Summary
여기서 설명된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다.
Abstract
인간의 장내 미생물은 최근 인간의 건강을 증진하고 질병을 예방하는 연구의 중요한 대상이되었습니다. 따라서, endobiotics 사이 상호 작용의 조사 (예를 들어, 마약과 prebiotics) 그리고 창 자 microbiota 중요 한 연구 주제가 되고있다. 그러나, 인간 자원 봉사자와 생체 내 실험은 생물 윤리 및 경제적 제약으로 인해 이러한 연구에 이상적이지 않습니다. 그 결과, 동물 모델은 생체 내에서 이러한 상호작용을 평가하는 데 사용되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 동물 모델 연구는 여전히 생물 윤리 고려에 의해 제한 됩니다., 동물 대 인간에서 microbiota의 다른 조성및 다양 성 뿐만 아니라. 대체 연구 전략은 시험관내 내생생물학과 장내 미생물 간의 상호 작용을 평가할 수 있는 일괄 발효 실험의 사용입니다. 이러한 전략을 평가하기 위해, 비피도박테리아(Bif) 외다당류(EPS)를 대표적인 제노바이오틱으로 사용하였다. 그 후, Bif EPS와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은 16S rRNA 유전자고 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피와 같은 얇은 층 크로마토그래피(TLC), 세균 공동체 조성 분석과 같은 여러 가지 방법을 사용하여 조사되었습니다. 짧은 사슬 지방산 (SCFA)의. 여기에 제시된 프로토콜은 시험관 내 배치 발효 시스템을 사용하여 내생생물학과 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 프로토콜이다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 또한 다른 endobiotics와 창 자 microbiota 사이 일반적인 상호 작용을 조사 하기 위해 수정될 수 있습니다.
Introduction
창자 미생물은 인간의 창자 기능과 숙주 건강에 중요한 역할을 합니다. 따라서, 창자 미생물은 최근 질병 예방 및 치료1의중요한 표적이되었습니다. 또한, 창 자 박테리아 호스트 장 세포와 상호 작용 하 고 기본적인 호스트 프로세스를 조절, 신진 대사 활동을포함 하 여, 영양소 가용성, 면역 체계 변조, 심지어 뇌 기능 및 의사 결정 2,3 . Endobiotics 세균 성 구성 및 창 자 microbiota의 다양성에 영향을 미칠 상당한 잠재력을 가지고. 따라서, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용은4,5,6,7,8,9.
생체 윤리 및 경제적 제약으로 인해 생체 내 내 생물 학 및 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 평가 하기 어렵다. 예를 들어, 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호작용을 조사하는 실험은 식품의약품안전청의 허가 없이는 수행할 수 없으며, 자원봉사자 모집은 비용이 많이 듭니다. 따라서 동물 모델은 종종 그러한 조사에 사용됩니다. 그러나, 동물 모델의 사용은 동물-대 인간 관련 지역 사회에서 상이한 미생물 조성물 및 다양성으로 인해 제한된다. 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 탐구하는 대안체외 방법은 배치 배양 실험을 통해서이다.
외다당류(EPS)는 인간의 건강 유지에 크게 기여하는 프리바이오틱스(EPS)(10)이다. 상이한 단당류 조성물 및 구조로 구성된 뚜렷한 EPS는 뚜렷한 기능을 나타낼 수 있다. 이전 분석은 Bif EPS의 조성을 결정하였는데, 이는 현재 연구11에서표적화된 대표적인 xenobiotic이다. 그러나, 호스트 관련 신진 대사 효과 EPS 조성 및 다양성에 관한 고려 되지 않은.
여기에 설명된 프로토콜은 12명의 자원봉사자들로부터 Bif EPS를 발효시키기 위해 배설물 미생물을 사용합니다. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 16S rRNA 유전자 높은 처리량 시퀀싱 및 가스 크로마토그래피 (GC)는 EPS와 인간 장 내 미생물 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 조합하여 사용됩니다. 생체 내 실험에 비해이 프로토콜의 뚜렷한 장점은 그것의 낮은 비용과 호스트의 신진 대사에서 방해 효과의 회피. 또한, 설명된 프로토콜은 내생작용제와 인간 장내 미생물 간의 상호 작용을 조사하는 다른 연구에서 사용될 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜은 후난 과학 공학 대학 (후난, 중국) 및 절강 공샹 대학 (절강, 중국)의 윤리위원회의 지침을 따릅니다.
1. 박테리아의 준비
- 비피도박테리움 배지 국물의 제조
- 950 mL의 증류수에 다음 구성 요소를 결합하십시오 : 고기 추출물, 5 g / L; 효모 추출물, 5 g / L; 카제인 펩톤, 10 g/L; 콩톤, 5 g / L; 포도당, 10 g/L; K2HPO4,2.04 g/L; MgSO4·7H 2O, 0.22 g/L; MnSO4. H20, 0.05 g/L; NaCl, 5 g/L; 트웬 80, 1 mL; 소금 용액, 40 mL (CaCl2.2H2O, 0.25 g / L; KH2PO4,1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); 및 resazurin, 0.4 mL (2.5 mg /L). 2 M NaOH로 pH를 6.8로 조정합니다.
- 121°C에서 15분간 오토클레이브하고 국물을 혐기성 조건하에서 실온(RT)으로 냉각시키십시오(10% H2,10% CO2, 80% N 2). 필터 멸균 시스테인-HCl (0.5 g/L) 및 무크로신 (5 mg/L)을 배지에 추가합니다.
- 혐기성 조건 하에서 5 mL의 비피도박테리움 배지 국물을 배양튜브에 냉동 비피도박테리움 롱룸의 aliquot(50 μL)를 첨가한 다음, 37°C에서 24시간 동안 혐기성 인큐베이터에서 배양한다.
2. 비피도박테리아 EPS 의 준비
- PYG 한천 배지의 준비
- 다음을 결합: 펩톤, 20 g/L; 효모 추출물, 10 g / L; 포도당, 5 g/L; NaCl, 0.08 g/L; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4·7H 2O, 0.008 g/L; K2HPO4, 0.04 g/L; KH2PO4,0.04 g/L; NaHCO3, 0.4 g/L; 한천, 12 g/L. 10 M NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
- 121°C에서 15분간 용지를 오토클레이브하고 ~50°C까지 냉각시. 그런 다음 배지 1L당 0.5 mL의 필터 멸균 비타민 K1 용액(99% 에탄올 99mL에 용해된 비타민 K1 1 개), 해민 용액 5 mL (1 mol /L NaOH 1 mL에 용해 된 해민 0.5 g)을 추가하십시오. , 증류수로 100 mL까지 키우고, 0.5 g의 시스테인-HCl을 키웠다.
- PYG 플레이트를 붓기 전에 필터 멸균 된 5-브로모-4 클로로-3-β-D-galactopyraside (X-Gal, 0.06 g /L), LiCl·3H2O (5.7 g/L) 및 무피로신 (5 mg/L)을 배지에 추가하십시오.
참고 : X-Gal 및 LiCl.3H2O는 착색 변화를 통해 플레이트에 B. longum 식민지를 식별 할 수 있습니다.
- B. longum 균주의 20 μL을 PYG 플레이트에 접종하고 72 시간 동안 37 °C에서 혐기성 인큐베이터에 놓습니다.
- 계량 스쿱을 사용하여 PYG 플레이트에서 점막 세균 콜로니를 수집한 다음 와류 발진기를 사용하여 인산완충 식염수(PBS)의 10mL에서 완전히 다시 중단합니다.
참고: 섬유가 PBS에 완전히 용해될 때까지 세균 및 EPS 혼합물을 소용돌이 또는 위아래로 반복적으로 반복하여 완전히 다시 매달아야 합니다. - 서스펜션을 6,000 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 조심스럽게 새로운 원심 분리튜브에 초자연자를 옮기고 반복적인 반전과 블렌딩으로 3부량의 차가운 99% 에탄올과 완전히 섞어보십시오.
- 혼합물을 6,000 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 초자연자를 완전히 제거하십시오.
- 속도 진공을 사용하여 하룻밤 동안 EPS 추출물을 긁어 내고 건조시킴으로써 원심분리관에서 침전물을 제거한다.
3. 발효매체의 준비
- 기본 배양 배지 VI의 준비
- 다음을 결합: 펩톤, 3 g/L; 트립톤, 3 g/L; 효모 추출물, 4.5 g/L; 뮤신, 0.5 g/L; 담즙 염 제 3, 0.4 g/ L; NaCl, 4.5 g/L; KCl, 2.5 g/L; MgCl2·6H 2O, 4.5 g/L; 1 mL 트웬 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/L; KH2PO4,0.4 g/L; MgSO4·7H 2O, 3.0 g/L; MnCl2·4H 2O, 0.32 g/L; FeSO4·7H2O, 0.1 g/L; CoSO4·7H 2O, 0.18 g/L; CaCl2·2H 2O, 0.1 g/L; ZnSO4·7H 2O, 0.18 g/L; CuSO4·5H 2O, 0.01 g/L; NiCl2·6H 2O, 0.092 g/L. 1 M HCl으로 pH를 6.5로 조정합니다.
- 섹션 2.1에서 와 같이 해민과 시스테인을 준비하고 오토클레이브 및 냉각 후 추가합니다.
- VI 베이스 미디어를 통해 다양한 탄소 원을 포함하는 배양 배지를 준비합니다. 오토클레이브에 앞서, 비프 EPS 섬유 8 g/L을 중간 VI에 첨가하고, VI_Bif 군으로 구성된다. 또한 중간 VI에 8 g/L 전분을 추가하여 그룹 VI_Starch를 나타냅니다. 마지막으로, 탄소 원을 첨가하지 않고 중간 VI가 대조군(group VI)으로 사용된다.
참고: Bif EPS 및 전분은 먼저 자기 교반기를 사용하여 뜨거운 물에 용해된 다음 준비된 VI 배지와 혼합합니다. - 121 °C에서 모든 매체를 15분 동안 오토클레이브하고 RT로 냉각시.
- 혐기성 인큐베이터에서 배양 튜브에 각 배지의 하위 샘플(5 mL)을 옮기고, 나머지 배지를 4°C에 저장한다.
4. 인간 배설물 샘플 준비
- 대변 용기를 사용하여 건강한 성인 인간 자원 봉사자로부터 신선한 배변 직후 신선한 배설물을 수집하고 슬러리 준비에 사용합니다.
참고: 샘플 수집 전에, 모든 자원 봉사자는 샘플을 기증하기 전에 적어도 3 개월 동안 항생제, 프로바이오틱스 또는 프리바이오틱 치료를 받지 않도록 선별해야 합니다. 또한 모든 기부자는 통보된 서면 동의를 제공해야 합니다. - 신선한 배설물 샘플(1g)을 0.1 M 혐기성 PBS(pH 7.0)의 10 mL로 유리 비커에 옮긴 다음 유리 막대를 사용하여 10% (w/v) 슬러리를 준비합니다.
- 0.4 mM 체를 사용하여 배설물 슬러리를 필터링하십시오. 이어서, 여과된 슬러리의 서브샘플을 사용하여 배치 배양 발효 실험을 접종하고, 추가 분석을 위해 나머지를 -80°C에 저장한다.
참고 : 단계 4.2-4.3 혐기성 챔버에서 수행됩니다.
5. 시험관 내 배치 발효
- 여과된 배설물 슬러리(500 μL)를 혐기성 챔버 내에서 단계 3.2에서 제조된 발효 배지에 첨가한 다음 37°C에서 배양합니다.
- 혐기성 챔버에서 24 시간 및 48 h에서 발효 샘플 2 mL을 수집 한 다음 챔버 외부의 원심 분리기를 6,000 x g에서 3 분 동안 수집합니다.
- 다당류 분해 분석 및 단쇄 지방산(SCFA) 측정에 사용될 새로운 원심분리관으로 조심스럽게 주축을 옮긴다.
- 원심분리 펠릿을 -80°C에 저장하고 이어서 세균게놈 DNA 추출에 사용한다.
6. 인간 배설물 미생물에 의한 EPS 저하
- 미리 코팅된 실리카 젤-60 TLC 알루미늄 플레이트에 0.2 μL의 발효 된 과식제를 적재한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.
- 포름산/n-부탄올/물(6:4:1, v:v:v) 용액의 20 mL로 플레이트를 개발하고 헤어 드라이어를 사용하여 건조시십시오.
- 오크시놀 시약에 접시를 담그고 염색한 다음 헤어 드라이어를 사용하여 건조시다.
- 25 mL의 증류수에 900 mg의 리세놀을 용해한 다음 375 mL의 에탄올을 추가하여 오시놀 시약을 준비하십시오. 그 후, 농축 된 황산을 천천히 첨가하고 용액을 철저히 혼합해야합니다.
- 베이킹 오븐에서 120°C에서 3분 동안 열판을 가열하고 TLC 밴드를 측정하여 EPS의 열화를 평가합니다.
7. 인간의 장 내 미생물에 EPS의 효과
- 4.3단계에서 제조된 본래 배설물 샘플을 동결해 및 5.4단계에서 제조된 발효 시료.
- 대변 세균 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 모든 샘플에서 세균 게놈 DNA(gDNA)를 추출하여 제조업체의 지시에 따른 다.
- 미세 분광광도계 및 한천 겔 전기 영동을 사용하여 DNA 농도, 통합및 크기 분포를 결정합니다.
- 앞서 설명한 다음을 사용하여 추출된 gDNA로부터 세균 16S rRNA 유전자의 PCR을 진행한다12:
-포워드 프라이머(바코드 프라이머 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-리버스 프라이머 (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
다음 열 사이클러 조건을 사용합니다.- 94 °C에서 5 분.
- 30s에 대한 94 °C.
- 30s에 대한 55 °C.
- 72 °C에서 1 분.
- 35주기 동안 2-4 반복
- 72 °C에서 5 분.
- 열 사이클러에서 제거 될 때까지 4 °C 를 유지하십시오.
- 초고처리량 미생물 커뮤니티 분석을 사용하여 DNA 시퀀싱 회사에서 PCR 제품의 고처리량 시퀀싱을 수행합니다.
- 미생물 생태학(QIIME) 서열 분석파이프라인(13)에대한 정량적 통찰력을 사용하여 깨끗하고 고품질의 시퀀스를 구한다.
- Mothur 소프트웨어 제품군14와같은 생물정보학 도구를 사용하여 97% 이상의 뉴클레오티드 유사성을 가진 16S rRNA 유전자 서열에 대한 운영 분류학 단위(OTUs)를 정의한다.
- 각 OTU에서 대표 시퀀스를 선택하고 SILVA 분류 데이터베이스와 함께 RDP 분류기를 사용하여 대표 서열15를분류합니다.
- 생물정보학도구를사용하여 Good의 커버리지, 알파 다이버시티 메트릭(심슨 및 섀넌 지수 포함) 및 풍부성(OTUs 관찰 수)을 계산합니다.
8. 인간의 장 내 미생물에 의해 SCFA 생산에 EPS의 효과
- 5.3~2 mL 원심분리기 튜브에서 제조된 발효 상피제(1 mL)를 첨가한다.
- 각 시료에 25%(v)의 메타포스포릭산을 0.2 mL 추가하고 와류를 통해 솔루션을 철저히 혼합합니다.
- 혼합물을 13,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리하고 슈퍼 나탄제를 신선한 튜브로 옮니다.
- 이와 함께, 120 mM 아세틱, 프로피온, 부티릭, 이소부티릭, 발레릭 및 이소발레르산의 용액을 준비합니다. 그런 다음, 준비된 각 산의 1 mL을 25% (v) 메타포스포릭산의 1.2 mL에 넣고 표준 칵테일로 사용하십시오.
- 0.22 μM 멤브레인을 사용하여 샘플을 필터링합니다.
- 앞서 설명한 프로토콜11,17에따라 고성능 가스 크로마토그래피를 사용하여 SCFA 농도를 검출합니다.
참고: 불활성캡 FFAP 컬럼(0.25mM x 30m x 0.25 μM)은 가스 크로마토그래피(GC)에 사용됩니다. 그런 다음 GC 솔루션 소프트웨어 패키지의 단일 지점 내부 표준 방법을 사용하여 피크 영역을 기준으로 SCFA 농도를 정량화합니다.
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Representative Results
점막 EPS의 생산은 72 시간 동안 혐기성 배양 후 PYG 플레이트에 대한 B. longum 배양물에서 관찰 될 수있다 (도1A). 배양 스크레이프의 원심분리, 에탄올 침전 및 건조에 이어, 셀룰로오스유사 EPS의수집을 초래하였다(도 1B). 건조된 EPS 및 수용성 전분은 발효 배양용 탄소 공급원으로 사용되었습니다. TLC는 낮은 비용과 신속한 결과 턴어라운드로 인해 올리고당 분리 및 순도 분석에 사용되었다18. 인간 배설물 미생물에 의한 전분의 분해 속도는 Bif EPS(그림2)보다 빠르지만, 일부 EPS 접종 샘플에 대해 Bif EPS 분해가 명확하게 관찰되었다.
16S rRNA 유전자를 통한 커뮤니티 조성 분석 고처리량 시퀀싱 및 주요 좌표 분석(PCoA)을 통해 Bif EPS가 인간 장내 미생물에 미치는 영향을 조사하기 위해 수행하였다. VI_Bif 및 VI_Starch 그룹에서의 샘플은 PCoA 분석(그림3A)에서서로 별도로 군집화되어, EPS 및 전분 가용성이 인간 배설물 세균 군집을 차별화하여 형성한다는 것을 나타낸다. 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe)는 VI_Bif 및 VI_Starch 치료 간에 다른 특정 세균 성 세금을 구별하기 위해 추가로 사용되었다. 제네라 콜린셀라, 코로코커스, 파라박테로이드및 로도세도모나스는 VI_Starch 샘플에서보다 VI_Bif 샘플에서 훨씬 더 풍부하였다(그림3B). 또한, GC 측정은 다른 탄소 원천의 추가 에 따라 그들의 생산을 평가하기 위하여 몇몇 SCfA를 위해 만들어졌습니다. 발효 배양물에서 측정된 SCFA에는 아세트, 프로피온, 이소부티릭, 부티릭, 이소발릭 및 발릭산이 포함되었다. 24 시간 및 48 h에 대한 발효 후, 앞서 언급 한 6 개의 SCFA 농도 중 5 개는 치료 중 유사했으며 VI_Bif, VI_Starch 및 VI 그룹 간에 통계적으로 다르지 않았습니다. 그러나, 프로피온산 농도는 VI_Starch 군보다 VI_Bif 군에서 유의히 높았다(그림 4).
그림 1: B. 롱움이 생산한 EPS.
냉동 B. 롱룸은 비피도박테리움 배지 국물에서 복원한 다음 PYG 플레이트상에 줄무늬를 내고, 37°C에서 72시간(A)에 혐기성 인큐베이션을 하였다. 세균 배양에 의해 생성된 EPS는 플레이트 배양물로부터 긁어내고, 에탄올을 사용하여 침전시키고, 속도 진공(B)을 이용하여 하룻밤 동안 건조시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 인체 내 EPS 및 인간 장내 미생물에 의한 전분 분해에 대한 TLC 분석.
TLC 분석은 혐기성 조건하에서 재배된 각 발효 배양물로부터 24시간 및 48시간에서 수집된 0.2 μL 샘플에 대해 수행되었다. VI, VI_Starch 및 VI_Bif는 VI 미디어, VI 미디어 + 전분 보충제 및 VI 미디어 + EPS 보충제를 각각 나타낸다. 숫자 1-12는 발효 실험을 접종하는 데 사용 된 12 명의 자원 봉사자로부터 배설물 세균 샘플을 나타냅니다. 대조군은 추가탄소 보충제 없이 치료를 나타낸다. 이 그림은 Yin 외에서 수정됩니다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 인간의 창 자 microbiota 지역 사회에 Bif EPS 가용성의 효과.
(A) PCoA 플롯의 장내 미생물 군비체 공동체 조성 비유사성은 비가중치 있는 UniFrac 메트릭에 기초한다. (B) 치료군 들 사이에서 분별적으로 풍부했던 세균성 택시의 LEfSE 분석. p< 0.05의 컷오프는 그룹 간의 세균 분류학적 차이의 통계적 유의성을 평가하기 위해 사용되었다. 오리는 자원 봉사 배설물 샘플의 창자 미생물을 나타냅니다. VI_Bif 및 VI_Starch는 각각 EPS와 전분을 탄소 기판으로 사용하는 VI 매체를 사용하여 발효 샘플에서 장내 미생물을 나타냅니다. VI는 다른 탄수화물을 보충하지 않고 VI 매체에 있는 창자 microbiota 접종 발효를 가진 대조군을 나타냅니다. 이 그림은 Yin 외에서 수정됩니다. 11세 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 발효 24시간 및 48시간 후 SCFA 생산에 대한 EPS 가용성의 영향.
아세트, 프로피온, 이소부티릭, 부티릭, 이소발릭 및 발릭산은 가스 크로마토그래피를 사용하여 검출되었다. VI_Bif, VI_Starch, 및 VI는 각각 VI 매체+ EPS, VI 미디어+ 전분 및 VI 미디어를 사용하여 재배 후 수집된 샘플을 나타낸다. 모든 시료를 삼중으로 측정하였다. 이 수치는 그래프패드 프리즘 버전 5.01을 사용하여 생성되었습니다. 패널은 A, 아세트산에 대한 각 발효 샘플 내에서 유기산 농도를 나타냅니다. B, 프로피온산; C, 이소부티르산; D, 부티르산; E, 이소발레산; 그리고 F, 발레산. 이 그림은 Yin 등에서 수정되었습니다.11이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 10년 동안 인간의 장내 미생물 구성과 활동을 이해하는 데 상당한 진전이 있었습니다. 이러한 연구의 결과로, 홀로비오온 개념은 인간과 그들의 창자 microbiota 사이와 같은 호스트와 관련미생물 군사회사이 상호 작용을 나타내는 19,20. 더욱이, 인간은 지금도 초고생물(21)으로 여겨지고 있으며, 여기서 장내 미생물은 인간22,23에서기능성 기관 중 하나로 인식되고 있다. 인체는 약 10 개의13 미생물 세포(24)로구성된 복잡한 미생물 생태계를 호스팅합니다. 더욱이, 장내 미생물의 게놈은 호스트의 대사 능력을 확장하는 수많은 대사 관련 유전자를 인코딩하는인간으로부터의 보조 게놈으로 간주된다 4. 그러나, 치료 약물 및 다이어트 유래 생리 활성 화합물을 포함하는 xenobiotics는 잠재적으로 창자 미생물군유전체 공동체 구조 및 관련 기능을 변경할 수 있다5. 연구의 증가 숫자는 창 자 microbiota와 xenobiotics 사이 상호 작용 화학 독성을 중재 하 고원인, 또는 그렇지 않으면 악화에 중요 한 역할을 나타냅니다 6,7. 따라서, xenobiotics와 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용의 조사는 최근 중요 한 연구 관심을 얻고 있다.
마우스 모형은 microbiota와 호스트 사이 상호 작용을 조사하기 위하여 가장 널리 이용된 방법이었습니다. 그러나, 인간과 마우스의 창 자 microbiota 사이의 구성 및 활동에 차이25 쥐의 연구를 통해 인간의 상호 작용의 부적 당 모델링 귀 착될 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 생물 윤리 고려 쥐의 최소한의 사용을 필요 합니다. 생체 내 에서 모델의 대안은 배치 발효이며, 이는 시험관 내 의 인간 장내 미생물을 시뮬레이션하는 데 사용될 수있다 26. 따라서, 발효 실험 은 xenobiotics와 인간의 창 자 microbiota 사이의 상호 작용을 조사 하는 데 사용 되었습니다. 예를 들어, Yin 외. 17 다당류와 인간의 장내 미생물 간의 상호 작용을 조사하기 위해 배치 발효 실험을 사용했습니다. 이 연구 결과는 몇몇 다당류가 인간 적인 창자 microbiota에 의해 물질 대사될 수 있다는 것을 표시하고, 다당류는 인간 세균성 지역 사회를 조절하고 시험관에서 생성하는 대사 산물, SCFA를 포함하여. 그러나 이 프로토콜을 사용하기 위해 몇 가지 방법론적 고려 사항이 중요합니다. 예를 들어, 배설물 샘플은 가능한 한 빨리 수집되어야하며 혐기성 챔버는 의무 혐기성의 성장을 보장하기 위해 사용되어야합니다. 후자의 고려는 산소 노출이 몇몇 창자 세균성 인구의 죽음으로 이끌어 낼 수 있고 따라서, 세균성 지역 사회의 변경으로 이끌어 낼 수 있기 때문에, 특히 중요합니다. 또한, xenobiotics는 상부 소화 시스템에서 대사됩니다. 따라서, xenobiotics와 낮은 소화 시스템 microbiota 사이의 상호 작용을 모델링 하는 것은 생체 내 모델링에 대 한 중요 한 고려 사항.
배치 발효 실험은 보다 경제적으로 실현 가능하고 편리하기 때문에 생체 내 인간 및 동물 연구에 비해 명확한 이점이 있습니다. 더욱이, 그(것)들은 xenobiotic 노출에 인간 적인 창자 microbiota 반응의 개별적인 변이를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 더욱이, 배치 발효는 microbiota 지역 사회를 조작하고 그들의 관련신진 대사 기능을 평가하기 위하여 쉽게 적용될 수 있습니다. 그러나 배치 발효 시스템은 정적 상태 역학의 한계를 겪습니다. 향후 조사는 영양분의 꾸준한 공급과 폐기물의 지속적인 제거를 유지하면서, pH, 온도 및 연동의 동적 변조를 허용하는 생물 반응기 chemostats를 구현할 수 있습니다. 이러한 활동을 통해 실험은 생체 내 장관을 더 잘 모방하고 배치 발효 실험을 보완하는 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 배치 발효 실험의 추가 제한은 모든 미생물군유전체 숙주 조직 상호작용을 제거한다는 것입니다. 이것은 특히 중요한 고려사항일 수 있고, 일부 제노바이오틱스(예를 들어, 메담페타민)는 인간 세포 및 장내 미생물에 의해 공동 대사될 수 있다27. 더욱이, 최근 연구에 따르면 장성 메타게놈(GM)은 숙주 유전자 발현 조절을 통해간접적으로 xenobiotic 대사를 조절할 수 있는 8.
배치 발효 시스템의 개발은 여전히 필요하지만, 이러한 시스템은 널리 xenobiotics와 인간의 창자 microbiota 사이의 상호 작용의 높은 처리량과 빠른 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 활성 인간 장내 미생물군유전체에서 의기양양한 내성 및 대사의 근본적인 메커니즘을 해명하면 약물 효능 및독성의 설명할 수 없는 환자 대 환자 변화에 대한 중요한 통찰력을 제공할 것이다 8,9. 또한, 식이 요법과 특정 식품 성분이 미생물 대사를 어떻게 변화시키고 결과적으로 숙주 건강에 미치는 영향에 대한 보다 상세한 이해는 미생물 변조를 통해 맞춤화된 의학의 목표를 실현하는 첫 번째 단계입니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다. 수치는 Yin 외에서 인용되었다. 11.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립자연과학재단(31741109호), 후난자연과학재단(2018JJ3200호), 후난대학교 과학공학부 에서 의뢰한 특성분야 조성 프로그램이다. 이 원고를 준비하는 동안 LetPub (www.letpub.com)의 언어 적 지원에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
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