые антитела очищены или концентрированы с сульфатом аммония. Исследования показали хорошее соответствие между тестом NIH и содержанием антигена, оцененным ELISA в вакцинах, и пришли к выводу, что методы ELISA подходят для теста на пробирку. Это выступает за то, что тесты ELISA могут по крайней мере дополнить или даже заменить тест NIH4,26,,27,30,31,32,33. Сегодня Европейская Фармакопея рекомендует использовать проверенные серологические или иммунохимические анализы в качестве альтернативы тесту NIH3. Полное избегание использования животных для вакцины потенции стала реалистичной точки зрения.

Метод, представленный ниже, основан на косвенном иммунозахвате сэндвича ELISA с помощью клона моноклонального антитела мыши (mAb-D1), который распознает антигенные участки III (aa 330 до 338) тримерного гликопротеина RABV15,34. Этот метод был разработан первоначально в ИнститутеПастера 26,30 затем оптимизированы и проверены ВАГении Посев де Медурат дю Медудемент и де produits де Санте (ANSM) лаборатории, т.е. французский OMCL4,33. mAb-D1 используется как для сенсибилизации пластины, так и для обнаружения захваченного антигена. Это позволяет проводить конкретную количественную оценку тримеров гликопротеинов, т.е. иммуногенного антигена RABV. mAb-D1, используемый для обнаружения, маркируется пероксидазой, которая раскрывается в присутствии субстрата и хромогена. Сравнение абсорбции, измеренной для испытанной вакцины и эталонной вакцины, позволяет определить содержание иммуногенного гликопротеина. Следует отметить, что один и тот же тип анализ может быть применен для различных mAbs признавая различные антигенные участки ГЛИкопротеина RABV35. Метод получения и очистки или концентрации с аммонием сульфат анти-гликопротеин поликлональных кролика иммуноглобулины G (IgG) или моноклональные мышки глобулины были широко описаны ранее36 вместе с методом сопряжения антител с пероксидазы37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Меры предосторожности

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод применим как к живой RABV, так и к инактивированной вакцине.

  1. Используйте хорошие лабораторные процедуры и процедуры безопасности.
  2. Носите адекватное оборудование для личной защиты (PPE), включая одноразовое пальто, перчатки, маску, очки и т.д.
  3. Когда живой вирус титрит, используйте класс II биологической безопасности кабинета.
    1. Рассматривайте любой материал, контактный с образцами (реагенты, стиральные растворы и т.д.) как инфекционный материал.
    2. Лечить загрязненный материал путем погружения в раствор отбеливателя (2,5% гипохлорит натрия) в течение 30 минут для обеззараживания.
  4. Обработка химических веществ в соответствии с хорошей лабораторной практикой.

2. Подготовка

  1. Используйте аналитические реагенты класса, где это возможно.
  2. Подготовьте свежие растворы буфера покрытия/карбоната, буфера пассивации, разбавителя и цитрата(таблица 1),процедите фильтры 0,45 или 0,22 мкм и храните при 4 градусах Цельсия в течение одного дня до использования для сохранения их аналитической чистоты.
  3. Разрешить реагентам достичь комнатной температуры (от 18 до 25 градусов по Цельсию) 30 мин до использования и гомогенизации путем нежного смешивания до использования.

3. Микроплитная сенсибилизация

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 96 хорошо адсорбции иммуноанализ пластин, которые оптимизированы для связывания большого количества иммуноглобулинов (например, см. Таблица материалов).

  1. К каждой скважине добавьте 200 л моноклональных антител (mAb-D1), разбавленных в карбонатном буфере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация около 1 мкг/мл была экспериментально определена и соответствует приблизительному 1/2000 разбавлению очищенного mAb-D1. Эта рекомендуемая концентрация указана для каждой партии mAb-D1 и должна периодически проверяться с положительным контролем.
  2. Накройте тарелку клейкой пленкой и инкубировать микроплиту на 3 ч при 37 градусах Цельсия в увлажненной атмосфере.
  3. Тщательно аспирировать и передавать содержание колодца в получателя, содержащего 2,5% натрия гипохлорит раствор.
  4. Перевернуть микроплиту и дайте ей высохнуть на адсорбентской бумаге при комнатной температуре в течение 5 мин.

4. Микроплитная пассивация

  1. К каждой скважине добавьте 300 кЛ буфера пассивации.
  2. Накройте тарелку клейкой пленкой и инкубировать в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
  3. Тщательно аспирируйте и перенесите содержимое скважины получателю, содержащему 2,5% раствор гипохлорита натрия.
  4. Перевернуть микроплиту и дайте ей высохнуть на адсорбентской бумаге при комнатной температуре в течение 1 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микроплита может быть немедленно использована или сохранена запечатанной при -20 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев до использования.

5. ELISA анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Для установления кривой контроля эталонной вакцины, шаг 5.3 не требуется; для титра вакцины все шаги 5,1 до 5,6 необходимы.

  1. Мытье сенсибилизированной микроплиты
    1. К каждой скважине добавьте 300 кл.л. стирального буфера.
    2. Тщательно аспирируйте и перенесите содержимое скважины получателю, содержащему 2,5% раствор гипохлорита натрия.
    3. Повторите шаги 5.1.1 и 5.1.2 еще пять раз, чтобы широко мыть сенсифицированную пластину.
    4. Перевернуть микроплиту и дайте ей высохнуть на адсорбентской бумаге при комнатной температуре в течение 1 мин.
  2. Разбавления эталонной вакцины для контрольной кривой
    1. Восстановите эталонную вакцину (валидация антигена Lot 09) в 1 мл дистиллированной воды, соответствующей концентрации 10 мкг/мл гликопротеина вируса бешенства.
    2. Подготовьте десятикратное разбавление восстановленной эталонной вакцины в разбавитель, чтобы достичь 1 мкг/мл гликопротеина вируса бешенства.
    3. Подготовьте 6 серийных двухкратных разбавлений этой эталонной вакцины в разбавителе, как указано в таблице 1.
    4. Распределите 200 л разбавитель в дубликате (колодцы 1H/2H), чтобы служить пустым элементом управления.
    5. Распределите 200 л на скважину каждой эталонной вакцины разбавления в дублировать (скважины G1/G2 до A1/A2).
  3. Разбавления испытанной вакцины для ее титрования
    1. Подготовьте десятикратное разбавление испытанной вакцины в разбавителях.
    2. Подготовьте 7 двукратных серийных разбавлений испытанной вакцины в разбавителе, как указано в таблице 2.
    3. Распределите 200 л на скважину каждого проверенного разбавления вакцины в дубликате (скважины H3/H4 до A3/A4).
  4. Инкубация/мытье пластины ELISA
    1. Накройте микроплиту клейкой пленкой и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    2. Удалить пленку, тщательно аспирировать и передать содержание каждого хорошо в получателя, содержащего 2,5% натрия гипохлорит раствор.
    3. К каждому колодцу добавьте 300 кл.л стирального буфера.
    4. Тщательно аспирируйте и перенесите содержимое каждой скважины в реципиент, содержащий 2,5% растворгия гипохлорита натрия.
    5. Повторите шаги 5.4.3 и 5.4.4 5 раз, чтобы удалить несвязанный антиген и сохранить тримеры белка G, привязанные к покрытому антителу (mAb D1).
    6. Перевернуть микроплиту и дайте ей высохнуть на адсорбентской бумаге при комнатной температуре в течение 1 мин.
  5. Связывание пероксидазы конъюгированного mAb-D1
    1. Распределите 200 л на скважину рекомендуемого разбавления (1/2000) пероксидазы с маркировкой mAb-D1 в разбавителе (приблизительная концентрация 1 мкг/мл). Рекомендуемая концентрация указана для каждой партии mAb-D1 и должна периодически проверяться с положительным контролем.
    2. Накройте микроплиту клейкой пленкой и инкубировать в течение 1 ч при 37 градусах Цельсия.
    3. Удалить пленку, тщательно аспирировать и передать содержание каждого хорошо в получателя, содержащего 2,5% натрия гипохлорит раствор.
    4. Добавьте к каждой скважине, 300 л стирального буфера.
    5. Тщательно аспирируйте и перенесите содержимое каждой скважины в реципиент, содержащий 2,5% растворгия гипохлорита натрия.
    6. Повторите шаги 5.5.4 и 5.5.5 пять раз, чтобы удалить несвязанные антитела с маркировкой пероксидаза (mAb D1).
    7. Перевернуть микроплиту и дайте ей высохнуть на адсорбентской бумаге при комнатной температуре в течение 1 мин.
  6. Откровение с использованием субстрата-хромогена
    1. Распределите 200 л на скважину субстрата-хромогенного раствора.
    2. Печать микроплиты с пленкой и инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. Интенсивность которого пропорциональна количеству перекисных антител с маркировкой пероксидаза (mAb D1).
    3. Остановите реакцию, добавив 50 л остановок раствора на скважину.
    4. Тщательно протрите дно микроплиты и поместите ее в спектрофотометр, чтобы определить оптическую плотность (OD) на уровне 492 нм всех используемых скважин: отрицательный контроль (пустой), эталонную вакцину и испытанную вакцину.
    5. Сбор данных OD как формат файла .xls s или .xlsx для анализа.
  7. Нарисуйте кривую эталонной вакцины, содержание тримерического гликопротеина, как функцию оптической плотности (492 нм)
    1. Рассчитайте средний ОД на уровне 492 нм для каждого дубликата при различных разбавлениях эталонной вакцины (колодцы G1/G2 до A1/A2 в таблице 2)
    2. Вычтите средний OD Бланка (колодцы, H1/H2 в таблице 2)из каждого расчетного среднего OD.
    3. Участок результирующих значений OD на вертикальной оси (линейная шкала) и соответствующую концентрацию в гликопротеиновых тримеров (нг/мл) на горизонтальной оси (логарифмическая шкала).
    4. Нарисуйте эталонную кривую, соединив очки(рисунок 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В следующем примере используется эталонная вакцина Lot 09, состоящая из очищенных инактивированных частиц вируса бешенства (pV-вакцина. Содержание гликопротеинов (10 мкг/мл) в этом виде было установлено после определения общего количества вирусных белков (тест BCA) и оценки процента гликопротеина СДС-полиакриламид гель электрофорез. Кроме того, можно использовать откалиброванную эталонную справочную вакцину, например,6-й Международный стандарт ВОЗ (ИС) по вакцине против бешенства (код NIBSC: 07/162).

В таблице 3 показаны значения OD (492 нм) для типичного эксперимента. Используя эти значения, эталонная кривая вакцины была нарисована путем построения (1) среднего ОД (минус среднее ОД пустоты) при различных разбавлениях эталонной вакцины на вертикальной оси (линейная шкала); (2) концентрация тримеров гликопротеина (нг/мл) на горизонтальной оси (логарифмическая шкала)(рисунок 1).

Содержание гликопротеинов в испытанной вакцине оценивается по сравнению с этой эталонной кривой вакцины. Оценка является точной для разбавления испытанной вакцины дает среднее значение OD в линейной части кривой эталонной вакцины. В представленном эксперименте(Рисунок 1), линейная часть составляет от 1 до 2 OD(Таблица 3).

Разбавление 1/40 испытанной вакцины со средним ОД для дубликатов образцов 1,534 подходит для дальнейшей оценки. Когда этот ОД построен горизонтально до точки пересечения с кривой эталонной вакцины, вертикальная проекция на оси x соответствует 500 нг/мл гликопротеина. Учитывая разбавление, испытанная вакцина содержит

40 х 500 нг/мл 20 мкг/мл тримерного гликопротеина.

В настоящее время нет международного подразделения ELISA по содержанию гликопротеинов RABV. Тем не менее, in vivo потенции эталонной вакцины, в международных единиц (IU/mL), была создана с использованием теста NIH по сравнению с6-м Международным стандартом ВОЗ (код NIBSC: 07/162)4. Следовательно, сравнение средних ОД между эталонной и испытанной вакциной не только позволяет измерить количество тримерного гликопротеина испытанной вакцины, но и оценивает потенцию in vitro, оцениваемую в эквивалентной международной единице (EIU/mL).

Используя метод ELISA, описанный здесь, французский OMCL (ANSM) провел мониторинг содержания гликопротеинов более чем 1000 партий вакцины против бешенства человека, которые будут выпущены на рынке, и сравнил тест NIH, проведенный на сайте производителя4. Высокая изменчивость теста NIH, из-за неоднородности у мышей деформации и вызов процедуры38, предотвратить статистическую корреляцию между двумя тестами. Тем не менее, согласование в профиле результатов и те же выводы проход / неудачу были получены с помощью in vitro и in vivo анализы4. Это соответствие подтверждает, что родные тримеры гликопротеина признаны mAb-D134,39 представляют собой основной вирус бешенства иммуноген индуцирования VNAbs во время вакцинации17. Эти VNAbs способны защитить мышей от внутримозговой проблемы теста NIH. В заключение, in vitro оценка содержания гликопротеина бешенства является привлекательной альтернативой тесту NIH оценить потенцию вакцины против бешенства.

Буферы и реагенты Подготовка
Буфер покрытия
(Карбонатный буфер 50мМ рН-9,6)		 Добавить карбонат натрия 50 мМ (Na2CO3-10H2O) в бикарбонат натрия 50 мМ (NaHCO3) до желаемого рН (около 1/10 объем бикарбоната натрия)
Буфер пассивации 0,3% Бовин сыворотки Альбумин (BSA, фракция V), 5% сахарозы в карбонатном буфере 50 мМ рН 9,6
10x фосфат буферизированный солен рН-7 (PBS 10x) NaCl 80 г, KCl 2 г, Na2PO4-12H2O 11.33 г, KH2PO4 2g в 1l дистиллированной воды. Отрегулируйте рН-7 с 4N NaOH
Стиральный буфер 0.05% Tween в 1x PBS
Растворителем                                                  0.5% Бовин сыворотки Альбумин (фракция V), 0,05% Tween в 1x PBS (настроить рН до 7 из-за подкисления BSA)
Цитрат буфера pH-5.6
(для субстрата пероксидаза)		 11.67 г цитрата три натрия-2H2O (Na3C6H5O7-2H20), 2.17 г Лимонная кислота-1H20 в 1L дистиллированной воды
Субстратно-хромогенный раствор 50 мг Орто-фениленовой диаминовой таблетки, 0,1% перекись водорода 30% (110 vol) в 25 мл цитратбуферного рН 5,6
Остановка решения
(4N серная кислота)		 10 мл H2SO4 36N в 80 мл охлаждемой дистиллированной воды. Разбавление должно осуществляться в ледяной ванне

Таблица 1. Буферы, используемые в асссе.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A Ref. Вакцина 1/640 Ref. Вакцина 1/640 Испытанная вакцина 1/1280 Испытанная вакцина 1/1280
B Ref. Вакцина 1/320 Ref. Вакцина 1/320 Испытанная вакцина 1/640 Испытанная вакцина 1/640
C Ref. Вакцина 1/160 Ref. Вакцина 1/160 Испытанная вакцина 1/320 Испытанная вакцина 1/320
D Ref. Вакцина 1/10 Ref. Вакцина 1/10 Испытанная вакцина 1/160 Испытанная вакцина 1/160
E Ref. Вакцина 1/40 Ref. Вакцина 1/40 Испытанная вакцина 1/80 Испытанная вакцина 1/80
F Ref. Вакцина 1/20 Ref. Вакцина 1/20 Испытанная вакцина 1/40 Испытанная вакцина 1/40
Г Ref. Вакцина 1/10 Ref. Вакцина 1/10 Испытанная вакцина 1/20 Испытанная вакцина 1/20
H Пустой Пустой Испытанная вакцина 1/10 Испытанная вакцина 1/10
Справочная вакцина Лот 09 разбавления Концентрация (нг/мл)
1/640 15.625
1/320 31.25
1/160 62.5
1/80 125
1/40 250
1/20 500
1/10 1000

Таблица 2: Микроплит план для бешенства гликопротеин титрации анализ и разбавления для ссылки и испытания вакцин, используемых в анализе.

Справочная вакцина Лот 09 разбавления Концентрация (нг/мл) Испытанная вакцина разбавления Колонка OD 1 Колонка OD 2 OD Средний Ссылка OD среднее - Пустое оД означает
1/640 15.625 1/1280 0.17 0.16 0.165 0.0825
1/320 31.25 1/640 0.233 0.238 0.2355 0.153
1/160 62.5 1/320 0.378 0.387 0.3825 0.3
1/80 125 1/160 0.619 0.644 0.6315 0.549
1/40 250 1/80 1.006 1.077 1.0415 0.959
1/20 500 1/40 1.559 1.674 1.6165 1.534
1/10 1000 1/20 2.245 2.307 2.276 2.1935
Пустой Пустой 1/10 0.078 0.087 0.0825

Таблица 3. Результаты, полученные на уровне492 нм для построения эталонной кривой

Figure 1
Рисунок 1: Справочная кривая, показывающая содержание тримерического гликопротеина в качестве функции оптической плотности (492 нм) для эталонной вакцины.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эпитоп, признанный mAb-D1, находится в антигенном участке III гликопротеина RABV, который является не только иммунодоминирующим для индукции VNAbs, но и участвует в нейровирулении, патогенности40,41 и распознавании рецепторов42. Существует еще один важный антигенный сайт вдоль гликопротеина, сайт II43, против которого несколько MAbs были изолированы, такие как mAb-WI-111235. Они также могут быть использованы в аналогичных экспериментах.

Одно ограничение этого метода in vitro ELISA заключается в необходимой консервации эпитопа, признанного использованным mAb на штамме вируса бешенства для тестирования. До сих пор все классические штаммы, используемые для вакцин против бешенства человека, признаются mAb-D1. Более широкое разнообразие штаммов бешенства, используемых в вакцинах для животных, может представлять собой проблему в будущем. Однако, как упоминалось ранее, тот же анализ может быть применен с помощью различных mAbs признавая различные антигенные участки гликопротеина RABV для покрытия и обнаружения. Это позволит обойти проблему35.

Другой чувствительной точкой этого метода, количественной тримерической форме гликопротеина RABV, является возможное влияние рН и температуры на обратимое преобразование конформации14. Эти параметры учитываются в предлагаемом протоколе.

Таким образом, количественная оценка высокоиммуногенного эпитопа правильно сложенных тримеров гликопротеина методом in vitro ELISA представляется столь же эффективной, как тест NIH для измерения способности партии вакцины вызывать гуморальный иммунитет против вирусной инфекции бешенства. Кроме того, метод ELISA может дискриминировать субпотенциальные партии вакцины, в качестве или количестве, от мощных4,35. Последним шагом, прежде чем предложить такой анализ in vitro ELISA, чтобы заменить тест NIH, является организация международного совместного исследования по его совершенствованию и стандартизации.

Семинар Межучрежденческого координационного комитета по валидации альтернативных методов (ICCVAM) озаглавленный Международный семинар по альтернативным методам сокращения, уточнения и замены использования животных в вакцинах потенции и безопасности испытаний (Ames, сентябрь 2010)44, пришел к выводу, что тест NIH должны быть заменены альтернативные в пробирке тест оценки вакцины иммуно-генитности и в состоянии проводить различие между мощными и немощными. Другой семинар Европейского партнерства по альтернативам тестированию на животных (EPAA) в 201245 решил, что стандартизированный сэндвич ELISA, откалиброванный против текущего международного стандарта эмблизма, будет идеальной альтернативой для тестирования на вакцину против бешенства. После, международное совместное предварительное исследование проверки, которая включала как производителей, так и регулирующих органов, по сравнению различных конструкций ELISA, используемых производителями и их национальных лабораторий контроля для выпуска партии за их способность дискриминировать суб-мощных от мощных партий вакцины35. Конструкция ELISA, объединяющая mAb-D1 (антигенный сайт III) и другой mAb-WI-1112 (антигенный сайт II), была предложена Европейским управлением по качеству лекарственных средств и медицинской помощи (ЭДЗМ) для предстоящего международного совместного исследования под эгидой Программы биологической стандартизации (БСП). Это показывает (1), что несколько комбинаций mAbs для микроплитного покрытия и обнаружения могут быть использованы в качестве альтернативы in vitro in vivo NIH и (2), что эти комбинации могут зависеть от штамма вакцины RABV для тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Д-р Сильви Моржо и д-р Jean-Michel Chapsal должны быть признаны за их ключевое участие в создании анализа ELISA по вакцинам партий и организовать международные семинары и совместные исследования. Мы благодарим Сабрину Кали за критическое прочтение рукописи. Д-р Пьер Перрен отвечал за изоляцию и характеристику mAb-D1. Эта работа в основном поддерживается за счет средств Института Пастера.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific 10445753 if titrating live virus
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 µL, MAXISORP ThermoFisher Scientific 439454 good for binding to the loaded antibody
Equip Labo Polypropylene Laboratory Fume Hood ThermoFisher Scientific 12576606 for the preparation of sulfuric acid
Immunology Plate Strong
Adsorption MAXISORP Flat Bottom
Well F96		 Dutscher 55303 good for binding to the loaded antibody
Microplate Sealing Tape(100 sheets) ThermoFisher Scientific 15036
Microplate  single mode reader Sunrise TECAN
Microplate shaker-incubator Dutscher 441504
Microplate washer Wellwash ThermoFisher Scientific 5165000
Multichannel pipette (30-300 µL) 12 channels ThermoFisher Scientific 4661180N
Single Channel pipettes (Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL) ThermoFisher Scientific 4700880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seligmann, E. B. The NIH test for potency. Laboratory Techniques in Rabies. , 3rd Edition, WHO Geneva. 279-286 (1973).
  2. Annex 2. Recommendations for inactivated rabies vaccine for human use produced in cell substrates and embryonated eggs. WHO Technical Report Series. 941, WHO Geneva. 83-132 (2007).
  3. Rabies vaccine for human use prepared in cell cultures. European Pharmacopoeia. , (2008).
  4. Gibert, R., Alberti, M., Poirier, B., Jallet, C., Tordo, N., Morgeaux, S. A relevant in vitro ELISA test in alternative to the in vivo NIH test for human rabies vaccine batch release. Vaccine. 31, 6022-6029 (2013).
  5. Stokes, W., et al. Report on the international workshop on alternative methods for human and veterinary rabies vaccine testing: state of the science and planning the way forward. Biologicals. 40 (5), 369-381 (2012).
  6. Krämer, B., Bruckner, L., Daas, A., Milne, C. Collaborative study for validation of a serological potency assay for rabies vaccine (inactivated) for veterinary use. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2, 37-55 (2010).
  7. Krämer, B., Kamphuis, E., Hanschmann, K. M., Milne, C., Daas, A., Duchow, K. A multi-dose serological assay suitable to quantify the potency of inactivated rabies vaccines for veterinary use. Biologicals. 41, 400-406 (2013).
  8. Fitzgerald, E. A., Gallagher, M., Hunter, W. S., Seligmann, E. B. Jr Use of the antibody assay in immunized mice for the determination of rabies vaccine potency. Developments in Biological Standardization. 40, 183-186 (1978).
  9. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. WHO activities towards the three Rs in the development and control of biological products. Replacement, reduction and refinement of animal experiments in the development and control of biological products. , Karger. 31-39 (1996).
  10. Behr-Gross, M. E., Spieser, J. M. Contributions of the European OMCL Network and Biological Standardisation Programme to animal Welfare. ALTEX-Alternatives to Animal Experimentation. 23, 21-28 (2006).
  11. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of European Union. L276, 33-79 (2010).
  12. Whitt, M. A., Buonocore, L., Prehaud, C., Rose, J. K. Membrane fusion activity, oligomerization and assembly of the rabies virus glycoprotein. Virology. 185 (2), 681-688 (1991).
  13. Gaudin, Y., Ruigrok, R. W., Tuffereau, C., Knossow, M., Flamand, A. Rabies virus glycoprotein is a trimer. Virology. 187, 627-632 (1992).
  14. Roche, S., Gaudin, Y. Characterization of the equilibrium between the native and fusion-inactive conformation of rabies virus glycoprotein indicates that the fusion complex is made of several trimers. Virology. 297 (1), 128-135 (2002).
  15. Desmézières, E., Maillard, A. P., Gaudin, Y., Tordo, N., Perrin, P. Differential stability and fusion activity of Lyssavirus glycoprotein trimers. Virus Research. 91 (2), 181-187 (2003).
  16. Koraka, P., et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice. Vaccine. 32 (36), 4644-4650 (2014).
  17. Wiktor, T., Gyorgy, E., Schlumberger, D., Sokol, F., Koprowski, H. Antigenic properties of rabies virus components. Journal of Immunology. 110, 269-276 (1973).
  18. Gamoh, K., Senda, M., Itoh, O., Muramatsu, M., Hirayama, N., Koike, R., et al. Use of ELISA for in vitro potency test of rabies vaccines for animal use. Biologicals. 24, 95-101 (1996).
  19. Dietzschold, B., Wiktor, T., Wunner, W., Varrichio, A. Chemical and immunological analysis of the rabies soluble glycoprotein. Virology. 124, 330-337 (1983).
  20. Fitzgerald, E., Green, O., Seligmann, E. Rabies vaccine potency testing: a comparison between the antibody-binding test and the NIH test. Symposia Series in Immunobiological Standard. 21, 300-307 (1974).
  21. Barth, R., Groβ-Albenhausen, E., Jaeger, O., Milcke, L. The antibody-binding test, a useful method for quantitative determination of inactivated rabies virus antigen. Journal of Biological Standardization. 9, 81-89 (1981).
  22. Ferguson, M., Schild, G. A single-radial-immunodiffusion technique for the assay of rabies glycoprotein antigen: application for the potency tests of vaccines against rabies. Journal of General Virology. 59, 197-201 (1982).
  23. Atanasiu, P., Perrin, P., Delagneau, J. F. Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. Developments in Biological Standardization. 46, 207-215 (1980).
  24. van der Marel, P., van Wezel, A. Quantitative determination of rabies antigen by ELISA. Developments in Biological Standardization. 50, 267-275 (1981).
  25. Adamovicz, P., Aguillon, F., David, A., Le Fur, R., Mazert, M. C., Perrin, P., et al. The use of various immunochemical, biochemical and biological methods for the analysis of rabies virus production in tissue cultures. Developments in Biological Standardization. 55, 191-197 (1984).
  26. Lafon, M., Perrin, P., Versmisse, P., Sureau, P. Use of monoclonal antibody for quantification of rabies vaccine glycoprotein by enzyme immunoassay. Journal of Biological Standardization. 13, 295-301 (1985).
  27. Thraenhart, O., Ramakrishnan, K. Standardization of an enzyme immunoassay for the in vitro potency assay of inactivated tissue culture rabies vaccines: determination of the rabies virus glycoprotein with polyclonal antisera. Journal of Biological Standardization. 17, 291-309 (1989).
  28. Council of Europe. Official Authority Batch release of Rabies vaccines Guideline. , PA/PH/OMCL (11) 173 DEF (2019).
  29. Ferguson, M., Seagroatt, V., Schild, G. A collaborative study on the use of single radial immunodiffusion for the assay of rabies virus glycoprotein. Developments in Biological Standards. 12, 283-294 (1984).
  30. Perrin, P., Morgeaux, S., Sureau, P. In vitro rabies vaccine potency appraisal by ELISA: advantages of the immunocapture method with a neutralizing anti-glycoprotein monoclonal antibody. Biologicals. 18, 321-330 (1990).
  31. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., Osterhaus, A. D. Rabies vaccine potency control: comparison of ELISA systems for antigenicity testing. Journal of Virological Methods. 58, 111-119 (1996).
  32. Rooijakkers, E. J., Uittenbogaard, J. P., Groen, J., van Herwijnen, J., Osterhaus, A. D. Development and evaluation of alternative testing methods for the in vivo NIH potency test used for the quality control of inactivated rabies vaccines. Brown, F., Cussler, K., Hendriksen, C. , Karger. 137-145 (1996).
  33. Fournier-Caruana, J., et al. Inactivated rabies vaccine control and release: use of an ELISA method. Biologicals. 31, 9-16 (2003).
  34. Sissoëff, L., Mousli, M., England, P., Tuffereau, C. Stable trimerization of recombinant rabies virus glycoprotein ectodomain is required for interaction with the p75NTR receptor. Journal of General Virology. 86, 2543-2552 (2005).
  35. Morgeaux, S., et al. Replacement of in vivo human rabies vaccine potency testing by in vitro glycoprotein quantification using ELISA - Results of an international collaborative study. Vaccine. 35 (6), 966-971 (2017).
  36. Lafon, M. Techniques for the production, screening and characterisation of monoclonal antibodies. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 133-144 (1996).
  37. Perrin, P. Techniques for the preparation of rabies confugates. Laboratory techniques in rabies, 4th Edition. Meslin, F. X., Kaplan, M. N., Kopowski, H. , WHO. Geneva. 433-444 (1996).
  38. Barth, R., Diderrich, G., Weinmann, E. NIH test, a problematic method for testing potency of inactivated rabies vaccine. Vaccine. 6, 369-377 (1988).
  39. Jallet, C., et al. Chimeric lyssavirus glycoproteins with increased immunological potential. Journal of Virology. 73, 225-233 (1999).
  40. Dietzschold, B., et al. Characterization of an antigenic determinant of the glycoprotein that correlates with pathogenicity of rabies virus. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 80, 70-74 (1983).
  41. Seif, L., Coulon, P., Rollin, P., Flamand, A. Rabies virulence: effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site III of the glycoprotein. Journal of Virology. 53, 926-934 (1985).
  42. Lafon, M. Rabies virus receptors. Journal of Neurovirology. 11, 82-87 (2005).
  43. Benmansour, A., Leblois, H., Coulon, P., Tuffereau, C., Gaudin, Y., Flamand, Y., Lafay, A. Antigenicity of the rabies virus glycoprotein. Journal of Virology. 65, 4198-4203 (1991).
  44. Rabies Vaccine Workshop Summary. , http://ntp.niehs.nih.gov/iccvam/meetings/rabiesvaccwksp-2011/rabiesvaccinewkspsumm-30nov11.pdf (2011).
  45. De Mattia, F., et al. The Vaccines Consistency Approach Project: an EPAA initiative. Pharmeuropa Bio & Scientific Notes. 2015, 30-56 (2015).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 159 Потенция вакцины против бешенства тест NIH метод ELISA моноклональные антитела mAb-D1 триметры гликопротеина содержание гликопротеина
В Vitro ELISA тест для оценки бешенства вакцины потенции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA … More

Jallet, C., Tordo, N. In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency. J. Vis. Exp. (159), e59641, doi:10.3791/59641 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter