Summary
يوصف هنا هو بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر.
Abstract
وقد أصبحت الكائنات الحية الدقيقة المعوية البشرية في الآونة الأخيرة هدفا هاما للبحوث في مجال تعزيز صحة الإنسان والوقاية من الأمراض. وبالتالي، أصبحت التحقيقات في التفاعلات بين الاندوبايوتكس (مثل الأدوية والبريبايوتكس) وميكروبيوتا الأمعاء موضوعا ً بحثيًا مهمًا. ومع ذلك، في التجارب الحية مع المتطوعين الإنسان ليست مثالية لمثل هذه الدراسات بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. ونتيجة لذلك، تم استخدام النماذج الحيوانية لتقييم هذه التفاعلات في الجسم الحي. ومع ذلك، لا تزال الدراسات النموذجية الحيوانية محدودة باعتبارات أخلاقيات البيولوجيا، بالإضافة إلى اختلاف التراكيب والتنوعات في الكائنات الحية الدقيقة في الحيوانات مقابل البشر. استراتيجية بحثية بديلة هي استخدام تجارب التخمير الدفعية التي تسمح بتقييم التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء في المختبر. لتقييم هذه الاستراتيجية، تم استخدام ثنائي ة البكتيريا (بيف) اكسوبوليساكاريدس (EPS) كممثل xenobiotic. ثم، تم التحقيق في التفاعلات بين Eps BIF وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام عدة طرق مثل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC)، والتحليل التركيبي المجتمعي البكتيري مع تسلسل الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية من الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs). يقدم هنا بروتوكول للتحقيق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية باستخدام أنظمة التخمير دفعة في المختبر. والأهم من ذلك، يمكن أيضا تعديل هذا البروتوكول للتحقيق في التفاعلات العامة بين بطانة الرحم الأخرى وميكروبيوتا الأمعاء.
Introduction
تلعب الكائنات المجهرية في الأمعاء دورًا هامًا في أداء الأمعاء البشرية وفي صحة المضيف. وبالتالي، أصبحت ميكروبيوتا الأمعاء مؤخرا هدفا هاما للوقاية من الأمراض والعلاج1. وعلاوة على ذلك، تتفاعل بكتيريا الأمعاء مع الخلايا المعوية المضيفة وتنظم العمليات الأساسية المضيفة، بما فيذلك الأنشطة الأيضية، وتوافر المواد الغذائية، وتعديل الجهاز المناعي، وحتى وظيفة الدماغ وصنع القرار 2،3 . إن بطانة الرحم لديها إمكانات كبيرة للتأثير على التركيب البكتيري وتنوع ميكروبيوتا الأمعاء. وهكذا، جذبت التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتاالأمعاء البشرية زيادة الاهتمام البحثي 4،5،6،7،8،9.
من الصعب تقييم التفاعلات بين الانبوبيوتكس وميكروبيوتا الأمعاء البشرية في الجسم الحي بسبب أخلاقيات البيولوجيا والقيود الاقتصادية. على سبيل المثال، لا يمكن إجراء التجارب التي تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية دون إذن من إدارة الغذاء والدواء، وتوظيف المتطوعين مكلف. وبالتالي، كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية لمثل هذه التحقيقات. ومع ذلك، فإن استخدام النماذج الحيوانية محدود بسبب اختلاف التراكيب المجهرية والتنوع في المجتمعات الحيوانية مقابل المجتمعات المرتبطة بالإنسان. وهناك طريقة بديلة في المختبر لاستكشاف التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية من خلال استخدام تجارب الثقافة دفعة.
إكسوبوليساكاريدس (EPSS) هي البريبايوتكس التي تسهم بشكل كبير في الحفاظ على صحة الإنسان10. يمكن أن تظهر EPSs المتميزة التي تتكون من تركيبات وهياكل أحادية السكريات وظائف متميزة. وقد حددت التحليلات السابقة تكوين BIF EPSs، والتي هي xenobiotic ممثل المستهدفة في الدراسة الحالية11. ومع ذلك، لم يتم النظر في الآثار الأيضية المرتبطة بالمضيف فيما يتعلق بتكوين EPS والتنوع.
يستخدم البروتوكول الموضح هنا الميكروبيوتا البرازية من 12 متطوعًا لتخمير الـ Bif EPSs. ثم يتم استخدام الكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة (TLC)، وتسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S rRNA، والكروماتوغرافيا الغازية (GC) في تركيبة للتحقيق في التفاعلات بين EPSs وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. مزايا متميزة من هذا البروتوكول بالمقارنة مع التجارب في الجسم الحي هي انخفاض تكلفته وتجنب آثار التدخل من التمثيل الغذائي للمضيف. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف في دراسات أخرى تحقق في التفاعلات بين بطانة الرحم وميكروبيوتا الأمعاء البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في جامعة هونان للعلوم والهندسة (هونان، الصين)، وجامعة تشجيانغ غونغشانغ (تشجيانغ، الصين).
1. إعداد البكتيريا
- إعداد مرق ثنائي البكي المتوسط
- الجمع بين المكونات التالية في 950 مل من الماء المقطر: استخراج اللحوم، 5 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 5 غرام / لتر. الكازين ببتون، 10 غرام / لتر؛ صوتوني، 5 غرام / لتر؛ الجلوكوز، 10 غرام / لتر؛ K2HPO4,2.04 g/L; MgSO4·7H2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; حمض الكلس، 5 غرام/ لتر؛ توين 80، 1 مل؛ محلول الملح، 40 مل(CaCl 2.2H2O، 0.25 غرام / لتر؛ KH2PO4,1 g/L; NaHCO3، 10 غرام / لتر؛ (أ) حمض الكلى، 2 غرام/لتر)؛ وريرازورين، 0.4 مل (2.5 ملغ / لتر). ضبط الحموضة إلى 6.8 مع 2 M هيدروكسيد الصوديوم.
- الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح للمرق لتبرد لدرجةحرارة الغرفة (RT) في ظل الظروف اللاهوائية (10٪ H 2، 10٪ CO2،80٪ N2). إضافة فلتر معقمة سيستين-حمض الهيدروكلوريك (0.5 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
- إضافة aliquot (50 درجة مئوية) من لونغوم بيفيدوباكتريوم المجمدة إلى أنبوب الثقافة مع 5 مل من مرق ثنائي الفينيل تريومد المتوسط في ظل ظروف لاهوائية، ثم الثقافة في حاضنة اللاهوائية لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية.
2. إعداد EPSs ثنائي الفيدوبكتيرية
- إعداد PYG أجار المتوسطة
- الجمع بين ما يلي: peptone، 20 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 10 غرام / لتر. الجلوكوز، 5 غرام / لتر. حمض الكلس، 0.08 غرام/ لتر؛ CaCl2، 0.008 غرام / لتر؛ MgSO4·7H2O, 0.008 g/L; K2HPO4,0.04 g/L; KH2PO4,0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 جم/لتر; أجار، 12 غرام / لتر. ضبط الحموضة إلى 7.2 باستخدام 10 M هيدروكسيد الصوديوم.
- الأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وبارد إلى ~ 50 درجة مئوية. ثم، لكل 1 لتر من المتوسط، إضافة 0.5 مل من تصفية معقمة فيتامين K1 الحل (1 غرام من فيتامين ك1 المذاب في 99 مل من 99٪ الإيثانول)، 5 مل من محلول الهامين (0.5 غرام من الهامين المذاب في 1 مل من 1 مول / L هيدروكسيد الصوديوم ، ثم جلبت ما يصل إلى 100 مل مع الماء المقطر)، و 0.5 غرام من السيستين-حمض الهيدروكلوريك.
- قبل صب لوحات PYG، إضافة فلتر تعقيم 5-برومو-4-كلورو-3-إندول β-D-galactopyranoside (X-غال، 0.06 غرام / لتر)، LiCl·3H2O (5.7 غرام / لتر) وmupirocin (5 ملغ / لتر) إلى المتوسط.
ملاحظة: X-Gal و LiCl.3H2O تسمح بتحديد مستعمرات B. longum على لوحات عن طريق تغييرات التلوين.
- تلقيح 20 ميكرولتر من سلالات الطول B.(الخطوة 1.2) إلى لوحات PYG ووضعها في حاضنة لاهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
- جمع المستعمرات البكتيرية المخاطية من لوحات PYG باستخدام مغرفة وزنها، ثم إعادة تعليق تماما في 10 مل من محلول الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) باستخدام مذبذب دوامة.
ملاحظة: يجب إعادة تعليق الخلائط البكتيرية وEPS تماما عن طريق الدوامة أو الأنابيب صعودا وهبوطا مرارا وتكرارا حتى يتم حل الألياف تماما في PBS. - الطرد المركزي التعليق في 6000 × ز لمدة 5 دقائق.
- نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد ومزيج تماما مع ثلاثة مجلدات من الإيثانول الباردة 99٪ عن طريق تكرار انعكاس ومزج.
- طرد مركزي الخليط في 6000 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة تماما supernatants.
- إزالة الرواسب من أنابيب الطرد المركزي عن طريق كشط وتجفيف مقتطفات EPS بين عشية وضحاها باستخدام فراغ السرعة.
3. إعداد التخمير المتوسطة
- إعداد الثقافة الأساسية المتوسطة السادسة
- الجمع بين ما يلي: peptone، 3 غرام / لتر. التربتون، 3 غرام / لتر. الخميرة استخراج، 4.5 غرام / لتر. المخاط، 0.5 غرام / لتر. الأملاح الصفراوية رقم 3، 0.4 غرام / لتر؛ حمض الكلة، 4.5 غرام/لتر؛ KCl, 2.5 غرام/لتر; MgCl2·6H2O, 4.5 g/L; 1 مل توين 80؛ CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4,0.4 g/L; MgSO4·7H2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H2O, 0.32 g/L; فيسو4·7H2O، 0.1 غرام / لتر؛ CoSO4·7H2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H2O, 0.01 g/L; وNiCl2·6H2O, 0.092 g/L. ضبط الحموضة إلى 6.5 مع 1 M حمض الهيدروكلوريك.
- إعداد الهيمين والسيستين كما هو الحال في القسم 2.1 وإضافة بعد الأوتوكلاف والتبريد.
- إعداد وسائل الإعلام الثقافية التي تحتوي على مصادر الكربون المختلفة مع وسائل الإعلام الأساسية السادس. قبل الأوتوكلاف، أضف 8 جم/لتر من ألياف Eps من Bif إلى متوسط VI، مع المجموعة VI_Bif. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة 8 غرام / لتر النشا إلى متوسط السادس لتمثيل المجموعة VI_Starch. وأخيراً، يُستخدم المتوسط السادس دون إضافة مصدر كربوني كعنصر تحكم (المجموعة السادسة).
ملاحظة: يتم حل EPS BIF والنشا أولا في الماء الساخن باستخدام المحرض المغناطيسي، ثم مختلطة مع وسيط ة VI أعدت. - الأوتوكلاف جميع وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة والسماح لتبرد إلى RT.
- نقل عينة فرعية (5 مل) من كل أنابيب متوسطة إلى ثقافة في حاضنة لاهوائية، وتخزين وسائل الإعلام المتبقية في 4 درجة مئوية.
4. إعداد عينة البراز البشري
- جمع عينات البراز الطازجة مباشرة بعد التغوط الطازجة من المتطوعين الإنسان البالغين الأصحاء باستخدام حاويات البراز، واستخدامها في وقت لاحق لإعداد الطين.
ملاحظة: قبل جمع العينات، يجب فحص جميع المتطوعين لضمان عدم تلقي المضادات الحيوية، والبروبيوتيك، أو العلاجات البريبايوتيك لمدة 3 أشهر على الأقل قبل التبرع بالعينات. وبالإضافة إلى ذلك، يجب على جميع الجهات المانحة أن تقدم موافقة خطية مستنيرة. - نقل عينة البراز الطازجة (1 غرام) إلى 10 مل من 0.1 M PBS اللاهوائية (pH 7.0) في أكواب زجاجية، ثم استخدام قضبان الزجاج لإعداد الطين 10٪ (ث / الخامس).
- استخدام غربال 0.4 m لتصفية الطين البراز. ثم، استخدم عينة فرعية من الطين المصفاة لتلقيح تجارب تخمير ثقافة الدفعة، وتخزين الباقي في -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.
ملاحظة: تُجرى الخطوات من 4.2 إلى 4-3 في غرفة لاهوائية.
5. في المختبر دفعة التخمير
- إضافة الطين البراز المصفاة (500 درجة مئوية) إلى التخمير المتوسطة أعدت في الخطوة 3.2 داخل غرفة اللاهوائية، ثم حضانة في 37 درجة مئوية.
- جمع 2 مل من العينات المخمرة في 24 ساعة و 48 ساعة في الغرفة اللاهوائية ومن ثم الطرد المركزي خارج الغرفة في 6000 × ز لمدة 3 دقائق.
- نقل بعناية supernatants إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد الذي سيتم استخدامه لتحليل تدهور السكريات وقياسات الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFAs).
- تخزين الكريات الطرد المركزي في -80 درجة مئوية واستخدامها في وقت لاحق لاستخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري.
6. تحلل EPS بواسطة ميكروبيوتا البراز البشري
- تحميل 0.2 ميكرولتر من supernatants المخمرة على هلام السيليكا المغلفة مسبقا-60 لوحات الألومنيوم TLC، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
- تطوير لوحات في 20 مل من حمض الفورميك / ن-البوتانول / المياه (6:4:1، v:v:v) الحل والجافة باستخدام مجفف الشعر.
- نقع لوحات في كاشف orcinol لصبغ، ثم تجف باستخدام مجفف الشعر.
- إعداد الكواشف orcinol عن طريق حل 900 ملغ من ليشنول في 25 مل من الماء المقطر ثم إضافة 375 مل من الإيثانول. في وقت لاحق، ينبغي إضافة حمض الكبريتيك المركزة ببطء والحل مختلطة تماما.
- تُسخّن الأطباق عند درجة حرارة 120 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في فرن الخبز وتقيّم تدهور EPS بقياس نطاقات TLC.
7. آثار EPS على ميكروبيوتا الأمعاء البشرية
- تجميد ذوبان عينات البراز الأصلي أعدت في الخطوة 4.3 والعينات المخمرة أعدت في الخطوة 5.4.
- استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري (gDNA) من جميع العينات باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجينومي البكتيري البراز بناء على تعليمات الشركة المصنعة.
- تحديد تركيزات الحمض النووي، والنزاهة، وتوزيعات الحجم باستخدام مقياس الطيف الضوئي الجزئي والكهربائي هلام أجار.
- إجراء PCR من الجينات البكتيرية 16S rRNA من gDNA المستخرجة باستخدام ما يلي وصفها سابقا إلى الأمام وعكس التمهيديات12:
-التمهيدي إلى الأمام (الباركود التمهيدي 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-التمهيدي العكسي (806R): GGACTACHVGGGTWTAT
استخدم ظروف الدراجات الحرارية التالية:- 94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- 94 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
- 55 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية.
- 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
- كرر 2-4 لمدة 35 دورة
- 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- 4 درجة مئوية عقد حتى إزالة من دورة الحرارية.
- إجراء تسلسل عالي الإنتاجية لمنتجات PCR في شركة تسلسل الحمض النووي باستخدام تحليل مجتمعي ميكروبي فائق الإنتاجية.
- الحصول على تسلسل نظيفة وعالية الجودة باستخدام الرؤى الكمية في علم البيئة الميكروبية (QIIME) خط أنابيب التسلسل13.
- تحديد وحدات التصنيف التشغيلية (OTUs) لتسلسل الجينات rRNA 16S مع أكبر من 97٪ التشابه النيوكليوتيد باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل مجموعة برامج Mothur14.
- اختيار تسلسل تمثيلي من كل OTU واستخدام مصنف RDP جنبا إلى جنب مع قاعدة بيانات تصنيف سيلفا لتصنيف التسلسلات التمثيلية15.
- حساب تغطية جيدة، مقاييس التنوع ألفا (بما في ذلك سيمبسون ومؤشر شانون)، والثراء (لاحظ عدد من OTUs) باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية16.
8- آثار ربحية السهم على إنتاج الميكروبيوتا المعوية البشرية
- إضافة supernatants المخمرة (1 مل) أعدت في الخطوة 5.3 إلى 2 مل أنابيب الطرد المركزي.
- إضافة 0.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك إلى كل من العينات وخلط الحلول جيدا عن طريق الدوامة.
- طرد مركزي الخلائط في 13،000 × غرام لمدة 20 دقيقة ونقل supernatants إلى أنابيب جديدة.
- في الوقت الذي تقوم فيه بإعداد حلول للأسيحاق 120 مل، بروبيوني، بوتيريك، إيزوبوتيريك، حشيشة الهر والأحماض الإيزوفاليريك. ثم، إضافة 1 مل من كل حمض أعدت إلى 1.2 مل من 25٪ (ث / الخامس) حمض الميتافوسفوريك واستخدامها كالكوكتيلات القياسية.
- تصفية العينات باستخدام غشاء 0.22 ميكرومتر.
- الكشف عن تركيزات SCFA باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز عالية الأداء وفقا للبروتوكولات الموصوفة سابقا11،17.
ملاحظة: يتم استخدام عمود غطاء القلب الأقصى (0.25 م× 30 م × 0.25 درجة مئوية) لكروماتوغرافيا الغاز (GC). ثم يتم تحديد تركيزات SCFA كمياً استناداً إلى مناطق الذروة باستخدام طريقة المعيار الداخلي أحادية النقطة في مجموعة برامج حلول GC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن ملاحظة إنتاج EPS المخاطية في الثقافات B. longum على لوحات PYG بعد الحضانة اللاهوائية لمدة 72 ساعة (الشكل1A). المركزية من القصاصات الثقافة، تليها هطول الأمطار الإيثانول والتجفيف، أدى إلى جمع EPS مثل السليلوز (الشكل1B). ثم استخدمت EPS المجففة والنشا القابل للذوبان كمصادر الكربون لثقافات التخمير. تم استخدام TLC لفصل oligosaccharide وتحليل النقاء بسبب انخفاض تكلفتها وسرعة تحول النتائج18. على الرغم من أن معدل تدهور النشا من قبل ميكروبيوتاالبراز البشري كان أسرع من ذلك من EPS BIF (الشكل 2)، لوحظ بوضوح تدهور EPS لعدة عينات EPS.
ثم تم إجراء تحليل تكويني للمجتمع من خلال تسلسل الجينات ذات الإنتاجية العالية 16S وتحليل الإحداثيات الرئيسية (PCoA) للتحقيق في آثار EPS BIF على ميكروبيوتا الأمعاء البشرية. عينات من مجموعات VI_Bif و VI_Starch مجمعة بشكل منفصل عن بعضها البعض في تحليل PCoA (الشكل3A)،مما يشير إلى أن EPS وتوافر النشا شكل بشكل تفاضلي المجتمعات البكتيرية البراز الإنسان. كما تم استخدام حجم تأثير التحليل التمييزي الخطي (LEfSe) للتمييز بين taxa البكتيرية المحددة التي تختلف بين علاجات VI_Bif وVI_Starch. كانت الأجناس كولينديلا، كوبروكوكوس، باراباكتيروديديس، ورودوالزائفة أكثر وفرة بكثير في عينات VI_Bif مما كانت عليه في عينات VI_Starch (الشكل 3B). وعلاوة على ذلك، أُقيمت قياسات من مجلس الإدارة لكي تقيّم عدة مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية إنتاجها بعد إضافة مصادر كربون مختلفة. وشملت SCFAs التي تم قياسها من الثقافات التخمير الخليك, بروبيونيك, إيزوبوتيريك, بوتيريك, isovaleric, والأحماض حشيشة الهر. بعد التخمير لمدة 24 ساعة و 48 ساعة، كانت خمسة من تركيزات SCFA الستة المذكورة أعلاه متشابهة بين العلاجات ولا تختلف إحصائيا بين مجموعات VI_Bif و VI_Starch و VI. ومع ذلك، كانت تركيزات حمض البربيوونيك أعلى بكثير في مجموعة VI_Bif مما كانت عليه في مجموعة VI_Starch (الشكل4).
الشكل 1: ربحية السهم التي تنتجها B. longum.
تم استعادة المجمدة B. لونغوم في مرق Bifidobacterium المتوسطة ومن ثم خطت على لوحات PYG، تليهاالحضانة اللاهوائية في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة (A). تم كشط EPS التي تنتجها الثقافات البكتيرية من الثقافات لوحة، عجلت باستخدامالإيثانول، والمجففة بين عشية وضحاها باستخدام فراغ السرعة (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل TLC لEPS في المختبر وتدهور النشا بواسطة ميكروبيوتا الأمعاء البشرية.
وقد أجري تحليل TLC على عينات 0.2 ميكرولتر جمعت في 24 ساعة و 48 ساعة من كل ثقافة تخمير نمت في ظل الظروف اللاهوائية. السادس, VI_Starch, وVI_Bif تشير إلى وسائل الإعلام السادس, السادس وسائل الإعلام + ملحق النشا, والسادس وسائل الإعلام + EPS الملحق, على التوالي. تشير الأرقام 1-12 إلى عينات بكتيرية برازية من المتطوعين الـ 12 الذين تم استخدامهم لتلقيح تجارب التخمير. تمثل مجموعة التحكم العلاج بدون مكملات كربونإضافية. يتم تعديل هذا الرقم من Yin وآخرون. 11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: آثار توافر ربحية السهم من BIF على مجتمعات ميكروبيوتا الأمعاء البشرية.
(أ) مؤامرة PCoA من أوجه الاختلاف التركيبي المجتمع الأمعاء microbiota استنادا إلى مقياس UniFrac غير المرجح. (ب) تحليل LEfSE من taxa البكتيرية التي كانت وفيرة بشكل تفاضلي بين مجموعات العلاج. وقد استخدم قطع من p < 0.05 لتقييم الأهمية الإحصائية للاختلافات التصنيفية البكتيرية بين المجموعات. أوري يشير إلى ميكروبيوتا الأمعاء من عينات البراز المتطوعين. VI_Bif وVI_Starch تشير إلى ميكروبيوتا الأمعاء من عينات التخمير باستخدام وسائل الإعلام السادس مع EPS والنشا كركائز الكربون، على التوالي. السادس يمثل مجموعة التحكم مع التخمير الأمعاء ميكروبيوتا تلقيح في وسائل الإعلام السادس دون مكملات الكربوهيدرات الأخرى. يتم تعديل هذا الرقم من Yin وآخرون. 11 الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: آثار توافر ربحية السهم على إنتاج SCFA بعد 24 ساعة و48 ساعة من التخمير.
تم الكشف عن الخليك، بروبيونيك، إيزوبوتيريك، بوتيريك، إيسوفالريك، والأحماض حشيشة الهر باستخدام الكروماتوغرافيا الغاز. VI_Bif، VI_Starch، وVI تشير إلى العينات التي تم جمعها بعد الزراعة باستخدام وسائل الإعلام VI + EPS، وسائل الإعلام السادس + النشا، ووسائط VI، على التوالي. تم قياس جميع العينات في ثلاثة أضعاف. تم إنشاء الأرقام باستخدام GraphPad Prism الإصدار 5.01. لوحات تمثل تركيزات الأحماض العضوية داخل كل عينة المخمرة لA، حمض الخليك؛ B، حمض بروبيونيك. C، حمض إيزوبوتيريك؛ D، حمض البوتيريك. E، حمض الإيسوفالريك. وF، حمض حشيشة الهر. تم تعديل هذا الرقم من Yin et al.11الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أحرز تقدم كبير نحو فهم تكوين ميكروبيوتا الأمعاء البشرية وأنشطتها على مدى العقد الماضي. ونتيجة لهذه الدراسات، ظهر مفهوم الهولوبيوت، الذي يمثل التفاعلات بين المضيفين والمجتمعات الميكروبية المرتبطة بها، كما هو الحال بين البشر وميكروبيوتا الأمعاء19،20. وعلاوة على ذلك، يعتبر البشر حتى الآن الكائنات الحية الفائقة21، حيث تم الاعتراف microbiota الأمعاء باعتبارها واحدة من الأجهزة الوظيفية في البشر22،23. ويستضيف جسم الإنسان نظامًا بيئيًا ميكروبيًا معقدًا، يتكون من حوالي 1013 خلية ميكروبية24. وعلاوة على ذلك، تعتبر الجينومات من ميكروبيوتا الأمعاء الجينوم اتّساعاً من البشر التي ترمز إلى العديد من الجينات المتعلقة بالأيض التي توسع قدرات المضيف الأيضية4. ومع ذلك، xenobiotics، بما في ذلك الأدوية العلاجية والمركبات النشطة بيولوجيا المستمدة من النظام الغذائي، يمكن أن تغير من المحتمل أن هيكل المجتمع ميكروبيوم الأمعاء والوظائف المرتبطة بها5. وقد أشارت أعداد متزايدة من الدراسات إلى أن التفاعلات بين ميكروبيوتا الأمعاء وxenobiotics تلعب أدوارا هامة في التوسط السمية الكيميائية والتسبب، أو تفاقم خلاف ذلك، الأمراض البشرية6،7. وهكذا، فإن التحقيقات في التفاعلات بين xenobiotics وميكروبيوتا الأمعاء البشرية قد حصلت مؤخرا على اهتمام بحثي كبير.
وكانت نماذج الماوس الأساليب الأكثر استخداما على نطاق واسع للتحقيق في التفاعلات بين microbiota والمضيفين. ومع ذلك، فإن الاختلافات في التكوين والأنشطة بين ميكروبيوتا الأمعاء من البشر والفئران25 قد يؤدي إلى النمذجة غير كافية من التفاعلات البشرية من خلال دراسات الفئران. ومع ذلك، تتطلب اعتبارات أخلاقيات البيولوجيا الحد الأدنى من استخدام الفئران. بديل ما سبق في نماذج الجسم الحي هو التخمير دفعة، والتي يمكن استخدامها لمحاكاة ميكروبيوتا الأمعاء البشرية في المختبر26. وبالتالي، تم استخدام تجارب التخمير للتحقيق في التفاعلات بين xenobiotics وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. على سبيل المثال، Yin وآخرون. 17 وقد استخدمت تجارب التخمير دفعة للتحقيق في التفاعلات بين السكريات وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. وتشير نتائج هذه الدراسة إلى أن بعض السكريات يمكن استقلابها بواسطة ميكروبيوتا الأمعاء البشرية، وأن السكريات تعدل المجتمع البكتيري البشري والأيض الذي تنتجه في المختبر، بما في ذلك SCFAs. غير أن بعض الاعتبارات المنهجية بالغة الأهمية لاستخدام هذا البروتوكول. فعلى سبيل المثال، ينبغي جمع عينات البراز في أقرب وقت ممكن، وينبغي استخدام غرفة لاهوائية لضمان نمو الأنيروبيات المعبأة. هذا الاعتبار الأخير أمر بالغ الأهمية، لأن التعرض للأكسجين يمكن أن يؤدي إلى وفاة بعض السكان البكتيرية الأمعاء وبالتالي، تغيير المجتمع البكتيري. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استقلاب xenobiotics في الجهاز الهضمي العلوي. وبالتالي، فإن نمذجة التفاعلات بين xenobiotics وميكروبيوتا الجهاز الهضمي السفلي هو اعتبار مهم للنمذجة في الجسم الحي.
تجارب التخمير دفعة لها مزايا واضحة أكثر في الدراسات البشرية والحيوانية في الجسم الحي لأنها أكثر جدوى من الناحية الاقتصادية ومريحة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها للتحقيق في الاختلاف بين الأفراد من استجابات ميكروبيوتا الأمعاء البشرية للتعرض xenobiotic. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق التخمير دفعة بسهولة للتعامل مع المجتمعات microbiota وتقييم وظائفها الأيضية المرتبطة بها. ومع ذلك، فإن أنظمة التخمير دفعة تعاني من الحد من ديناميات الحالة الثابتة. ويمكن للتحقيقات المستقبلية أن تنفذ الإحصاءات الكيميائية للمفاعلات الحيوية التي تسمح بالتشكيل الدينامي للحموضة ودرجة الحرارة والتمعج، مع الحفاظ على إمدادات ثابتة من المواد الغذائية والإزالة المستمرة للنفايات. ومن شأن هذه الأنشطة أن تسمح للتجارب بأن تحاكي بشكل أفضل في المسالك المعوية الحية وأن توفر رؤى جديدة لتكملة تلك المستمدة من تجارب التخمير على دفعات. وهناك قيود إضافية على تجارب التخمير دفعة هو أنها إزالة جميع التفاعلات الأنسجة ميكروبيوم المضيف. وهذا يمكن أن يكون اعتبارا هاما بشكل خاص، كما يمكن أن يكون بعض xenobiotics (على سبيل المثال، الميثامفيتامين) استقلاب مشترك من قبل الخلايا البشرية وميكروبيوتا الأمعاء27. وعلاوة على ذلك، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن الميتاجينوم الأمعاء (GM) يمكن أن تنظم بشكل غير مباشر التمثيل الغذائي xenobiotic عن طريق تنظيم تنظيم التعبير الجيني المضيف8.
على الرغم من أن التطورات في أنظمة التخمير دفعة لا تزال هناك حاجة، ويمكن استخدام هذه النظم على نطاق واسع لارتفاع الإنتاجية والفحص السريع للتفاعلات بين xenobiotics وميكروبيوتا الأمعاء البشرية. توضيح الآليات الكامنة وراء المقاومة xenobiotic والتمثيل الغذائي في microbiomes الأمعاء البشرية النشطة سوف توفر رؤى هامة في الاختلاف غير المبررة بين المريض إلى المريض في فعالية المخدرات والسمية8،9. وعلاوة على ذلك، فإن الفهم الأكثر تفصيلاً لكيفية تغيير الوجبات الغذائية والمكونات الغذائية المحددة للأيض الميكروبي وبالتالي التأثير على صحة المضيف هو الخطوة الأولى نحو تحقيق هدف الطب الشخصي عن طريق تعديل الكائنات الحية الدقيقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنهما لا يتعارضان في المصالح. وقد ذُكرت هذه الأرقام في Yin et al. 11.
Acknowledgments
تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم 31741109)، ومؤسسة هونان للعلوم الطبيعية (رقم 2018JJ3200)، وبرنامج بناء الانضباط المميز التطبيقي في جامعة هونان للعلوم والهندسة. نشكر ليتبوب (www.letpub.com) على مساعدتها اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
